一种具有抑菌活性的融合子及其制备方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及一种具有抑菌活性的融合子及其制备方法。
背景技术：
：常用的抑菌剂是一些抗生素，能可逆性抑制细菌的繁殖，但不直接杀死细菌。近几年，随着抗生素被人们滥用，导致部分细菌产生耐药性，从而使抗生素的抗菌作用减弱或消失，因此，开发具有抑菌活性的的生物抑菌剂替代抗生素已经成为世界范围的研究热点。highlyn-methylatedlinearpeptidesproducedbyanatypicalsponge-derivedacremoniumsp[jnatprod，2006，69(9)：83-92]中公开了一种从海绵acremonium的代谢产物中分离纯化得到的肽类化合物，该化合物具有较强的抗菌作用，其中环状肽类抑菌效果比较明显。线虫共生致病杆菌pacyellow的吲哚抗生素[微生物通报，2015，42(1)：85-92]中公开了一种从嗜线虫致病杆菌的代谢产物中分离纯化得到4个吲哚生物碱类化合物，其中2个化合物对致病真菌新型隐球菌具有较好的抑制作用。通过上述文献记载的方法获得的生物抑菌剂分别对环状肽类和致病真菌新型隐球菌具有较好的抑制作用，但是两者的制备方法均比较复杂，且制备得到的生物抑菌剂达不到化学源抑菌剂的效果，因此利用率并不高。原生质体融合是指通过人工的方法，使遗传性状不同的两个或多个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。原生质体融合在提高菌种的产酶活力、代谢产物的含量、降解污染物的能力，以及对环境的耐受性等方面的应用已有报道。目前，大多数原生质体融合的研究均针对种属内的微生物实施，目标是改善微生物的生长、生产特性，对跨界融合的少量报道集中在废水处理、葡萄酒降酸微生物选育方面。与属种间的融合相比，跨界融合更有可能产生结构和功能新颖的分子，因而在药物或前体分子产生方面，提供不同于常规的“组合化学合成或高通量筛选”的新的途径。原核微生物粘质沙雷氏菌属于革兰氏阴性细菌，能够产生一类具有吡咯环结构的紫红色素-灵菌红素。研究表明，灵菌红素及其衍生物具有抗细菌、抗真菌、抗疟剂、免疫抑制和抗肿瘤等活性，灵菌红素类似物或衍生物正成为药物研究的热点。真核生物胶红酵母属于隐球菌科，遗传稳定，抑菌普广，效价高，一般不产生对人和植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力。由于细菌和真菌基因组的差异以及代谢类型的多样性，采用已知能产生抑菌活性物质的粘质沙雷氏菌和胶红酵母，开展跨界融合会产生一些新颖的分子结构和抑菌活性的菌株。目前，粘质沙雷氏菌和胶红酵母原生质体融合子的研究尚未见报道，因此，具有十分重要的研究意义。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种具有抑菌活性的融合子及其制备方法。本发明建立了基于双亲灭活原生质体技术，制备具有抑菌活性的粘质沙雷氏菌和胶红酵母原生质体融合子的方法。本发明的技术方案如下：一种具有抑菌活性的融合子，名称为rhodotorulamucilaginosasgm，保藏单位为广东省微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为gdmccno：60141，保藏日期为2017年1月16日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。所述具有抑菌活性的融合子的制备方法，包括以下步骤：s1：原生质体的制备与灭活(1)粘质沙雷氏菌原生质体的制备①粘质沙雷氏菌甘油菌株活化过夜，按5％接种量接入30mllb培养基，30℃，200r/min培养4h，制得菌液a；②取5-8ml步骤①制得的菌液a，6000-8000r/min离心5-8min，用pbs缓冲液洗涤3次并重悬于6-10mlpbs缓冲液中，制得悬菌液b；⑧取50μl步骤②制得的菌悬液b，加入5-10μl用pbs缓冲液配制的质量分数为0.2％的溶菌酶，35℃水浴50-60min，4000r/min离心10min，弃上清液，制得菌液c；④用含0.6mol/lnacl的pbs缓冲液洗涤步骤⑧制得的菌液c两遍，6000r/min离心8min，最后重悬于1ml原生质体稳定液，制得粘质沙雷氏菌原生质体，所述粘质沙雷氏菌原生质体浓度为106个细胞/ml；(2)胶红酵母原生质体的制备①将试管活化的胶红酵母于170r/min，30℃恒温摇床培养8h，制得菌液d；②取5-10ml步骤①制得的菌液d，4000-8000r/min离心5-10min，收集细胞，用pbs缓冲液洗涤2-3次，并将其重悬于5-10mlpbs缓冲液中，制得菌悬液e；⑧取50μl步骤②制得的菌悬液e，加入0.5-2.5μl混合酶，30℃水浴40min，4000r/min离心10min，弃上清液，制得菌液f；④用含0.6mol/lnacl的pbs缓冲液洗涤步骤⑧制得的菌液f两遍，4000r/min离心10min，最后重悬于1ml原生质体稳定液，制得胶红酵母原生质体，所述胶红酵母原生质体浓度为106个细胞/ml；(3)粘质沙雷氏菌原生质体的热灭活取1ml步骤(1)制得的粘质沙雷氏菌原生质体于60℃水浴30-60min，使其灭活率达100％，制得灭活的粘质沙雷氏菌原生质体；(4)胶红酵母原生质体的紫外灭活取1ml步骤(2)制得的胶红酵母原生质体，在20w的紫外灯下，距离10cm照射3-5min，使其灭活率达100％，制得灭活的胶红酵母原生质体；s2：原生质体的融合与再生(1)各取1ml灭活的粘质沙雷氏菌原生质体和灭活的胶红酵母原生质体，混合后2000r/min离心5min，制得灭活的原生质体混合液g；(2)收集步骤(1)中灭活的原生质体混合液g，加入1-5ml原生质体融合剂，30℃水浴20min，1000r/min离心5min，弃上层清液，制得初步融合子h；(3)将步骤(2)制得的初步融合子h用1.0mol/l山梨醇水溶液洗涤2次，稀释并涂布于pda再生培养平板上，30℃培养4d；s3：原生质体融合子的筛选待上述pda再生平板上有菌落长出，该菌落即为粘质沙雷氏菌和胶红酵母的原生质体融合子；s4：具有抑菌活性的融合子的筛选对步骤s3制得的原生质体融合子通过试管液体浊度法或抑菌圈直径法筛选，获得具有抑菌活性的融合子。优选的，所述步骤s1中的混合酶用pbs缓冲液配制，其中蜗牛酶质量分数为2％、纤维素酶质量分数为1％。优选的，所述步骤s2所述的原生质体融合剂配比为：质量分数为25％的peg6000、0.05mol/lcacl2、0.05mol/l甘氨酸。本发明的有益效果为：(1)本发明建立了粘质沙雷氏菌和胶红酵母双亲灭活原生质体条件，以及基于试管浊度或抑菌圈的筛选方法，能够快速地获得具有抑菌活性的目标融合子，且融合子遗传形状稳定。(2)本发明优化了粘质沙雷氏菌和胶红酵母原生质体的制备条件，采用热灭活和紫外灭活两种不同的灭活方式以确保融合子的稳定性。(3)本发明所获得的融合子在生物农药、抗菌药物筛选、遗传学等领域有潜在的应用价值。附图说明图1为具有抑菌活性的融合子rhodotorulamucilaginosasgm胞外产物用不同溶剂萃取后对枯草芽孢杆菌(atcc6633)的抑菌活性，其中：1、空白对照，2、正丁醇层，3、乙酸乙酯层，4、石油醚层，5、万古霉素；图2为具有抑菌活性的融合子rhodotorulamucilaginosasgm胞内产物用不同溶剂萃取后对枯草芽孢杆菌(atcc6633)的抑菌活性，其中：1、空白对照，2、乙酸乙酯层，3、正丁醇层，4、万古霉素。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明涉及的菌株：粘质沙雷氏菌由中国专利cn102888351b公开的一种灵菌红素高产菌株及其生产方法获得。胶红酵母购自广东省微生物菌种保藏中心。实施例1、本发明涉及的培养基(1)lb培养基的制备分别取蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，将上述蛋白胨、酵母提取物、nacl混合均匀并用蒸馏水定容至1l，即得。(2)pda培养基的制备取200g土豆，去皮，切块，加水煮沸30min，得到煮沸后的土豆，将上述煮沸后的土豆用双层纱布过滤，然后加入20g葡萄糖，搅拌溶解，加水至1l，即得。(3)再生培养基的制备分别在lb培养基、pda培养基中加入nacl，至nacl最终浓度为0.6mol/l，制得相应的再生培养基。(4)zr培养基的制备分别取蔗糖0.1g，牛肉浸粉1.23g，nacl0.3g，mgso40.12g，cacl20.10g，将上述组分混合均匀并用蒸馏水定容至100ml，即得。上述lb培养基、pda培养基、再生培养基、zr培养基对应的固体培养基均需加入质量浓度为2％的琼脂粉。实施例2、本发明涉及的主要试剂(1)pbs缓冲液的制备分别取磷酸二氢钾8.34g，三水合磷酸氢二钾0.87g，将上述磷酸二氢钾和三水合磷酸氢二钾混合均匀，并用蒸馏水定容至1l，即得pbs缓冲液，所述pbs缓冲液ph＝5.8。(2)原生质体稳定液的制备向上述pbs缓冲液中加入nacl，至nacl终浓度为0.6mol/l，即得。(3)原生质体融合剂的制备原生质体融合剂配比为：质量分数为25％的peg6000、0.05mol/lcacl2、0.05mol/l甘氨酸。实施例3、具有抑菌活性的融合子所述具有抑菌活性的融合子的制备方法为：s1：原生质体的制备与灭活(1)粘质沙雷氏菌原生质体的制备①粘质沙雷氏菌甘油菌株活化过夜，按5％接种量接入30mllb培养基，30℃，200r/min培养4h，制得菌液a；②取8ml步骤①制得的菌液a，6000r/min离心8min，用pbs缓冲液洗涤3次并重悬于6mlpbs缓冲液中，制得悬菌液b；⑧取50μl步骤②制得的菌悬液b，加入6μl用pbs缓冲液配制的质量分数为0.2％的溶菌酶，35℃水浴55min，4000r/min离心10min，弃上清液，制得菌液c；④用含0.6mol/lnacl的pbs缓冲液洗涤步骤⑧制得的菌液c两遍，6000r/min离心8min，最后重悬于1ml原生质体稳定液，制得粘质沙雷氏菌原生质体，所述粘质沙雷氏菌原生质体浓度为106个细胞/ml；(2)胶红酵母原生质体的制备①将试管活化的胶红酵母于170r/min，30℃恒温摇床培养8h，制得菌液d；②取10ml步骤①制得的菌液d，4000r/min离心10min，收集细胞，用pbs缓冲液洗涤2次，收集细胞，并将其重悬于5mlpbs缓冲液中，制得菌悬液e；⑧取50μl步骤②制得的菌悬液e，加入1-2μl混合酶，30℃水浴40min，4000r/min离心10min，弃上清液，制得菌液f，上述混合酶用pbs缓冲液配制，其中含蜗牛酶质量份数2％、纤维素酶质量分数1％；④用含0.6mol/lnacl的pbs缓冲液洗涤步骤⑧制得的菌液f两遍，4000r/min离心10min，最后重悬于1ml原生质体稳定液，制得胶红酵母原生质体，所述胶红酵母原生质体浓度为106个细胞/ml；(3)粘质沙雷氏菌原生质体的热灭活取1ml步骤(1)制得的粘质沙雷氏菌原生质体，于60℃水浴50min，使其灭活率达100％，制得灭活的粘质沙雷氏菌原生质体；(4)胶红酵母原生质体的紫外灭活取1ml步骤(2)制得的胶红酵母原生质体，在20w的紫外灯下，距离10cm照射3min，使其灭活率达100％，制得灭活的胶红酵母原生质体；s2：原生质体的融合与再生(1)各取1ml灭活的粘质沙雷氏菌原生质体和灭活的胶红酵母原生质体，混合后2000r/min离心5min，制得灭活的原生质体混合液g；(2)收集步骤(1)中灭活的原生质体混合液g，加入1.5ml原生质体融合剂，30℃水浴20min，1000r/min离心5min，弃上层清液，制得初步融合子h；(3)将步骤(2)制得的初步融合子h用1.0mol/l山梨醇水溶液洗涤2次，稀释并涂布于pda再生培养平板上，30℃培养4d；s3：融合子的筛选上述pda再生平板上长出的11个单菌落均为融合子。s4：具有抑菌活性的融合子的筛选通过抑菌圈直径法，比较上述11个融合子发酵液用不同溶剂萃取后对枯草芽孢杆菌的相对抑菌活性，获得对枯草芽孢杆菌抑菌活性相对较高的融合子f7。该融合子f7被命名为rhodotorulamucilaginosasgm。具有抑菌活性的融合子rhodotorulamucilaginosasgm胞外产物用不同溶剂萃取后对枯草芽孢杆菌(atcc6633)的抑菌活性如图1所示，由图1可知，rhodotorulamucilaginosasgm胞外产物用正丁醇、乙酸乙酯萃取后对枯草芽孢杆菌抑菌活性较强；具有抑菌活性的融合子rhodotorulamucilaginosasgm胞内产物用不同溶剂萃取后对枯草芽孢杆菌(atcc6633)的抑菌活性如图2所示，由图2可知rhodotorulamucilaginosasgm胞内产物用乙酸乙酯、正丁醇萃取后对枯草芽孢杆菌具有一定的抑菌活性。试验例1、具有抑菌活性的融合子的同源性分析1.试验材料：实施例3制备的具有抑菌活性的融合子。2.试验方法：细菌16srrna测序引物27f/1492r，真菌its区测序引物为its4/its5。(1)pcr反应体系为：模板dna(5ng/μl)2μl，引物(10μm)各0.4μl，dntp(2.5mm)0.4μl，taq酶(5u/μl)0.25μl，双蒸水补至20μl。(2)扩增条件为：95℃预变性3min；每个循环条件为：94℃变性1min，52℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环。产物末端72℃延伸10min，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。(3)经测序获得1462bp的16srrna扩增产物(genbank：ky542118.1)和640bp的rrna扩增产物(genbank：ky488461)。3.试验结果：(1)对获得的16srrna片段序列进行同源性比较，结果表明，融合子与数据库中的serratiamarcescenssubsp.sakuensisstrainkred(accessionno.nr036886.1)、serratianematodiphilastraindz0503sbs1(accessionno.nr044385.1)具有约96％的同源性(querycoverage为99％，maxident为96％，e为0.0)，证明亲本之一为沙雷氏菌。(2)对获得的its区基因序列进行同源性比较，结果表明，融合子与数据库中的红酵母rhodotorulasp.lh51(accessionno.hq832802.1)、胶红酵母rhodotorulamucilaginosastrainuoa/hcpf10538(accessionno.hq702343.1)等具有100％的同源性(querycoverage为100％，maxident为100％，e为0.0)，表明亲本之一为胶红酵母。试验例2、具有抑菌活性的融合子的遗传稳定性检验1.试验材料：实施例3制备的具有抑菌活性的融合子。2.试验方法：将实施例3制备的具有抑菌活性的融合子在pda固体培养基上培养，14d传代一次，连续传代15次后观察融合子的形态，并检测融合子乙醇提取物的抑菌活性，及细胞内总蛋白的表达情况。3.试验结果：融合子乙醇提取物的抑菌活性及细胞内总蛋白的表达均没有产生显著的变化，证明融合子遗传相对稳定。试验例3、具有抑菌活性的融合子的生化特性检验1.试验材料：实施例3制备的具有抑菌活性的融合子。2.试验方法：(1)采用生物显微镜观察具有抑菌活性的融合子在3种不同培养基上菌落边缘生长特点以及菌落的质地、颜色和表面结构。(2)采用100×10的油镜观察具有抑菌活性的融合子、粘质沙雷氏菌、胶红酵母的形态和运动性，采用透射电镜观察具有抑菌活性的融合子、粘质沙雷氏菌、胶红酵母的直径、鞭毛结构、荚膜结构和增殖方式。(3)具有抑菌活性的融合子的各种氮源、碳源同化研究。3.试验结果：(1)生物显微镜观察结果如表1所示表1具有抑菌活性的融合子在3种不同培养基上的菌落形态培养基湿润突起颜色表面pda是否淡粉至粉红光滑、粘稠zr否是淡粉至粉红光滑、粘稠lb否是淡粉至粉红光滑、粘稠由表1可知，本发明制得的具有抑菌活性的融合子在pda、zr、lb培养基上的颜色均呈淡粉至粉红色，表面光滑、粘稠。本发明制得的具有抑菌活性的融合子在pda培养基上湿润且无突起，在zr、lb培养基上不湿润且突起。(2)100×10的油镜、透射电镜观察结果如表2所示：表2具有抑菌活性的融合子、粘质沙雷氏菌、胶红酵母的菌体结构比较由表2可知，本发明制得的具有抑菌活性的融合子菌体呈圆形或椭圆形，直径2.5～5μm，增殖方式大多单极芽殖，无运动性，无鞭毛。(3)具有抑菌活性的融合子的各种氮源、碳源同化研究结果如表3所示：表3具有抑菌活性的融合子的各种氮源、碳源同化性质硫酸铵+硝酸钾+尿素-甘氨酸+柠檬酸(+)葡萄糖+蔗糖+乙醇+半乳糖+甘油(+)山梨醇-甲醇-肌醇-乳糖-表3中“+”表示阳性，“-”表示阴性，“(+)”表示迟缓阳性。由表3可知，本发明制得的具有抑菌活性的融合子在硫酸铵、葡萄糖、硝酸钾、蔗糖、甘氨酸、半乳糖、乙醇中同化性质表现为阳性，在尿素、山梨醇、甲醇、肌醇、乳糖中同化性质表现为阴性，在甘油和柠檬酸中同化性质表现为迟缓阳性。试验例4、具有抑菌活性的融合子的抑菌谱1.试验材料：实施例3制备的具有抑菌活性的融合子。2.试验方法：将实施例3制备的具有抑菌活性的融合子制成发酵液浸膏，取10mg制得的发酵液浸膏并将其溶解于1ml质量浓度为30％的乙醇中，制得混合液，用质量浓度为30％的乙醇分别将上述混合液稀释为5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml三个不同浓度梯度，用质量浓度为30％的乙醇做空白对照，分别使用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、白色念珠菌、土曲霉作为受试菌，采用滤纸片法，测量并记录抑菌圈直径大小。3.试验结果：具有抑菌活性的融合子对不同致病菌的抑制作用如表4所示。表4具有抑菌活性的融合子对不同致病菌的抑制作用注：“-”表示没有抑菌圈由表4可知，本发明制得的具有抑菌活性的融合子对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌具有较强的抑菌作用，且其抑菌作用随发酵液浸膏浓度增大而增强，由此说明本发明提供的具有抑菌活性的融合子，在生物农药、抗菌药物筛选、遗传学等领域具有潜在应用价值。当前第1页12