一种组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法与流程

本发明属于酶的固定化技术领域，涉及一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法。

背景技术：

β-葡萄糖苷酶是广泛存在于自然界中的一类水解酶，它能够水解糖苷和寡糖中非还原性末端的β-糖苷残基从而释放葡萄糖和相应的配基。另外，β-葡萄糖苷酶可催化逆水解反应和转糖基反应，并合成相应的糖苷类化合物。随着糖苷类化合物在医药、食品、日用化工工业上有着重要的应用和经济价值，以及与化学法相比酶法合成糖苷具有高选择性、条件温和、反应过程简单以及环保等众多优点。因此，利用β-葡萄糖苷酶催化各类糖苷的合成和应用受到越来越多的关注。但是β-葡萄糖苷酶催化各类糖苷的合成反应大多数需要在非水相体系和较高温度环境中进行，然而，天然β-葡萄糖苷酶的稳定性较差、易失活，导致催化效率低，限制了其工业化应用，因而增强β-葡萄糖苷酶的稳定性是当前急需解决的问题。

交联酶聚集体是近些年发展起来的一种无载体固定化酶技术。它的制备通常分为沉淀和交联两步，首先利用蛋白沉淀剂(如中性盐、水溶性有机溶剂、非离子型高聚物等)将溶解状态的酶进行物理沉淀得到酶沉淀聚集体，随后利用交联剂(例如戊二醛)与酶聚集体分子上的氨基发生反应，从而得到不溶性固定化酶颗粒。该方法获得的固定化酶制备过程简单、酶活保留率高、具有良好的稳定性和重复操作性，但是多次重复利用后聚集体表面结构容易被破坏而造成酶活损失，在非水相催化过程中酶的稳定性也不够。酶的包埋技术是借助化学或者物理的方法将酶固定在某种载体中的过程，载体的形成可以通过化学的方法(如交联、聚合)、物理的方法(物理的凝胶化)或这两种方法的结合。酶分子可以通过聚合物形成的凝胶载体而被包埋于其中，从而获得固定化酶。该方法制备过程简单、酶活保留率高，但是该方法固定的酶往往稳定性不够而且酶容易渗漏、重复回收利用率低。

单一的固定化方法常常存在一些缺陷，如上述交联聚集体在非水相催化过程中稳定性不够，包埋法中易发生酶的泄漏和难以回收等。

技术实现要素：

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法，通过交联-包埋组合式固定化方法制备出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。本发明首先在油包水乳化体系中制备出颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合制备出一种回收率高且稳定性强的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：本发明提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，包括核心与外壳，所述核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，所述外壳为交联的高分子聚合物，所述核心位于外壳内部,所述核心与外壳之间通过化学键链接。

本发明还提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将沉淀剂加入到蛋白浓度为10～50g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡搅拌得到混合液；

(2)向步骤(1)所得混合液中依次加入油相和乳化剂，磁力搅拌乳化1～3min，形成油包水体系后，在4～25℃下沉淀反应0.5～1h；

(3)向步骤(2)所得产物中加入交联剂，磁力搅拌乳化1～3min，在4～25℃下交联反应1～3h，将反应得到的产物在5000r/min转速下离心10～15min，收集沉淀，用去离子水重复清洗2～3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体；

(4)将步骤(3)得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体和能与β-葡萄糖苷酶表面氨基发生反应的且含有碳碳不饱和双键的酶修饰剂依次加入到ph值为4.0～7.0的缓冲溶液中，振荡搅拌，形成聚集体悬液，在4～25℃下反应0.5～6h后，置于截留分子量为12kda的透析袋中透析12～24h；

(5)向步骤(4)透析后的反应液中依次加入乙烯基单体和引发剂，在4～25℃下反应3～10h后，置于截留分子量为12kda的透析袋中透析12～24h，在5000r/min转速下离心10～15min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，将该酶颗粒置于4℃冰箱中保存或冷冻干燥24h后置于4℃冰箱中保存。

上述步骤(1)中沉淀剂为(nh4)2so4、peg400、peg1000、peg6000、peg8000中的一种；所述(nh4)2so4的加入量为30～80％(w/v)，所述peg400、peg1000、peg6000、peg8000的加入量分别为10～30％(w/v)。

上述步骤(2)中油相为大豆油、橄榄油、花生油、液体石蜡、菜籽油、色拉油、蓖麻油、丁酸乙酯、辛癸酸甘油酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、油酸聚乙二醇甘油酯中的一种；所述步骤(2)中的油相与步骤(1)制备出的混合液的体积比为5～50:1。

作为优选，上述油相与混合液的体积比为10:1。

上述步骤(2)中的乳化剂为tween60、tween80、span40、span60、span80、aot、sds中的一种；所述乳化剂的加入量为0.2～3％(w/v)。

上述步骤(3)中交联剂为戊二醛或葡聚糖聚醛；所述交联剂的加入量为0.5～5％(v/v)。

上述步骤(4)中酶修饰剂为n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与二甲基亚砜组成的混合物a、丙烯酰氯与二甲基亚砜组成的混合物b、甲基丙烯酸缩水甘油酯与二甲基亚砜组成的混合物c中的一种或几种，所述酶修饰剂的加入量为0.2～1％(w/v)。

上述步骤(4)中缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中的一种。

上述步骤(5)中乙烯基单体可以通过自由基聚合反应形成聚合物的单烯烃单体和多烯烃单体中的一种或多种，具体为丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基炳烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、n-异丙基丙烯酰胺、n,n'-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯中的一种或几种，所述乙烯基单体的加入量为2～5％(w/v)。

上述步骤(5)中引发剂为a和b组成的混合物，所述a为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化氢、过氧化苯二甲酰中的一种或几种，所述b为n,n'-二甲基苯胺、氨水、n,n,n',n'-四甲基乙二胺、n-甲基吗啉和哌啶中的一种或几种。

作为优选，上述步骤(5)中引发剂为1份过硫酸铵和1份n,n,n',n'-四甲基乙二胺组成的混合物，且加入量为0.5～1.5％(w/v)。

本发明的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的粒径大小为10～60μm。

本发明有益效果是:本发明首先在油包水乳化体系中制备了颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合得到了该组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。该组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒为核壳结构，其核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，外壳层为交联的高分子聚合物，核壳之间通过化学键链接，而且具有生物催化活性、稳定性高。本发明操作简单、成本低、酶活回收率高、酶颗粒大小均匀、酶的稳定性强，而且酶能够方便回收重复利用，具有广阔的应用前景。

附图说明

下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：

图1是本发明的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒制备过程示意图；

图2是本发明实施例一的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒重复利用稳定性变化图。

图中1、游离状β-葡萄糖苷酶，2、交联β-葡萄糖苷酶聚集体，3、组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，4、沉淀剂，5、交联剂，6、酶修饰剂，7、聚合单体，8、引发剂。

具体实施方式

通过对实施例的描述，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

实施例1

本实施例的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段和酶的组合固定化阶段。

交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段，包括以下具体步骤：

(1)将70％的沉淀剂(nh4)2so4加入到5ml蛋白浓度为30g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡摇匀，即得混合液；

(2)将上述混合液按油水体积比为10:1的比例加入到包含1％(w/v)的tween80的大豆油中，磁力搅拌乳化3min，形成油包水体系，在25℃条件下沉淀反应1h；

(3)向步骤(2)中再加入2％(v/v)的交联剂戊二醛，磁力搅拌乳化3min，在25℃条件下交联反应2h，反应结束后将得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体在5000r/min下离心10min，收集沉淀，用去离子水清洗3次，得到交联β-葡萄糖苷酶聚集体。

酶的组合固定化阶段，包括以下步骤：

步骤一、将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体加入到5mlph＝6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，振荡混匀，形成聚集体悬液，再加入0.5％(w/v)的酶修饰剂n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺，在25℃条件下反应3h，结束后置于截留分子量为12kda的透析袋中透析24h；

步骤二、向步骤一透析后的反应液中加入3％(w/v)的丙烯酰胺单体和0.5％(w/v)的过硫酸铵与n,n,n',n'-四甲基乙二胺组成的复合引发剂，在25℃条件下聚合反应6h，结束后置于截留分子量为12kda的透析袋中透析24h，在5000r/min下离心10min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。

β-葡萄糖苷酶的酶活力测定过程中，以未处理的游离酶酶液的酶活力为100％，计算交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率。以酶的组合固定化阶段前的β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活力为100％，计算酶的组合固定化阶段得到的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率。

β-葡萄糖苷酶的酶活力的测定方法为：取1ml适当稀释的β-葡萄糖苷酶(或β-葡萄糖苷酶聚集体或组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒)酶液，在50℃下预热5min，加入1ml已预热5min的10mmol/lpnpg溶液，置于50℃水浴锅中反应10min，反应结束后立即加入2ml浓度为1mol/l的na2co3溶液终止反应，并将反应液置于室温下静置5min。取1ml反应液适当稀释后测定其在405nm处吸光度，再根据标准曲线换算出反应生成的对硝基苯酚(pnp)的量，计算酶活力。酶活定义为：在ph7.0、50℃条件下，每分钟水解pnpg产生1μmolpnp所需要的酶量定义为一个酶活力单位(u)。

本实施例中交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段产生的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为85.6％；本实施例中酶的组合固定化阶段产生的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率为91.3％；如图2所示，本实施的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒在连续使用5次后，组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的残余相对酶活力仍然保持在85％以上。

实施例2

本实施例的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段和酶的组合固定化阶段。

交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段，包括以下具体步骤：

(1)将60％的沉淀剂(nh4)2so4加入到5ml蛋白浓度为30g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡摇匀,得到混合液；

(2)将上述混合液按油水体积比为10:1的比例加入到包含1％(w/v)的tween80的橄榄油中，磁力搅拌乳化3min，形成油包水体系，在4℃条件下沉淀反应1h；

(3)向步骤(2)中再加入2.5％(v/v)的交联剂戊二醛，磁力搅拌乳化3min，在4℃条件下交联反应2h，反应结束后将得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体在5000r/min下离心10min，收集沉淀，用去离子水清洗3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体。

酶的组合固定化阶段，包括以下具体步骤：

步骤一、将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体加入到5mlph＝6.0的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液中，振荡混匀，形成聚集体悬液，再加入0.5％(w/v)的酶修饰剂n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺，在4℃条件下反应3h，结束后置于截留分子量为12kda的透析袋中透析24h；

步骤二、向步骤一透析后的反应液中加入4％(w/v)的丙烯酰胺单体和0.5％(w/v)的过硫酸铵与n,n,n',n'-四甲基乙二胺组成的复合引发剂，在4℃条件下聚合反应6h，结束后置于截留分子量为12kda的透析袋中透析24h，在5000r/min下离心10min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。

本实施例交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为82.7％；本实施例酶的组合固定化阶段制备出的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率为88.4％。

实施例3

本实施例的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段和酶的组合固定化阶段。

交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段，包括以下具体步骤：

(1)将70％的沉淀剂(nh4)2so4加入到5ml蛋白浓度为30g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡摇匀,得到混合液；

(2)将上述混合液按油水体积比为10:1的比例加入到包含1％(w/v)的span60的大豆油中，磁力搅拌乳化3min，形成油包水体系，在4℃条件下沉淀反应0.5h；

(3)向步骤(2)中再加入2％(v/v)的交联剂戊二醛，磁力搅拌乳化3min，在4℃条件下交联反应2h，反应结束后将得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体在5000r/min下离心10min，收集沉淀，用去离子水清洗3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体。

酶的组合固定化阶段，包括以下具体步骤：

步骤一、将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体加入到5mlph＝7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，振荡混匀，形成聚集体悬液，再加入0.5％(w/v)的酶修饰剂n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺，在4℃条件下反应3h，结束后置于截留分子量为12kda的透析袋中透析24h；

步骤二、向步骤一透析后的反应液中加入0.5％(w/v)的n,n'-甲叉双丙烯酰胺单体与2.5％(w/v)的丙烯酰胺单体和0.5％(w/v)的过硫酸铵与n,n,n',n'-四甲基乙二胺组成的复合引发剂，在4℃条件下聚合反应6h，结束后置于截留分子量为12kda的透析袋中透析24h，在5000r/min下离心10min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。

本实施例交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为83.5％；本实施例酶的组合固定化阶段制备出的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率为85.9％。

实施例4

本实施例的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段和酶的组合固定化阶段。

交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段，包括以下具体步骤：

(1)将加入20％(w/v)的沉淀剂peg1000加入到5ml蛋白浓度为20g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡摇匀,得到混合液；

(2)将上述混合液按油水体积比为10:1的比例加入到包含0.5％(w/v)的span60的大豆油中，磁力搅拌乳化3min，形成油包水体系，在4℃条件下沉淀反应1h；

(3)向步骤(2)中再加入2％(v/v)的交联剂戊二醛，磁力搅拌乳化3min，在4℃条件下交联反应2h，反应结束后将得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体在5000r/min下离心10min，收集沉淀，用去离子水清洗3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体。

酶的组合固定化阶段，包括以下具体步骤：

步骤一、将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体加入到5mlph＝5.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，振荡混匀，形成聚集体悬液，再加入0.8％(w/v)的酶修饰剂n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺，在4℃条件下反应4h，结束后置于截留分子量为12kda的透析袋中透析24h；

步骤二、向步骤一透析后的反应液中加入3％(w/v)的丙烯酰胺单体和0.6％(w/v)的过硫酸铵与n,n,n',n'-四甲基乙二胺组成的复合引发剂，在4℃条件下聚合反应6h，结束后置于截留分子量为12kda的透析袋中透析24h，在5000r/min下离心10min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。

本实施例交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为79.9％；本实施例酶的组合固定化阶段制备出的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率为86.5％。

实施例5

本实施例保持实施例1中的酶的组合固定化阶段制备条件不变，将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段的油水体积比改为20:1，油相改为液体石蜡，其他条件与实施例1相同，测得交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为75.7％，最终制备的组合固定化β-葡萄糖苷酶的酶活回收率87.2％。

本实施例与实施例1相比，制备的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率和制备的组合固定化β-葡萄糖苷酶的酶活回收率都较低。实施例5中油水比例的增大，使得体系形成的乳滴较小，造成制备的交联β-葡萄糖苷酶聚集体粒径较小，小乳滴内的酶易受油水界面的作用而失活，而且交联β-葡萄糖苷酶聚集体粒径较小，易造成回收不完全而导致酶活的损失。另外，本实施例中的油相为液体石蜡，由于液体石蜡比重较小，形成的交联β-葡萄糖苷酶聚集体难以与油滴分离，影响酶活回收率。

实施例6

本实施例保持实施例1中交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段条件不变，将实施例1中酶的组合固定化阶段加入酶修饰剂n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺改为不加酶的修饰剂，直接进行聚合反应。实验发现本实施例与实施例1相比，不加酶修饰剂制备的组合固定化β-葡萄糖苷酶其酶表面形成的聚丙烯酰胺层结构较为松散，导致β-葡萄糖苷酶容易脱落，不适合多次重复回收利用。

上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。