一种提高重组犬干扰素‑β融合蛋白抗病毒活性的方法与流程

本发明涉及一种重排的基因，尤其涉及重组犬干扰素-β基因，本发明还涉及含有该基因的表达载体以及工程菌株，本发明进一步涉及它们在制备犬干扰素-β中的用途，属于干扰素基因工程领域。

犬类作为人的伴侣动物，在人类的生活中占据日益重要的地位，与之相伴的各种犬类病毒性疾病也在人们的生活中重复发生，有些成为人畜共患病的病原。但在兽医临床方面，目前还没有一种治疗病毒性疾病的特效药。随着科学技术的进步及现代兽医业的需要，免疫增强剂的防治作用越来越受到重视，特性确定、高效、稳定、无毒的理想免疫增强剂将是未来防治动物病毒性疾病的主要物质。其中，最主要的免疫增强剂就是干扰素。干扰素（ifn）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（nk细胞）、巨噬细胞和t淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。由于干扰素具有无毒、无副作用和抗病毒范围广泛的优势，在发现之初就受到关注，经过多年的应用发展，干扰素已经成为一种广泛的免疫增强剂用于病毒病和肿瘤等疾病的防治领域。

随着国内工作犬、肉用犬以及宠物犬等犬类的大幅度增加，病毒性传染病成为威胁犬类生命的直接原因。人与犬的亲密接触大大增加了人被病毒感染的机会。如狂犬病毒病等。而干扰素已被证明是防止病毒性传染病的重要制剂。以往干扰素-β以野生型的形式生产，虽然与天然结构相近，但半衰期较短，造成养殖户使用成本较高。因此，运用基因工程技术，对原始序列进行改造，获得效果更有益的重组犬干扰素-β是当前的研究思路。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种重组犬干扰素-β基因，该基因可以在原核表达系统中稳定、高效的表达重组犬干扰素；

本发明目的之二是提供含有上述重组犬干扰素-β基因的表达载体；

本发明目的之三是提供由上述重组犬干扰素-β基因所转化的工程菌株；

本发明目的之四是提供一种制备重组犬干扰素-β的方法；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种重组犬干扰素-β基因，其核苷酸序列为seqidno.1所示，其编码的氨基酸序列为seqidno.2所示。

本发明的重组犬干扰素-β基因是以犬干扰素-β、犬免疫球蛋白ch3区域和6个his连接而成，其中核酸序列通过优化改造为最适合原核表达宿主生产的核酸序列。

本发明的重组犬干扰素-β基因的结构由犬干扰素-β、6个his和犬免疫球蛋白ch3区串联而成，该基因由930个核苷酸构成编码309个氨基酸。

本发明还构建了含有seqidno.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及用该重组表达质粒转化得到的工程菌株。

本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将seqidno.1所示的核苷酸序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使seqidno.1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为一个参考的实施方案，例如，可以将重组犬干扰素-β基因与大肠杆菌原核表达载体pet27b利用酶切位点bamhi和hindiii相连，命名为pet-rcaifn-β。

本发明所构建的重组表达质粒可通过各种常规的方法转化宿主细胞。作为参考，可以将含有重组犬干扰素-β基因的重组质粒pet-rcaifn-β转化大肠杆菌rosetta（购自北京全式金生物技术有限公司，货号目录cd801）得到的菌株，命名为escherichiacolirosetta/pet-rcaifn-β，简称rosetta/pet-rcaifn-β。

利用大肠杆菌重组菌株rosetta/pet-rcaifn-β生产重组蛋白的具体方法可以：

1、种子液的制备：将菌种划线培养后获得单菌落，挑取单菌落于10mllb液体培养基中，同时加入100mg/l氨苄青霉素，37℃培养12h。

2、发酵：将获得的种子液按1：100接种于发酵培养基中，当培养至od600为0.4左右时，加入iptg诱导，其终浓度为5mm，37℃培养3h左右收菌。

本发明还提供一种制备重组犬干扰素-β的方法，包括以下步骤：

构建含有seqidno.1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白。

上述制备重组蛋白的方法中，所述的重组表达质粒优选是pet-rcaifn-β；所述的宿主细胞是大肠杆菌（escherichiacoli）rosetta(de3)，所述的重组菌株优选为escherichiacolirosetta/pet-rcaifn-β。

上述制备重组蛋白的方法中，优选的，所述的重组蛋白的分离和纯化包括以下步骤：

1、将收集的菌体悬于磷酸盐缓冲液，破碎后低温离心收集上清，利用ni亲和柱和akta蛋白纯化系统进行蛋白粗提纯；

2、将粗提纯的蛋白再利用akta系统进行分子筛的纯化，最终得到纯度达到90%以上的蛋白。

以天然犬干扰素基因-β（犬干扰素基因-β的原始序列见附录一）代替重组犬干扰素-β基因进行以上步骤，得到可用于后续实验的天然犬干扰素作为对照。

本发明将犬干扰素-β与犬免疫球蛋白ch3区融合表达，增加了蛋白的稳定性和活性，同时本发明的蛋白表达和纯化方法具有生产时间短、表达效率高、表达量大、易于纯化的优点，并且经实验证明，本发明所表达的重组犬干扰素-β不仅在半衰期上显著优于天然犬干扰素-β，而且提高了其抗病毒活性。

附图说明

图1重组犬干扰素-β纯化后的sds-page凝胶电泳结果。

其中，m为蛋白分子量标准marker，1为目的带。

图2重组犬干扰素-β对mdck细胞增殖的抑制作用。

图3重组犬干扰素-β刺激p53表达的时间依赖性。

图4重组犬干扰素-β刺激p53表达的剂量依赖性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

mdck细胞：购自atcc，ccl-34，由本实验室传代培养，培养基为含10%胎牛血清的dmem。

实施例1重组犬干扰素-β基因质粒的构建

1、通过化学合成的方法合成所需的重组犬干扰素-β基因。

2、表达重组犬干扰素-β基因的重组质粒的构建。

将上述步骤1合成的重组犬干扰素-β基因用限制性内切酶bamhi和hindiii进行酶切，并与被相同酶切割之后的pet27b载体相连接并转化大肠杆菌dh5α感受态，筛选具有氨苄抗性的转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序后证明重组犬干扰素-β基因已克隆至pet27b载体上，得到的重组质粒命名为pet-rcaifn-β。

实施例2高效表达重组犬干扰素-β基因的大肠杆菌菌株e.colirosetta/pet-rcaifn-β的构建

用化学转化方法将pet-rcaifn-β转化至e.colirosetta，在含有氨苄青霉素的lb平板上筛选转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序分析证明获得的重组子e.colirosetta/pet-rcaifn-β和预期一致。

实施例3利用大肠杆菌工程菌e.colirosetta/pet-rcaifn-β生产重组犬干扰素-β

1、菌种的培养发酵

挑取大肠杆菌工程菌e.colirosetta/pet-rcaifn-β，按1%接种量将工程菌接种于lb液体培养基中，37℃恒温培养12-14h，次日1：100扩大培养至od值为0.4，加iptg至终浓度0.5mm，继续培养3h，4000r/min，离心30min收集菌体。

2、重组犬干扰素-β的纯化

将上述收集的菌体超声破碎离心后收集上清，将上清过滤后利用akta蛋白纯化系统进行纯化，先后进行亲和层析和分子筛层析得到纯化后的重组犬干扰素-β。

取少量纯化后的重组犬干扰素-β蛋白加入1/5体积的5×sds上样缓冲液，煮沸10分钟后进行sds-page凝胶电泳。电泳结果见图1。

实施例4mtt法检测重组犬干扰素-β蛋白对mdck细胞增殖的抑制作用

将处于对数生长期的犬的mdck细胞经胰蛋白酶消化后进行收集，制备成110⁴个/ml的细胞悬液，吹打均匀后接入96孔板，每孔200µl细胞悬液，在37℃、5%co2培养箱中继续培养过夜后，去掉培养基，用pbs洗一次，分为6组，每组实验孔各加入2、10、50、250、1250、6250ng的caifn-β蛋白100μl，对照孔加100μldmem。分别于48h、72h，每孔加入20μlmtt溶液（5mg/ml），4h后，弃去培养液，每孔加入150μl的dmso，震荡10min后，用酶联免疫分析仪于测定波长为570nm测定od值。生长抑制率由下式计算：

抑制率%=（对照组od均值-治疗组od值）/对照组od均值×100%

结果见图2。从图2中可以看出，与蛋白缓冲液对照组和天然犬干扰素-β蛋白对照组相比，纯化后的重组犬干扰素-β对mdck细胞生长有明显的抑制作用，随着浓度的增加，对mdck细胞抑制率逐渐增加(**p<0.01)。

实施例5real-timepcr检测重组犬干扰素-β蛋白上调mdck细胞p53mrna的表达水平

将处于对数生长期的mdck犬肾细胞，分别用纯化后的rcaifn-β蛋白进行刺激，分别将蛋白进行10倍、100倍、1000倍稀释，刺激4h，检测rcaifn-β蛋白刺激下，p53随剂量变化的关系以及100倍稀释后，2h、4h、6h刺激下，p53随时间变化的关系。rcaifn-β蛋白刺激后，将细胞消化，加入trizol试剂，提取细胞总rna，反转录成cdna后，使用实时荧光定量pcr技术检测p53mrna的相对表达情况，以gapdh的表达量作为内参，引物由invitrogen公司合成，所用引物如下：

p53上游：5′-ttgccagctggcgaagacctg-3′，

p53下游：5′-acctcgggtggctcataaggca-3′；

gapdh上游：5′-tgccgcctggagaaagctgc-3′,

gapdh下游：5′-tcccaggaaatgagcttgac-3′。

以cdna为模板分别用两对引物进行反应，按试剂盒（abi公司的sybrgreenpcrmastermix）说明书要求加入试剂，每组反应做三个复孔，取平均值。实时荧光定量pcr反应体系为20µl，采用两步法pcr反应程序扩增cdna，按照thermalcyclerdicetmrealtimepcr（takaracode:tp800）的使用说明书要求进行实验操作。

结果见图3。由图3可以看出，在相同剂量的犬干扰素-β蛋白的刺激下，重组犬干扰素-β蛋白刺激mdck细胞的内源p53的表达水平显著高于天然犬干扰素-β蛋白(*p<0.05)。且重组犬干扰素-β蛋白刺激mdck细胞的内源p53的表达水平在4h时达到最高。

结果见图4。由图4可以看出，并且随着天然犬干扰素-β和重组犬干扰素-β蛋白剂量的不断增加，p53mrna水平也具有逐渐增加的趋势，呈剂量依赖性关系，差异显著(^##p<0.01，^&&p<0.01)。在不同剂量的犬干扰素-β蛋白的刺激下，重组犬干扰素-β蛋白刺激mdck细胞的内源p53的表达水平显著高于天然犬干扰素-β蛋白（*p<0.05）。

附录一

1atgagcaacgacttgcttcgatcccagctaagcagcagcagtttggagtg

51tcaggagctcctattacagttgaatggaaccactgaatattgcctcaagg

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151cagaaggaggacatcatattgatcacccatgagatgttccagaagatctt

201tgatattttcaggagaaatatctctagaacaggatggaatgagaccactg

251tcgagaaccttcttgtgaagctccactggcagaaggaacatctggagata

301atcctggaggacgtcaaagagaaggaaaacttcacctgggacaacaggac

351tcttctgcacctgaagaaatattacttaaggattgtgcagtacctgaagg

401ccaaggagtacagcatctgtgcctggacaatagtccaagcagaaatctgc

451aggaactttttcttccttaatatacttacagattatctccagaacggtgg

501tggtggtagcggtggtggtggtagcggtggtggtggtagcctcccgtccc

551ccatcgagaggactatctccaaagccagagggcaagcccatcagcccagt

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序列表

<110>哈尔滨紫霞生物科技有限公司

<120>一种提高重组犬干扰素-β融合蛋白抗病毒活性的方法

<210>seqidno:1

<211>930

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>seqidno:1

1atgtctaacgacctgctgcgttctcagctgtcttcttcttctctggaatg

51ccaggaactgctgctgcagctgaacggtaccaccgaatactgcctgaaag

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651taccctgacctgcctgatcaaagacttcttcccgccggaaatcgacgttg

701aatggcagtctaacggtcagccggaaccggaatctaaataccacaccacc

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801tgttgacaaatctcgttggcagcagggtgacaccttcacctgcgctgtta

851tgcacgaagctctgcagaaccactacaccgacctgtctctgtctcactct

901ccgggtaaacaccaccaccaccaccactaa

<210>seqidno:2

<211>309

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>seqidno:2

1metserasnaspleuleuargserglnleuserserserserleuglucysglngluleu

21leuleuglnleuasnglythrthrglutyrcysleulysaspargileasnphegluile

41proglugluileglulysserargglnpheglnlysgluaspileileleuilethrhis

61glumetpheglnlysilepheaspilepheargargasnileserargthrglytrpasn

81gluthrthrvalgluasnleuleuvallysleuhistrpglnlysgluhisleugluile

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