本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种nk细胞的培养方法。
背景技术：
细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术，是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。治疗性的细胞包括：nk、γδt、cd3ak、dc-cik等，其疗效、特异性、整体有效率、副作用反应等方面的情况逐步改善。
nk细胞(naturalkillercell)也称自然杀伤细胞，属于淋巴细胞谱系细胞，含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒淋巴细胞，对靶细胞的识别无mhc(主要组织相容性复合体，majorhistocompatibilitycomplex)限制，是重要的机体免疫细胞。nk细胞来源于骨髓，属于淋巴细胞谱系的大颗粒淋巴细胞，其占外周血淋巴细胞总数的5～10％，无特异性识别，不需经过抗原呈递及可直接杀伤肿瘤细胞，并且能分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能，在肿瘤治疗、抗病毒感染和清除异己细胞中有着重要的作用。
nk细胞在癌症肿瘤治疗方面取得了较大进展，主要是采取与手术、放化疗相结合的治疗方式，与传统单纯的放化疗相比，结合nk细胞的治疗，增强了患者的免疫功能或直接杀死肿瘤细胞和病毒感染的细胞，这样辅助因放化疗造成身体虚弱、抵抗力低而造成的二次伤害、容易感染生病等。而且细胞治疗可以有效抑制肿瘤细胞的转移扩散，并且没有副作用。
nk细胞是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线，是机体重要的免疫细胞。活化的nk细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。目前，nk细胞已经广泛运用于临床进行肿瘤患者的治疗，同时，nk细胞治疗对病毒或细菌感染、免疫调节相关疾病以及抗衰老也有一定的疗效。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前，主要采用单纯的抗原递呈细胞与nk细胞共同培养的方法，来促进nk细胞的增殖。而这种采用单纯的细胞生长因子刺激nk细胞扩增的方法扩增得到的nk细胞纯度低，杀伤活力低；
目前，体外促进nk细胞的方法有很多，有在培养体系中加入动物血清进行培养，也有研究者将k562细胞通过基因修饰后经过辐照，然后作为饲养层细胞在体外刺激nk细胞的生长。上述方法虽然能够刺激nk细胞高效扩增，但是动物血清成分复杂，取材过程中有可能带入支原体、病毒，对nk细胞培养造成不确定性以及不安全性；k562本身作为一个肿瘤细胞，在临床安全性方面存在很大的质疑，不适用于临床nk细胞治疗；对培养的细胞缺乏正确的评定。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种nk细胞的培养方法。
本发明是这样实现的，一种nk细胞的培养方法，所述nk细胞的培养方法包括以下步骤：
将外周血进行分离，得到pbmc细胞；备用；
将常规培养的k562细胞接种于含10％～15％dmem培养基中在36℃～37℃，6％～12％co2培养箱中孵育至少15h～20h，使之完全贴壁80％后备用；先用无血清培基洗涤备用的k562细胞；
接着更换无血清的dmem培养液同步化8h～16h，然后加入2μmol/l～2.5μmol/lpbmc，置于36℃～37℃，10％～15％dmem培养基培养箱中孵育60h～72h，从培养箱中取出，弃培养上清液，接着用0.01mol/l～0.05mol/lpbs溶液洗涤3次～6次，
然后采用基础培养基重悬，加入il-2、il-15，进行细胞培养，每隔3天补液一次，培养至第6～8天时加入k562细胞，培养16～18天获得nk细胞；
接种造模：用培养好的nk细胞接种于k562大鼠模型组；将nk细胞液0.05ml～0.1ml连续接种60天；分析大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现。
进一步，接种造模后还需进行rna微阵列基因检测：60天后，将接种后的k562大鼠模型组大鼠处死，骨髓被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作；用mirvanamicrornaisolationkit按照说明书收集总rna；取适量rna溶液，经紫外分光光度计定量测定rna样品od260和od280值。
进一步，再计算rna浓度，1％琼脂糖电泳观察总rna，取3μg～6μg用microconcentrifugalfilter微离心过滤柱过滤，得到片段小于300个的小rna；应用poly聚合酶将小rna的3’端加上poly(a)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，用于后续的荧光标记，完成μparaflotmmicrorna微阵列基因.
进一步，rna微阵列基因检测后还进行表达实验和分析：通过微循环泵杂交仪器在μparaflotm微流体芯片上过夜，使用含甲酸胺sspe缓冲液进行杂交，漂洗甩干，用激光扫描仪采集杂交图象，array--pro软件对杂交图像进行数字化转换、数据处理和分析，计算两组检测到信号的比值和t检验的p值，以p<0.01定义为信号有显著差异性，分析差异表达的位点，大鼠微阵列芯片包括454个microrna，包含数据库中成熟的microrna和部分成熟microrna的互补链；芯片上的检测探针均进行27个重复，实验进行6次。
进一步，表达实验和分析后还需进行：
实时荧光定量pcr检测：用mirvanamicrornaisolationkit按照说明书收集总rna，计算rna浓度；特异逆转录引物从taqmanmicrornaassays获得，并用taqmanmicrornareversetranscriptionkit将rna反转录为cdna进行实时荧光定量pcr检测，反应结束后用abiprism7900软件分析结果，pcr实验进行6次，用比较阈值循环方法分析数据，得到ct值，即荧光达到阈值所需的pcr循环数，并分析基因相对表达量。
进一步，实时荧光定量pcr检测后需进行生物信息学预测：应用miranda、targetscan和pictar3个生物信息学靶基因预测软件，对microrna芯片结果中挑选出来的microrna的靶基因做出预测。
进一步，生物信息学预测后需进行统计学处理：根据资料的性质、分布和设计特点，应用spss13.0统计软件对数据进行分析。
进一步，用激光扫描仪采集杂交图象方法包括：
对k562大鼠模型进行超声探查所用探头为l15-7io浅表探头，对骨髓异常回声记录，并测量大小后采集图像；
对构建的k562大鼠模型进行microct增强扫描，microct采用的造影剂为fenestralc，造影剂用量为0.4ml/20g，每次扫描采取的增强方式：注入造影剂后4小时进行扫描；
对构建的k562大鼠模型进行磁共振骨髓横断位及冠状位扫查，扫描序列：t2wi横断面及冠状位。
本发明提供的nk细胞培养基安全性较好，在上述组分的培养基下培养的nk细胞快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。实验结果表明：本发明提供的nk细胞培养基培养nk细胞两周后，增殖倍数将近翻了50倍；对k562的杀伤活性在40:1的效靶比时达到了92％。
本发明采用自体血清来促进细胞的增殖，避免了外源性蛋白及病毒的污染；本发明只需较低剂量的il-2，大大降低了生产成本；本发明培养方法培养出来的nk细胞纯度较高。
本发明通过分组实验揭示了分子水平上病毒感染本质的部分科学内涵。证明了证候的宏观表型与微观生物分子之间的复杂关系。
本发明之构建方法具有操作简单，成本低的特点，细胞模型稳定性高、自噬活性高，并具有高自噬活性导致的化疗药物耐受性，有助于在体外分析；可实验证明，通过本发明建立的细胞模型具有稳定96小时以上的抵抗性。模型组出现活动度明显减少、体毛凌乱；体重减轻。
本发明提供的动物模型，首次对不同感染生物学特性进行对比分析，发现高低不同癌株及高低不同转移结节之间生物学特性指标表达有统计学差异；首次对高、低不同转移特性的癌株的影像进行分析；首次对多种pet成像进行最佳组合，充分反映了感染发生生物学特性，为早期诊断提供新方法。
本发明具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对诊断具有重要的临床意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的nk细胞的培养方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供的nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
s101:将外周血进行分离，得到pbmc细胞；备用；
s102:将常规培养的k562细胞接种于含10％～15％dmem培养基中在36℃～37℃，6％～12％co2培养箱中孵育至少15h～20h，使之完全贴壁80％后备用；先用无血清培基洗涤备用的k562细胞；
s103:接着更换无血清的dmem培养液同步化8h～16h，然后加入2μmol/l～2.5μmol/lpbmc，置于36℃～37℃，10％～15％dmem培养基培养箱中孵育60h～72h，从培养箱中取出，弃培养上清液，接着用0.01mol/l～0.05mol/lpbs溶液洗涤3次～6次；
s104:然后采用基础培养基重悬，加入il-2、il-15，进行细胞培养，每隔3天补液一次，培养至第6～8天时加入k562细胞，培养16～18天获得nk细胞；
s105:接种造模：用培养好的nk细胞接种于k562大鼠模型组；将nk细胞液0.05ml～0.1ml连续接种60天；分析大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现。
接种造模后还需进行rna微阵列基因检测：60天后，将接种后的k562大鼠模型组大鼠处死，骨髓被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作；用mirvanamicrornaisolationkit按照说明书收集总rna；取适量rna溶液，经紫外分光光度计定量测定rna样品od260和od280值。
再计算rna浓度，1％琼脂糖电泳观察总rna，取3μg～6μg用microconcentrifugalfilter微离心过滤柱过滤，得到片段小于300个的小rna；应用poly聚合酶将小rna的3’端加上poly(a)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，用于后续的荧光标记，完成μparaflotmmicrorna微阵列基因.
rna微阵列基因检测后还进行表达实验和分析：通过微循环泵杂交仪器在μparaflotm微流体芯片上过夜，使用含甲酸胺sspe缓冲液进行杂交，漂洗甩干，用激光扫描仪采集杂交图象，array--pro软件对杂交图像进行数字化转换、数据处理和分析，计算两组检测到信号的比值和t检验的p值，以p<0.01定义为信号有显著差异性，分析差异表达的位点，大鼠微阵列芯片包括454个microrna，包含数据库中成熟的microrna和部分成熟microrna的互补链；芯片上的检测探针均进行27个重复，实验进行6次。
表达实验和分析后还需进行：
实时荧光定量pcr检测：用mirvanamicrornaisolationkit按照说明书收集总rna，计算rna浓度；特异逆转录引物从taqmanmicrornaassays获得，并用taqmanmicrornareversetranscriptionkit将rna反转录为cdna进行实时荧光定量pcr检测，反应结束后用abiprism7900软件分析结果，pcr实验进行6次，用比较阈值循环方法分析数据，得到ct值，即荧光达到阈值所需的pcr循环数，并分析基因相对表达量。
实时荧光定量pcr检测后需进行生物信息学预测：应用miranda、targetscan和pictar3个生物信息学靶基因预测软件，对microrna芯片结果中挑选出来的microrna的靶基因做出预测。
生物信息学预测后需进行统计学处理：根据资料的性质、分布和设计特点，应用spss13.0统计软件对数据进行分析。
用激光扫描仪采集杂交图象方法包括：
对k562大鼠模型进行超声探查所用探头为l15-7io浅表探头，对骨髓异常回声记录，并测量大小后采集图像；
对构建的k562大鼠模型进行microct增强扫描，microct采用的造影剂为fenestralc，造影剂用量为0.4ml/20g，每次扫描采取的增强方式：注入造影剂后4小时进行扫描；
对构建的k562大鼠模型进行磁共振骨髓横断位及冠状位扫查，扫描序列：t2wi横断面及冠状位。
本发明提供的nk细胞培养基安全性较好，在上述组分的培养基下培养的nk细胞快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。实验结果表明：本发明提供的nk细胞培养基培养nk细胞两周后，增殖倍数将近翻了50倍；对k562的杀伤活性在40:1的效靶比时达到了92％。
本发明采用自体血清来促进细胞的增殖，避免了外源性蛋白及病毒的污染；本发明只需较低剂量的il-2，大大降低了生产成本；本发明培养方法培养出来的nk细胞纯度较高。
本发明通过分组实验揭示了分子水平上病毒感染本质的部分科学内涵。证明了证候的宏观表型与微观生物分子之间的复杂关系。
本发明之构建方法具有操作简单，成本低的特点，细胞模型稳定性高、自噬活性高，并具有高自噬活性导致的化疗药物耐受性，有助于在体外分析；可实验证明，通过本发明建立的细胞模型具有稳定96小时以上的抵抗性。模型组出现活动度明显减少、体毛凌乱；体重减轻。
本发明提供的动物模型，首次对不同感染生物学特性进行对比分析，发现高低不同癌株及高低不同转移结节之间生物学特性指标表达有统计学差异；首次对高、低不同转移特性的癌株的影像进行分析；首次对多种pet成像进行最佳组合，充分反映了感染发生生物学特性，为早期诊断提供新方法。
本发明具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对诊断具有重要的临床意义。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1nk细胞的扩增培养
1、外周血单个核细胞的分离
采集40～100ml的外周血，将其与生理盐水按体积比1：1的比例混匀，将混匀后的血液混合液与淋巴细胞分离液按体积比2:1的比例缓慢的加至淋巴细胞分离液上层,3000rpm离心20min；
离心后离心管的从上到下看，分别为血浆、白膜层(即单个核细胞层，pbmc)、淋巴细胞分离液、红细胞层，抽取pbmc层，将收集到的pbmc用生理盐水洗涤重悬后，1500rpm离心10min，重复洗涤两次，收集到pbmc；
2、nk细胞的扩增培养
将收集到的pbmc与上述制备的抗原递呈细胞按1:1的比例混合培养，按1×106的密度接种于培养瓶中，采用1640培养基培养，添加细胞生长因子il-2和il-15，终浓度分别为200u/ml、20u/ml；再添加总体积10％的自体血清，并加入田七皂苷，终浓度为10mg/ml；置于37℃，浓度为5％的co2培养箱中培养。每隔3天补充新鲜培养基和补加il-2、il-15和田七皂苷，终浓度分别为200u/ml、20u/ml和10mg/ml。补液前细胞密度不大于3×106个/ml，补液后细胞密度在0.5～1.0×106个/ml。培养到第5天时再次添加抗原递呈细胞进行二次刺激，直至第14天收集细胞。
实施例2
nk细胞的扩增培养
1、外周血单个核细胞的分离
采集40～100ml的外周血，将其与生理盐水按体积比1：1的比例混匀，将混匀后的血液混合液与淋巴细胞分离液按体积比2:1的比例缓慢的加至淋巴细胞分离液上层，3000rpm离心20min；
离心后离心管的从上到下看，分别为血浆、白膜层(即单个核细胞层，pbmc)、淋巴细胞分离液、红细胞层，抽取pbmc层，将收集到的pbmc用生理盐水洗涤重悬后，1500rpm离心10min，重复洗涤两次，收集到pbmc；
2、nk细胞的扩增培养
将收集到的pbmc与上述制备的抗原递呈细胞按1:3的比例混合培养，按1×106的密度接种于培养瓶中，采用1640培养基培养，添加细胞生长因子il-2和il-15，终浓度分别为500u/ml、100u/ml；再添加总体积10％的自体血清，并加入田七皂苷，终浓度为50mg/ml；置于37℃，浓度为5％的co2培养箱中培养。每隔3天补充新鲜培养基和补加il-2、il-15和田七皂苷，终浓度分别为500u/ml、100u/ml和50mg/ml。补液前细胞密度不大于3×106个/ml，补液后细胞密度在0.5～1.0×106个/ml。培养到第5天时再次添加抗原递呈细胞进行二次刺激，直至第14天收集细胞。
实施例3nk细胞的扩增培养
1、外周血单个核细胞的分离
采集40～100ml的外周血，将其与生理盐水按体积比1：1的比例混匀，将混匀后的血液混合液与淋巴细胞分离液按体积比2:1的比例缓慢的加至淋巴细胞分离液上层，3000rpm离心20min；
离心后离心管的从上到下看，分别为血浆、白膜层(即单个核细胞层，pbmc)、淋巴细胞分离液、红细胞层，抽取pbmc层，将收集到的pbmc用生理盐水洗涤重悬后，1500rpm离心10min，重复洗涤两次，收集到pbmc；
2、nk细胞的扩增培养
将收集到的pbmc与上述制备的抗原递呈细胞按1:2的比例混合培养，按1×106的密度接种于培养瓶中，采用1640培养基培养，添加细胞生长因子il-2和il-15，终浓度分别为300u/ml、50u/ml；再添加总体积10％的自体血清，并加入田七皂苷，终浓度为30mg/ml；置于37℃，浓度为5％的co2培养箱中培养。每隔3天补充新鲜培养基和补加il-2、il-15和田七皂苷，终浓度分别为300u/ml、50u/ml和30mg/ml。补液前细胞密度不大于3×106个/ml，补液后细胞密度在0.5～1.0×106个/ml。培养到第5天时再次添加抗原递呈细胞进行二次刺激，直至第14天收集细胞。
实施例4nk细胞指标检测
检测现有方法与本发明实施例1～3方法培养的nk细胞进行各项指标检测对比，试验组别设置如下：
实验组1：实施例1培养14天的nk细胞；
实验组2：实施例2培养14天的nk细胞；
实验组3：实施例3培养14天的nk细胞；
对照组：除不添加抗原递呈细胞和田七皂苷外，其它操作与本发明方法相同。
1、细胞的活率检测
将培养后的nk细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞活率。并且实验组的细胞活率都高于对照组。
2、细胞的扩增数量的检测
将培养后的nk细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数。
可以看出各组培养后的细胞增殖数量，并且实验组的增殖数量均高于对照组。
3、细胞培养后的杀伤活力检测
将培养后的nk细胞进行杀伤活性的检测，采用乳酸脱氢酶(ldh)法，以k562细胞为靶细胞，分别检测各组nk细胞的杀伤活力。效靶比分别为40:1、20:1、10:1、5:1的细胞数比例将效应细胞及靶细胞加入96孔板，靶细胞数为104个/孔，每种效靶比设4个平行孔，每孔200μl。均采用rpmi1640培养基重悬。于37℃，5％co2培养箱中孵育4h，然后用ldh-cytotoxicitycolorimetricassaykitii(美国，biovision，货号：k313-500)试剂盒进行检测，采用酶标仪检测波长在490nm时的吸光值(a)。杀伤活力的计算过程如下：
将所有实验孔、k562自发ldh释放孔和nk细胞自发ldh释放孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将k562最大ldh释放对照的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；
细胞杀伤活力％＝(od实验-odnk细胞自发-odk562自发)/(odk562最大-odk562自发)×100。
可以看出各组nk细胞对k562细胞的杀伤活随效靶比的增高而增强，各实验组的nk细胞杀伤活力无明显差异，实验组3的结果最佳，而对照组的nk细胞在不同的效靶比时杀伤活力均低于各实验组。
4、细胞培养后免疫表型(nk细胞的纯度)检测
将培养后收集的nk细胞用pbs重悬，密度调整为106个/ml，加入fitc标记的cd16和pe标记的cd56抗体，室温避光孵育30min后，用流式细胞仪检测，检测具有相应免疫表型的细胞比例检测结果。
结论：
从上述各实验检测结果来看，实验组的结果都优于对照组，说明本发明的培养方法优于常规的培养方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。