青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株、构建方法及应用与流程

本发明涉及肿瘤免疫学和光学成像技术领域，具体涉及一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株、构建方法及应用。

背景技术：

近年来，肿瘤免疫治疗已经成为癌症治疗研究中最为热门的领域，并被公认为是最有可能攻克癌症的治疗方法。对于肿瘤免疫过程中在什么时间以及地点发生了哪些细胞分子事件，目前依然知之甚少，而不断发展的光学成像技术具有高灵敏度、高时间与空间分辨率、多参数检测和低损伤等特点(参见骆清铭,张智红.光学学报,2011,31(9):119-125.)，在肿瘤免疫学研究中发挥了巨大潜能，它能够对肿瘤免疫过程中肿瘤细胞与免疫细胞之间的作用过程提供直观可视化动态信息。荧光蛋白的出现为光学显微成像提供了十分有力的工具，显微光学成像结合荧光蛋白标记的肿瘤细胞株以及转基因动物模型，使得活体光学显微成像观察多色标记的肿瘤微环境成为可能。

对于表达荧光蛋白的肿瘤细胞及其应用上，早在1997年，hoffman实验室第一次将筛选出稳定表达gfp荧光蛋白的肿瘤细胞株，并将该肿瘤细胞株接种到小鼠体内，建立了多种荧光蛋白标记的荷瘤鼠模型(参见chishimat,miyagiy,wangx,etal.cancerresearch(1997)57(10):2042.)。2003年mengyang博士等人也曾将表达rfp的肿瘤细胞株种植到gfp标记全身细胞的转基因裸鼠上，实现了肿瘤微环境的双色标记(参见yangm.,lil.,jiangp.,etal.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofameric(2003)100(24):14259-14262)。目前对于肿瘤细胞的荧光蛋白标记还主要集中在绿色荧光(gfp)以及红色荧光(rfp)(参见hoffmanr.m.,yangm.natureprotocols(2006)1(2):928-935)，这两类荧光蛋白的亮度均比较好，在研究肿瘤免疫的光学分子成像过程应用广泛。

为便于对肿瘤微环境进行成像，除了会用到各种荧光蛋白标记的肿瘤细胞株之外，还会用到多种荧光蛋白标记免疫细胞的转基因小鼠。目前存在的较为常见的荧光蛋白标记免疫细胞的转基因小鼠，如cx3cr1-gfp、cxcr6-egfp、foxp3-mrfp等是以表达gfp和rfp居多，限制了荧光蛋白标记的肿瘤细胞与转基因小鼠的配合使用，在实现多色观察肿瘤免疫微环境的过程中存在一定的局限性。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株、构建方法及应用，获取青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，实现的青色荧光蛋白标记肿瘤细胞株在肿瘤免疫光学研究中的各种可视化应用。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，所述肿瘤细胞株通过青色荧光蛋白质粒稳定转染肿瘤细胞株构建。

本发明还公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：

s1，采用pcdna3.1为质粒载体制得表达青色荧光蛋白的质粒；使用表达青色荧光蛋白的质粒对肿瘤细胞株进行转染；

s2，通过g418完全培养基对细胞进行培养筛选制得青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株。

本发明还公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的应用，所述青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于在体外与特异性ctl进行共孵育，以观察特异性ctl对肿瘤细胞的杀伤全过程。

在上述技术方案的基础上，所述肿瘤细胞株为b16肿瘤细胞株。

在上述技术方案的基础上，所述青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株还用于注射到多种荧光蛋白标记免疫细胞的动物皮窗中，并联合dir-boa荧光染料标记血管，以活体动态观察肿瘤微环境中的肿瘤细胞与免疫细胞。

在上述技术方案的基础上，所述青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株还用于注射到动物皮窗中，以观察采用肿瘤治疗方案后的肿瘤治疗效果。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明通过青色荧光蛋白转染和g418药物筛选，获取青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，从而实现青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株在肿瘤免疫光学研究中的应用，如实现通过显微光学成像对ctl对肿瘤细胞杀伤全过程进行观察研究，或在体内实现对肿瘤微环境的多色标记和显微动态成像，或在肿瘤治疗过程中实现对肿瘤微环境中的肿瘤细胞和多种免疫细胞以及血管之间的相关作用进行实时动态光学成像观察，进而可以实现对多种肿瘤免疫治疗方案进行长时程活体动态成像的直观评估，克服了常规gfp、rfp荧光蛋白标记在肿瘤多色光学成像研究中的局限性。

附图说明

图1为青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法的流程示意图；

图2为表达青色荧光蛋白的质粒构建图；

图3为青色荧光蛋白标记的b16肿瘤细胞株的光学成像图；

图4为共聚焦显微成像观察ctl对cfp-b16肿瘤细胞的动态杀伤过程图；

图5为c57bl/6小鼠皮下接种cfp-b16肿瘤细胞后在不同治疗方案下的肿瘤体积生长变化曲线图；

图6为egfp转基因c57bl/6小鼠皮窗接种cfp-b16肿瘤细胞后，在ctx-act联合免疫治疗过程中，肿瘤微环境的肿瘤细胞与宿主免疫细胞的空间分布和相互作用的大视场显微光学成像图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株

本发明实施例提供一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株：肿瘤细胞株通过青色荧光蛋白质粒稳定转染肿瘤细胞株构建。其中，青色荧光蛋白，英文全称为cyanfluorescentprotein，简称为cfp。

实施例2：青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法

参见图1所示，本发明实施例还公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：

s1，采用pcdna3.1为质粒载体制得表达青色荧光蛋白的质粒，参见图2所示；使用表达青色荧光蛋白的质粒对肿瘤细胞株进行转染；

s2，通过g418完全培养基对细胞进行培养筛选制得青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株。

实施例3：青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的应用

本发明实施例还公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的应用，肿瘤细胞株为b16肿瘤细胞株，青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于在体外与特异性ctl进行共孵育，以观察特异性ctl对肿瘤细胞的杀伤全过程。

青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于注射到多种荧光蛋白标记免疫细胞的动物皮窗中，并联合dir-boa荧光染料标记血管，以活体动态观察肿瘤微环境中的肿瘤细胞与免疫细胞。

青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于注射到动物皮窗中，以观察采用肿瘤治疗方案后的肿瘤治疗效果。

实施例4：cfp-b16肿瘤细胞株的筛选和光学成像

为了对cfp-b16进行光学成像，首先要获得能稳定表达青色荧光蛋白的b16黑色素瘤细胞株，简称cfp-b16：

(1)用pcdna3.1-cfp荧光蛋白质粒对b16细胞株进行转染；

(2)转染24h后，使用荧光显微镜观察每孔细胞的发光情况，确定转染效率，将细胞消化并稀释到96孔板，每孔10个细胞左右，使用含1mg/ml浓度的g418完全培养基对细胞进行培养，在荧光显微镜观察是否有稳定发光的细胞团；

(3)约一个星期左右可以看到有发光的细胞团，不发光的细胞大量死亡，将发光的细胞团再次消化稀释到96孔板中，每孔保持2-3个细胞，并继续用含g418的完全培养基进行培养；

(4)使用ix71荧光显微镜每天观察细胞生长发光状况，继续使用g418完全培养基进行培养，每隔2-3天左右换一次液；

(5)重复上述步骤三个星期左右，基本可以得到一个孔里面的细胞只有一团稳定发光的细胞，并且该孔细胞的荧光蛋白表达稳定，发光率高于90％；

(6)获得发光率在90％以上的cfp-b16细胞后，就可以进行扩大培养。

在获得稳定表达cfp的b16肿瘤细胞株后，在共聚焦显微镜下对获得的cfp-b16细胞株进行光学成像观察，得到如图3所示的cfp-b16成像结果，最左侧荧光图的荧光信号和中间明场图的细胞基本都能重合成最右侧的叠加图中。

实施例5：成像观察ctl对cfp-b16肿瘤细胞的动态杀伤全过程

(1)取生长状态良好的cfp-b16细胞进行消化处理；

(2)将cfp-b16细胞悬液用完全培养基调整密度到5×10⁵个/ml，每个共聚焦小皿中加入100μl细胞悬液，静置5min，然后放到37c细胞培养箱中过夜培养；

(3)将体外培养5天的ctl，使用小鼠淋巴细胞分离液进行分离，以获得高活率的ctl；

(4)将ctl细胞悬液中加入cfse染料进行染色，混匀后37c避光孵育10min，用完全培养基终止反应，冰上放置5min；

(5)1400rpm离心10min后，用完全培养基将cfse染色的ctl重悬，并根据需要调整细胞密度；

(6)将cfse染色后的ctl分别加入到提前铺有cfp-b16细胞的共聚焦小皿中；

(7)如图4，标尺：30μm，箭头所指为cfp-b16细胞，cfp-b16细胞周围的为ctl，使用共聚焦显微镜观察ctl对cfp-b16肿瘤细胞动态杀伤的全过程。当ctl加入到肿瘤细胞共培养1h后，大量ctl聚集到一个或者一团cfp-b16肿瘤细胞周围，与肿瘤细胞长时间相互接触，接触一段时间后，肿瘤细胞开始膨胀，其中有1-2个肿瘤细胞的荧光逐渐消失，其他肿瘤细胞的荧光信号下降，提示肿瘤细胞内正发生着剧烈的变化。随着ctl与肿瘤细胞作用时间越来越长，其他肿瘤细胞开始接连“膨胀”，最后都在瞬间“破裂”，荧光蛋白泄漏，由此导致肿瘤细胞内的荧光信号迅速消失，提示肿瘤细胞已经被杀死。

实施例6：dc-venus和foxp3-mrfp杂交c57bl/6小鼠皮窗中接种cfp-b16肿瘤细胞后的多色大视场显微光学成像

(1)将cd11c-yfp小鼠和foxp3-mrfp小鼠进行杂交，获得2色标记免疫细胞的杂交小鼠dc-yfp×foxp3-mrfp；

(2)对杂交小鼠dc-yfp×foxp3-mrfp进行皮窗手术24h后，待其状况恢复正常，在小鼠皮窗中进行皮下接种5×10⁵个cfp-b16肿瘤细胞，根据需要还可以从小鼠尾静脉注入dir-boa荧光染料对肿瘤微环境的血管进行标记，从而实现对复杂的肿瘤微环境进行多色标记；

(3)在接种了cfp-b16肿瘤细胞后第4天开始每天进行活体显微成像，观察肿瘤微环境多种免疫细胞的募集、分布和时空变化情况；

(4)将需要活体成像的小鼠用麻醉呼吸机进行麻醉，将麻醉后的小鼠固定在37c加热垫上；

(5)将加热垫固定在活体成像显微镜的载物台上，对皮窗荷瘤小鼠的肿瘤微环境进行显微成像；

(6)使用大视野显微成像的方法可以清楚地观察多种免疫细胞以及肿瘤细胞在肿瘤微环境的空间分布情况。通过cfp-b16肿瘤细胞的接种，我们实现了对肿瘤微环境青色荧光蛋白(cfp)标记的黑色素肿瘤细胞，近红外染料(dir-boa)标记的血管，红色荧光蛋白(mrfp)标记的treg和黄色荧光蛋白(yfp)标记的dc的同步多色动态显微成像。通过成像我们可以很清楚的发现在实体肿瘤中分布有大量的血管，且血管组织呈现较为规律的分布，肿瘤的周围还分布有大量的treg细胞以及dc细胞，共同构成复杂的肿瘤微环境。

实施例7：c57bl/6小鼠皮下接种cfp-b16肿瘤细胞后在不同治疗方案下的肿瘤体积生长变化

分离高活率ctl，对荷瘤小鼠进行过继免疫治疗：

(1)消化对数期的cfp-b16细胞，用pbs重悬细胞；

(2)对普通c57bl/6小鼠进行麻醉和脱毛；

(3)给小鼠接种cfp-b16肿瘤细胞，每只鼠腿根部皮下接种5×10⁵个细胞；

(4)在小鼠皮下接种cfp-b16肿瘤细胞1天后，开始体外培养ctl，体外诱导培养5天后获得高杀伤活性的ctl，将体外培养5天的ctl，用小鼠淋巴细胞分离液进行分离，以获得高活率的ctl；

(5)调整ctl悬液密度，每只鼠回输5×10⁶个ctl；

(6)对荷瘤鼠尾静脉回输ctl治疗(为了方便描述，后文中简称为act治疗)；

(7)对照组回输相同体积的pbs，治疗前一天(接种cfp-b16肿瘤细胞后第5天)开始使用游标卡尺来测定肿瘤体积，每隔2天测一次。

环磷酰胺(ctx)和act对黑色素瘤进行联合免疫治疗：

(1)c57bl/6小鼠皮下接种cfp-b16肿瘤细胞；

(2)接种肿瘤细胞后第4天，配置ctx溶液(15mg/ml)，过滤除菌后，荷瘤小鼠腹腔注射给药，每只小鼠给药剂量为150mg/kg；

(3)接种肿瘤细胞后第6天(ctx给药后第2天)，收集体外诱导培养的ctl，对一部分荷瘤鼠进行act治疗；

(4)接种肿瘤细胞后第5天开始测定肿瘤体积，每隔2天测一次。

如图5所示，与act单独治疗组相比，ctx-act联合治疗b16黑色素可以有效地控制肿瘤的生长。ctx是临床上常用的一种肿瘤化疗药物，低剂量的ctx可以有效清除荷瘤鼠体内大部分treg，从而抑制treg聚集到肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用，促进act治疗的抗肿瘤疗效，起到很好的肿瘤抑制效果。

实施例8：egfp转基因小鼠皮窗接种cfp-b16肿瘤细胞后，在ctx-act联合免疫治疗过程中，肿瘤微环境的肿瘤细胞与宿主免疫细胞的空间分布和相互作用的大视场显微光学成像

类似实施例7中的ctx-act治疗的小鼠背部皮窗实验步骤，先对egfp小鼠进行背部皮窗实验，并接种cfp-b16。对b16黑色素瘤进行时间间隔为5天的三轮ctx-act节拍联合治疗以便激活内源性浸润的免疫细胞(tumorinfiltratingimmunocytes,tiis)在肿瘤区域的活性，从而使肿瘤微环境中抗肿瘤的免疫效应一直维持在活跃状态，以便对b16黑色素瘤的生长更好地进行控制。

如图6所示，用虚线框起来的部分是cfp-b16肿瘤区域，肿瘤周围较亮的区域是egfp宿主细胞，通过活体成像对三轮节拍治疗的肿瘤微环境进行长达三周的观察发现，当第一轮治疗结束几天后，激活的免疫细胞逐渐衰竭，无法控制肿瘤的生长，肿瘤开始有继续生长的趋势；这时第二轮治疗就开始实施，继续激活免疫细胞产生抗肿瘤效应，有效地控制肿瘤的生长；几天之后，当这一批被激活的免疫细胞再次衰竭，肿瘤再次有继续生长的趋势，第三轮治疗又开始了。这个成像结果直观地展示了机体的免疫系统与肿瘤进行着持续焦灼的“战争”。

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。