焦磷酸测序法检测TOLLIP基因分型的引物对及试剂盒的制作方法

本发明涉及体外核酸检测
技术领域：
，尤其涉及焦磷酸测序领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测tollip基因分型的引物对及试剂盒。
背景技术：
：特发性肺纤维化(ipf)是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病，病变局限在肺脏，好发于中老年人群，其肺组织学和/或胸部高分辨率ct(hrct)特征性表现为普通型间质性肺炎(uip)，病因不清。按病程有急性、亚急性和慢性之分，多为散发，据统计，每年整体人群中的患病率约(2-29)/10万，且呈逐渐增长趋势，估计以每年11％的比例增长。在美国特发性肺纤维化患者大约有100000人，欧盟地区大约有110000人，而且每年欧盟地区新增ipf患者35000人。日本每年整体人群中的ipf患病率约(2.23-10)/10万，实际值远高于这个数目。作为一种慢性间质性肺病，ipf起病隐匿、病情逐渐加重，也可表现为急性加重。ipf诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，ipf被称为一种“类肿瘤疾病”。其中位生存期只有3年，生存率类似于许多癌症，预后差且缺乏有效的治疗。目前，除肺移植外，尚无证据证实哪一种药物能够有效的治疗ipf，有少数研究提示某些药物对ipf患者可能有益。近年来，大规模的全基因组关联研究已经强调出基因多态性的重要性，tollip基因已经证实与ipf易感性和生存有关。具研究标明tollip(rs3750920)tt基因型患者与安慰剂组相比改善生存，cc基因型患者nac治疗较差，ct基因型与安慰剂组患者生存区间相似。焦磷酸测序(pyrosequencing)是基于聚合原理的dna测序法，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。现有技术中并没有利用焦磷酸测序技术检测tollip基因分型的产品，而其他的检测方法灵敏度和特异性均不高，在检测tollip基因分型时不能够快速准确的进行检测，且成本较高。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种焦磷酸测序法对tollip基因分型进行检测的引物对以及试剂盒，能够快速准确的检测tollip的基因分型，成本低，灵敏度高，针对tollip的特异性强。本发明的一方面提供了一种焦磷酸测序法检测tollip基因分型的引物对，所述引物对包括：tollip正向扩增引物：5’-gcgtaggacatgacgaggtt-3’(seqidno.1)；tollip反向扩增引物：5’-agccctgttccacagataagac-3’(seqidno.2)；tollip测序引物：5’-gcctggacccacatcacc-3’(seqidno.3)；其中，所述tollip正向扩增引物和反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记。本发明的另一方面提供了一种焦磷酸测序法检测tollip基因分型的试剂盒，所述tollip基因检测的多态性位点为rs3750920，所述试剂盒包括pcr反应液；所述pcr反应液包括:tollip正向扩增引物：5’-gcgtaggacatgacgaggtt-3’；tollip测序引物：5’-gcctggacccacatcacc-3’；tollip反向扩增引物：5’-agccctgttccacagataagac-3’；其中，所述tollip正向扩增引物和反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记。作为优选技术方案，所述试剂盒还包括tollip阳性对照品，tollip阳性对照品1为插有seqidno.4所示核苷酸序列的tollip野生纯合子质粒；tollip阳性对照品2为插有seqidno.5所示核苷酸序列的tollip突变纯合子质粒；tollip阳性对照品3为tollip野生纯合子质粒和突变纯合子质粒组成的混合物；其中，质粒载体为pmd18-t，所述tollip阳性对照品3中，tollip野生纯合子质粒和tollip突变纯合子质粒的数量比为1:1。作为优选技术方案，所述试剂盒还包括质控品和空白对照品，所述质控品的controloligo为自带测序引物，序列为：tayggtttgca(seqidno.6)；空白对照品为dnase/rnase-free水。本发明的再一方面提供了上述引物对在制备用于检测tollip基因分型的试剂中的应用。本发明的又一方面提供了应用上述试剂盒检测tollip基因多态性的方法，包括如下步骤：(1)dna提取；(2)聚合酶链反应：配制50μlpcr扩增体系，包含：10×pcrbuffer8.0μl，dntp5.0μl，tollip正向扩增引物0.5μl，tollip反向扩增引物0.5μl，rtaq0.5μl，水33.5μl，模板2.0μl；循环程序为：95℃5min预变性；依次在95℃30s，57℃30s，72℃45s，进行35个循环；72℃保持3min，最终保持在4℃，得扩增产物；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。相比于现有技术，本发明的有益效果在于，1、本发明通过设计特异性高的引物，并且选择了合适的方法，试剂盒适用于对tollip基因多态性进行快速检测，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；2、本发明的焦磷酸测序法检测tollip基因分型的试剂盒进行检测，样品处理简单，测序步骤简单，测序速度快，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点频率分析，结果直观；3、本发明的试剂盒针对tollip基因特异性高，可以快速、准确地进行短dna序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；pcr产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。附图说明图1为临床样品tollip野生型的焦磷酸测序图；图2为临床样品tollip突变纯合型的焦磷酸测序图；图3为临床样品tollip突变杂合型的焦磷酸测序图；图4为质控品的焦磷酸测序图；图5为空白对照品的焦磷酸测序图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1试剂盒的制备1、引物设计tollip正向扩增引物：5’-gcgtaggacatgacgaggtt-3’(seqidno.1)，tollip反向扩增引物：5’-agccctgttccacagataagac-3’(seqidno.2)，tollip测序引物：5’-gcctggacccacatcacc-3’(seqidno.3)；其中，所述tollip正向扩增引物和反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记。2、对照品的选择人工合成寡聚核苷酸链tayggtttgcacontrololigo为质控品3、pcr反应液组成：10×pcrbuffer8.0μl，dntp5μl，水33.5μl。实施例2应用上述试剂盒检测tollip基因多态性的方法1、样品检测取pcr反应液，加入溶好的引物、taqdna聚合酶，分装体系，加入样品dna、空白对照品或阳性对照品为模板，组成pcr反应体系。按照pcr反应程序进行pcr扩增。tollip检测体系各主要成分分别如下：pcr反应液：10×pcrbuffer8.0μl，dntp5μl，水33.5μl；tollip正、反向扩增引物各0.5μl；taq酶0.5μl；检测样品2μl；总体积50μl。该体系反应程序如下：扩增完成之后，琼脂糖凝胶检验pcr结果，以进行下一步程序。2、焦磷酸测序按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备和纯化，然后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的mix中上机测序。焦磷酸测序仪试剂仓中加入运行程序相应的datp、dttp、dctp、dgtp、酶混合物、底物混合物。质控品controloligo自带测序引物，最终浓度为0.2μm。3、结果分析质控品碱基检出率为100％；空白对照品检测不到碱基频率。结果如图1-5所示，样品结果的判断标准如下：样品检测结果报告结果1tollip(c≧90％，t≦10％)野生型2tollip(40％≦c≦60％，40％≦t≦60％)杂合突变型3tollip(t≧90％，c≦10％)纯合突变型其中，图1显示的是临床样本检测结果tollip的野生型；图2显示的是临床样本检测结果tollip的杂合突变型；图3显示的是临床样本检测结果tollip的纯合突变型；图4显示的是质控品的焦磷酸测序图；图5显示的是空白对照的焦磷酸测序图，综上，应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测tollip基因型，能够满足临床检验实际工作的要求。序列表<110>山东百茂生物科技有限公司<120>焦磷酸测序法检测tollip基因分型的引物对及试剂盒<130>p1170451<141>2017-08-28<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcgtaggacatgacgaggtt20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agccctgttccacagataagac22<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcctggacccacatcacc18<210>4<211>125<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcgtaggacatgacgaggttgatcatgccctccttgtcgtccccctgcctcccgctcagg60ctgtaccacttgtcctccaccttgccctgcctcagggactccgggatggtgatgtgggtc120caggc125<210>5<211>125<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcgtaggacatgacgaggttgatcatgccctccttgtcgtccccctgcctcccgctcagg60ctgtaccacttgtcctccaccttgccctgcctcagggactctgggatggtgatgtgggtc120caggc125<210>6<211>11<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tayggtttgca11当前第1页12