检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增方法的引物组与流程

本发明涉及一种用于检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增反应的引物组，属于动物传染病学检测领域。

背景技术：

猪圆环病毒(porcinecircoviruses，pcv)是单股环状的dna病毒，基因组长度约为1.7kb长，是最小的动物dna病毒之一。已经确定有两种类型的pcv，即圆环病毒1型(pcv1)和圆环病毒2型(pcv2)。pcv1于1974年首次在pk细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。pcv2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(porcinecircovirusassociateddiseases，pcvad)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征，肺炎、猪皮炎、肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。2016年，一种新型的圆环病毒3型病毒（猪圆环病毒3型，porcinecircovirus3，pcv3）首先在美国报道，该病毒基因组长为2.0kb，其能引起猪的皮炎肾病终合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，对猪场疾病控制十分重要。临床调查研究，发现pcv3和猪只繁殖障碍等疾病相关。大范围的检测发现，该病原可以在我国的八个省以及一个直辖市可以检测到，因此，还需要对我国pcv3感染情况进行全面的调查。通过对pcv3毒株全基因组和其部分基因的遗传进化研究发现，pcv3与pcv1和pcv2处于不同的进化分支，属于新型的猪圆环病毒（即pcv3）。结果还表明，我国pcv3毒株和美国pcv3毒株同源进化关系很近，表明这些毒株可能有相同的进化来源。目前，关于pcv3的致病性的研究较小，致病机理还未见明确。所以，建立一种简单实用的检测方法对pcv3的防控有着重要意义。

目前，在对新鉴定的传染病病原的检测方法主要是基于核酸水平的检测，如pcr方法、实时荧光定量pcr方法（realtimepcr）和环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)反应等方法。但是普通的pcr方法以及灵敏度更高的荧光定量pcr方法，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。环介导等温扩增方法可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。该方法特异性强，灵敏度较pcr方法高，无需pcr仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度（60℃-65℃）。大大降低了检测的费用，特别适合基层和现地使用。目前，还未见针对环介导等温扩增(lamp)反应方法，但该属其他类型病毒如pcv1和pcv2均已经有相应的lamp检测方法。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增反应的引物组。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

所述检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增方法的引物组，是由一对外引物和一对内引物组成，其中所述的外引物由f3和b3，内引物由fip和bip组成。上述2对引物的序列如下：

f3：5’-ggcagtggatgatgaagcg-3’，

b3：5’-tgcctccacactccacaat-3’，

fip：5’-tcaggacactcgtagcaccaca-tcgtgttttgatgccgcag-3’，

bip：5’-ttctaggtccggagggaaagcc-ggggtccagttgtttatcgt-3’。

25μl反应体系中含有：2×反应液12.5μl、bstdna大片段聚合酶1μl、f3和b3（浓度为5pmol）各1μl、fip和bip（浓度为40pmol）各1μl、模板2μl、loopamp试剂1μl，补充灭菌去离子水至终体积25μl。

本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应的引物组在制备猪圆环病毒3型快速诊断试剂中的用途。

本发明优点在于：本发明根据猪圆环病毒3型基因组中复制相关蛋白ns基因序列特征，设计特异性的lamp引物，根据所设计的lamp引物，建立一种检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增方法。该方法不与猪其他常见传染病发生非特异性反应，本方法特异性强，准确度高，适用性好。敏感性实验表明，本发明所建立的检测方法能在60min内检测出76ng/μl的病毒核酸。lamp反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定，这极大的降低了污染的可能性，提高该方法的现地使用性。

附图说明

图1为猪圆环病毒3型lamp特异性实验，其中1：猪圆环病毒3型（pcv3）；2：猪细小病毒（ppv）；3：猪圆环病毒1型（pcv1）；4：猪圆环病毒2型（pcv2）；5：猪伪狂犬病毒（prv）；6：猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）；7：猪瘟病毒（csfv）；8：阴性对照。

图2为猪圆环病毒3型lamp方法敏感性实验。其中m：dna分子量标准；1：7.6×10⁴ng/μl；2：7.6×10³ng/μl；3：7.6×10²ng/μl；4：76ng/μl；5：7.6ng/μl；6：阴性对照。

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

实施例1

一、实验方法和步骤

1.1、lamp实验引物的设计

根据genbank中登录的所有猪圆环病毒3型基因序列和本研究室从我省（福建省）现地猪场中检测到的猪圆环病毒3型基因组序列，利用分子生物学软件进行分析比较，选择猪圆环病毒3型（genbank登录号kt869077）基因组保守区域片段，利用lamp引物设计的在线网站(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计引物，包括外引物1对和内引物1对，具体序列见seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4。

1.2、毒株

猪细小病毒（ppv）、猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）、猪伪狂犬病毒（prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）和猪瘟病毒（csfv）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。猪圆环病毒3型阳性dna由我省（福建省）猪场检测为阳性的病料提取核酸dna后保存。

1.3、病毒核酸的提取

用北京全式金生物技术有限公司的easypureviraldna/rnakit按照说明书方法进行操作提取猪圆环病毒3型阳性病料的dna，并按照试剂盒的方法同时提取猪细小病毒（ppv）、猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）、猪伪狂犬病毒（prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）和猪瘟病毒（csfv）基因组核酸，均放置－20℃保存备用。

1.4、lamp的体系的建立

按照环介导等温扩增法dna扩增试剂盒（slp204laoopampdna扩增反应试剂盒）配置lamp试验反应液，反应体系为25μl。每25μl反应体系中含有：2×反应液12.5μl、bstdna大片段聚合酶1μl、f3和b3（浓度为5pmol）各1μl、fip和bip（浓度为40pmol）各1μl、以提取的猪圆环病毒3型阳性标准品为模板2μl、loopamp试剂1μl，补充灭菌去离子水至终体积25μl。实验不同温度（60℃、62℃、64℃、66℃）、不同时间（30min、45min、60min、75min）检测引物组反应性能。优化后的反应条件为62℃反应60min。

1.5特异性实验

取猪细小病毒（ppv）、猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）和猪伪狂犬病毒（prv）提取的dna；取猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）和猪瘟病毒（csfv）提取rna后反转录的cdna，分别为模板进行lamp反应，并重复实验操作一次。以去离子水为试验阴性对照。

1.6、敏感性试验

以提取的猪圆环病毒3型阳性标准品（倍比稀释，浓度分别为7.6×10⁴～7.6×10⁰ng/μl）为模板，进行lamp反应，确定检测敏感度。并重复实验操作3次。

1.7、临床样品的检测

对本研究室收集的62份猪组织病料按照步骤1.4中的方法提取dna后，进行lamp检测。

二、实验结果

2.1肉眼判定

猪细小病毒（ppv）、猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）和猪伪狂犬病毒（prv）提取的dna；取猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）和猪瘟病毒（csfv）提取rna后反转录的cdna按照本发明建立的lamp方法检测均为阴性，而对猪圆环病毒3型阳性dna有很好的扩增，本结果在自然光条件下可以见到的通过明显的颜色区别进行判定（见图1），表明建立的lamp方法具有很好的特异性。

2.2敏感性试验的电泳判定

反应结束后，利用2%普通琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见pcv3的浓度在7.6×10¹ng/μl（见图2第4泳道）时为最低检测限；在7.6×10⁴ng/μl、在7.6×10³ng/μl、在7.6×10²ng/μl和在7.6×10¹ng/μl（即76ng/μl）均可见有不连续梯状电泳条带，即本发明的最低检测限为76ng/μl的病毒核酸。

2.3临床样品的检测

对本研究室收集的62份猪组织病料进行lamp检测，结果可见有阳性样品13份，阳性率为20.96%（13/62）。将lamp阳性样品和文献——anovelporcinecircovirusdistantlyrelatedtoknowncircovirusesisassociatedwithporcinedermatitisandnephropathysyndromeandreproductivefailure（palinskir,piñeyrop,shangp,yuanf,guor,fangy,byerse,hausebm.发表于jvirol.2016dec16;91(1).pii:e01879-16.）中的pcr检测引物序列（上游引物5′-ccacagaaggcgctatgtc-3′和下游引物5′-ccgcataagggtcgtcttg-3′）（预期片段大小为330bp）中的pcr方法进行对比，13份lamp阳性样品经常规pcr检测均为阳性，符合率为100%。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增方法的引物组

<130>6

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggcagtggatgatgaagcg19

<210>2

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<213>人工序列

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