一种明胶水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及组织工程技术领域。更具体地，涉及一种明胶水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

明胶是一种胶原经过水解得到的天然大分子，其蛋白结构决定了其具有良好的生物相容性和生物可降解性，与胶原相比没有免疫原性，可加工性强，并且保留了胶原具有的细胞粘附肽以及蛋白酶降解位点。因此明胶水凝胶以及明胶基复合水凝胶被广泛应用于组织工程。

用于组织工程的明胶水凝胶即能以细胞/载体复合物的形式注入到机体内，并在原位固化达到修复缺损的目的，也可以在体外固化直接植入体内，并且可以在水凝胶中添加不同的药物，达到特定的缓释效果。

通常有两种方式制备明胶水凝胶，一种是利用明胶本身的溶胶凝胶转化的特性，明胶溶液在低温下通过氢键作用形成物理交联水凝胶；另一种是明胶通过化学交联的方法形成共价交联的水凝胶。这两种方法都存在各自的缺点：首先，纯明胶水凝胶力学性能差，在体温下易溶于水不能维持其凝胶状态，限制了其应用范围；其次，化学交联的水凝胶常采用的交联剂有甲醛、戊二醛、edc和京尼平等，醛类有较强的毒性，edc和京尼平价格昂贵都限制了其应用。

因此，需要提供一种安全性高、力学强度和降解性能可控以及生产成本低的明胶水凝胶。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种明胶水凝胶。

本发明的另一个目的在于提供一种明胶水凝胶的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供一种明胶水凝胶的应用。

为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：

一种明胶水凝胶，为水分子填充的多孔三网络结构，其中第一网络为改性明胶之间的交联网络，第二网络为聚乙二醇双丙烯酸酯之间的交联网络，第三网络为改性明胶与聚乙二醇双丙烯酸酯之间的交联网络。本发明的明胶水凝胶由这三个网络互相穿插构成，提高了水凝胶的稳定性，并且不同网络的降解速度不同，避免单一网络的快速降解，对维持水凝胶物理形态更加有利。

本发明的明胶水凝胶中改性明胶和聚乙二醇双丙烯酸酯相互配合，联合作用，不仅克服了传统化学交联所用交联剂毒性较大的问题，产品更加安全，而且增加了明胶水凝胶中不饱和双键的量，使明胶水凝胶中交联点增加，提高了水凝胶的交联程度，并且还可以通过调节改性明胶的修饰度以及聚乙二醇双丙烯酸酯的量，实现力学强度和降解性能的可控调节。

优选地，按重量份数计，所述明胶水凝胶包括：改性明胶1～30份，聚乙二醇双丙烯酸酯1～40份，水20～80份。

优选地，所述改性明胶为侧链氨基被修饰后带有不饱和双键的明胶。本发明采用带有不饱和双键的改性明胶，能够被紫外光引发交联反应。

优选地，所述改性明胶可为甲基丙烯酰胺基明胶。本发明中甲基丙烯酰胺基在明胶分子链引入不饱和双键的同时自身空间位阻较小，利于分子之间的光交联反应。

优选地，所述改性明胶的甲基丙烯酰胺基修饰度为50～100％。在本发明的某些具体实施方式中，所述改性明胶的甲基丙烯酰胺基修饰度可为，例如：50～75％、50～88％、75～100％、75～88％、88～100％等。本发明中改性明胶的修饰度在所述范围内，得到的明胶水凝胶交联程度更高，三维结构更紧实。更优选为75～88％，在更优选范围内，得到的结果更优。

优选地，所述改性明胶采用常规方法制备，更优选地，制备方法如下：首先将明胶置冷水中溶胀30分钟，然后在50℃搅拌溶解，得到质量体积比为5％-30％的明胶溶液。然后在明胶溶液中加入甲基丙烯酸酐，在50℃搅拌反应3小时，通过控制加入量和反应时间调整明胶的修饰度。反应后将液体装入8-14kd的透析袋中，置于50℃去离子水中搅拌5天，每4小时更换一次去离子水，最后将液体冷冻干燥后得到甲基丙烯酰胺基明胶。

优选地，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的分子量小于2000；在本发明的某些具体实施方式中，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的分子量可为，例如：分子量≤575、575≤分子量<2000、575≤分子量≤1800、575≤分子量≤700、分子量≤700、700≤分子量<2000、700≤分子量≤1800、分子量≤1800、1800≤分子量<2000等。本发明在反应体系中引入低分子量的聚乙二醇双丙烯酸酯，其在体系中有更高的自由度，并且为双功能单体，增加了体系中的不饱和双键的量，使体系中交联点增加，提高的水凝胶的交联程度，实现了交联度、力学性能和降解性能的可控调节。

为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：

一种上述明胶水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

所述明胶水凝胶通过将改性明胶和聚乙二醇双丙烯酸酯经紫外光引发交联制备。本发明采用紫外光引发交联反应制备明胶水凝胶，克服了传统化学交联所用交联剂毒性较大的问题，产品安全环保，同时由于紫外光交联的特点可以制备成可注射水凝胶，在体内原位聚合。

优选地，所述紫外光波长可以为254nm或365nm。

优选地，所述交联反应的温度为25～50℃；在本发明的某些具体实施方式中，所述交联反应的温度可为，例如：25～45℃、25～40℃、25～35℃、25～30℃、30～50℃、30～45℃、30～40℃、30～35℃、35～50℃、35～45℃、35～40℃、40～50℃、40～45℃、45～50℃等。

优选地，所述交联反应的时间为5～20分钟。在本发明的某些具体实施方式中，所述交联反应的时间可为，例如：5～15分钟、5～12分钟、5～10分钟、5～8分钟、8～20分钟、8～15分钟、8～12分钟、8～10分钟、10～20分钟、10～15分钟、10～12分钟、12～20分钟、12～15分钟、15～20分钟等，更优选为10～20在更优选方案中，得到的结果更优。

优选地，所述交联反应的光引发剂为巴斯夫光引发剂irgacure2959。

优选地，所述明胶水凝胶的制备具体包括如下步骤：

将改性明胶、光引发剂和水混合得到混合液a，将聚乙二醇双丙烯酸酯和混合液a混合得混合液b，将混合液b置于紫外光下交联反应得到明胶水凝胶。

优选地，所述改性明胶和光引发剂的质量比为1～300:1。在本发明的某些具体实施方式中，所述改性明胶和光引发剂的质量比可为，例如：1～200:1、1～100:1、1～50:1、1～40:1、1～30:1、1～25:1、1～20:1、1～10:1、1～5:1、1～2.5:1、2.5～300：1、2.5～200:1、2.5～100:1、2.5～50:1、2.5～40:1、2.5～30:1、2.5～25:1、2.5～20:1、2.5～10:1、2.5～5:1、5～300：1、5～200:1、5～100:1、5～50:1、5～40:1、5～30:1、5～25:1、5～20:1、5～10:1、10～300：1、10～200:1、10～100:1、10～50:1、10～40:1、10～30:1、10～25:1、10～20:1、20～300：1、20～200:1、20～100:1、20～50:1、20～40:1、20～30:1、20～25:1、25～300:1、25～200:1、25～100:1、25～50:1、25～40:1、25～30:1、30～300:1、30～200:1、30～100:1、30～50:1、30～40:1、40～300:1、40～200:1、40～100:1、40～50:1、50～300:1、50～200:1、50～100:1、100～300:1、100～200:1、200～300:1等，更优选为20～40:1，在更优选范围内，得到的结果更优。

优选地，所述混合液a的混合方法为：将改性明胶加入含有光引发剂的溶液中混匀。

优选地，所述混合液b的混合方法为：将聚乙二醇双丙烯酸酯加入混合液a中混匀。

为达到上述第三个目的，本发明采用下述技术方案：

一种上述明胶水凝胶在生物支架、细跑培养、药物控释和组织工程等领域的应用。

另外，如无特殊说明，本发明中所用原料均可通过市售商购获得，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明克服了传统化学交联所用交联剂毒性较大的问题，产品更加安全。

(2)本发明克服了传统物理交联力学强度差以及在水中降解速率过快的缺点，通过调节改性明胶的修饰度以及聚乙二醇双丙烯酸酯的量，实现了力学强度和降解性能的可控调节。

(3)本发明克服了单一改性明胶紫外光催化交联程度低的缺点，由明胶自身进行丙烯酰化的活性位点较少，所以单纯对明胶进行接枝改性后所具有的可进行紫外光引发的活性中心也较少，同时明胶分子量大，具有较大的空间位组，也限制了改性后明胶的交联效率。在反应体系中引入低分子量的聚乙二醇双丙烯酸酯，其在体系中有更高的自由度，并且为双功能单体，增加了体系中的不饱和双键的量，使体系中交联点增加，提高的水凝胶的交联程度，实现了交联度、力学性能和降解性能的可控调节。

(4)本发明采用紫外光引发交联的方式制备水凝胶的方法，即能够实现水凝胶的体外制备，又能够制备成可注射水凝胶在体内固化。

(5)本发明所制备的水凝胶为三网络水凝胶，第一网络为改性明胶之间交联网络，第二网络为聚乙二醇双丙烯酸酯之间交联网络，第三网络为改性明胶与聚乙二醇双丙烯酸酯交联网络，所制备的水凝胶由这三个网络互相穿插构成，提高了水凝胶的稳定性，并且不同网络的降解速度不同，避免单一网络的快速降解，对维持水凝胶物理形态更加有利。

(6)本发明制备方法过程简单，生产成本低，易大规模生产。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明实施例2和对比例1制得产品的失重率与时间关系的示意图。

图2示出本发明对比例1制得的甲基丙烯酰胺基明胶交联水凝胶的扫描电镜(sem)图。

图3示出本发明实施例2制得的甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶的扫描电镜(sem)图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

一种明胶水凝胶的制备，包括如下步骤：

(1)称取10g明胶加入到100ml的去离子水中，室温溶胀1h，于60℃恒温水浴中搅拌至完全溶解。将16ml甲基丙烯酸酐以1ml/min的速度滴加到明胶溶液中，在50℃的恒温摇床中震荡反应4h，然后加入400ml50℃的去离子水稀释反应液，将稀释后的溶液装入8-14kda的透析袋中，在50℃的去离子水中透析1周，每4小时更换去离子水，结束后将透析液在3000rpm的离心10min，取上清液，置于-80℃冰箱中过夜，进行冷冻干燥3天得到甲基丙烯酰胺基明胶，修饰度88％。

(2)配置irgacure2959质量浓度0.25wt％的水溶液50ml，置于40℃恒温水浴中搅拌溶解，取冻干后的甲基丙烯酰胺基明胶2.5g搅拌溶解，然后加入聚乙二醇双丙烯酸酯(分子量575)2.5g搅拌溶解，将溶液置于功率为10mw/cm²的365nm紫外灯下反应10min，得到本发明的明胶水凝胶即甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶。

实施例2

一种明胶水凝胶的制备，包括如下步骤：

(1)称取10g明胶加入到100ml的去离子水中，室温溶胀1h，于60℃恒温水浴中搅拌至完全溶解。将16ml甲基丙烯酸酐以1ml/min的速度滴加到明胶溶液中，在50℃的恒温摇床中震荡反应4h，然后加入400ml50℃的去离子水稀释反应液，将稀释后的溶液装入8-14kda的透析袋中，在50℃的去离子水中透析1周，每4小时更换去离子水，结束后将透析液在3000rpm的离心10min，取上清液，置于-80℃冰箱中过夜，进行冷冻干燥3天得到甲基丙烯酰胺基明胶，修饰度88％。

(2)配置irgacure2959质量浓度0.5wt％的水溶液50ml，置于40℃恒温水浴中搅拌溶解，取冻干后的甲基丙烯酰胺基明胶5g搅拌溶解，然后加入聚乙二醇双丙烯酸酯(分子量700)2.5g搅拌溶解，将溶液置于功率为10mw/cm²的365nm紫外灯下反应15min，得到本发明的明胶水凝胶即甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶。

失重率测试：

将本发明的甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶分别取1cm×1cm×0.5cm的水凝胶块，称重记作w0，置于37℃的去离子水中，每24h取出用吸水纸洗掉表面水分，称重记作w，计算失重率，连续7天，设置3组平行实验，取平均值；其中失重率＝1-w/w0。

测试结果如图1所示，与初始质量相比，甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶在第一天的失重率为5.1％，第5天为9.1％，第7天为9.7％，失重率随着时间逐渐趋于稳定，而对比例1中的甲基丙烯酰胺基明胶交联水凝胶失重率普遍高于甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶，并且在7天的测试时间内没有表现出趋于稳定的趋势。可见甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶在37℃的水中稳定性更好，7天后的水凝胶的质量仍在初始质量的90％以上。这是由于聚乙二醇双丙烯酸酯的加入使得体系中不饱和双键的量增加，体系交联程度升高，热稳定性更好。

图3为本实施例制得的甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联水凝胶的扫描电镜(sem)图，图3中，由于聚乙二醇双丙烯酸酯的加入使得甲基丙烯酰胺基明胶分子链之间的交联密度增大，表面出现筋条状的结构，孔壁变厚。由于体系中存在两种可紫外光引发交联的单体，所以形成多孔三网络结构，其中第一网络为改性明胶之间的交联网络，第二网络为聚乙二醇双丙烯酸酯之间的交联网络，第三网络为改性明胶与聚乙二醇双丙烯酸酯之间的交联网络，所制备得到的水凝胶为三种网络互相穿插构成。所以甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联水凝胶的交联程度更高，结构更加稳定。

对比例1

一种甲基丙烯酰胺基明胶交联水凝胶，方法步骤同实施例2，不同之处仅在于：步骤2)中不加入聚乙二醇双丙烯酸酯。

制得甲基丙烯酰胺基明胶交联水凝胶，对其进行失重率测试，测试方法同实施例2，结果如图1所示。对比例1中的甲基丙烯酰胺基明胶交联水凝胶失重率普遍高于实施例2中甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶，并且在7天的测试时间内没有表现出趋于稳定的趋势。

图2示出甲基丙烯酰胺基明胶交联水凝胶的扫描电镜(sem)图，如图2所示，可以看出单纯的甲基丙烯酰胺基明胶交联水凝胶内部结构较为规整，孔径基本一致，为单一网络结构。

实施例3

一种明胶水凝胶的制备，包括如下步骤：

(1)称取1000g明胶加入到10l的去离子水中，室温溶胀1h，于60℃恒温水浴中搅拌至完全溶解。将800ml甲基丙烯酸酐以50ml/min的速度滴加到明胶溶液中，在50℃的反应釜中搅拌反应4h，然后加入40l50℃的去离子水稀释反应液，将稀释后的溶液进行超滤8小时，采用滤膜8kda，将滤液置于-80℃冰箱中过夜，进行冷冻干燥3天得到甲基丙烯酰胺基明胶，修饰度75％。

(2)配置irgacure2959质量浓度0.5wt％的水溶液1l，置于30℃恒温水浴中搅拌溶解，取冻干后的甲基丙烯酰胺基明胶200g搅拌溶解，然后加入聚乙二醇双丙烯酸酯(分子量1800)150g搅拌溶解，将溶液置于两台功率为10mw/cm²的365nm紫外灯下反应20min，得到本发明的明胶水凝胶即甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联的水凝胶。

实施例4

制备载药的水凝胶：

甲基丙烯酰胺基明胶的制备方法与实施例2中相同。

配置irgacure2959质量浓度0.5wt％的水溶液50ml，置于40℃恒温水浴中搅拌溶解，取冻干后的甲基丙烯酰胺基明胶5g搅拌溶解，然后加入聚乙二醇双丙烯酸酯(分子量575)2.5g搅拌溶解，加入质量分数0.1wt％的甲硝唑搅拌溶解，将溶液置于功率为10mw/cm²的365nm紫外灯下反应15min，得到载有甲硝唑的甲基丙烯酰胺基明胶-聚乙二醇双丙烯酸酯交联水凝胶，使得水凝胶具有抗菌消炎的功效。

实施例5

方法步骤同实施例4，不同之处仅在于，用质量分数3wt％纳米羟基磷灰石代替0.1wt％甲硝唑，最终制的具有骨修复功效的水凝胶。

实施例6

方法步骤同实施例4，不同之处仅在于，在紫外灯引发交联前，将体系反应液涂布于无纺布上，然后置于功率为10mw/cm²的365nm紫外灯下反应15min，制备得到水凝胶抗菌敷料。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。