一种识别QSG‑7701内Hg2+的咪唑并邻菲啰啉荧光探针及其制备方法与流程

本发明涉及一种能识别qsg-7701细胞内hg²⁺的2-（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲啰啉荧光探针及其制备方法，属于金属离子的荧光探针领域。

背景技术：

汞广泛的存在于各类的环境中，是人体非必需的剧毒重金属元素。在自然环境中它微量存在于空气、土壤、水中，但是由于工业化的发展在自然环境中汞与其氧化物逐渐进入了各种环境介质和生物链，在人们的日常生活中与其接触的增多。当汞进入人体后能够在体内蓄积，造成慢性汞中毒，对人体具有非常大的危害。多篇文献报道汞离子进入体内以后会在肝、脑等部位蓄积，造成肝衰竭、脑神经衰竭的症状。qsg-7701细胞是从人正常肝组织提取分离出来的，人体在正常的生活环境内会接触汞及其氧化物在体内蓄积去肝、脑等部位，在人们未发现的情况下对机体缓慢的破坏，其危害较大，多数病例都是在病症出现以后才被发现，其危害甚大，具有潜伏性的特点，如果不及时治疗，会对生命安全产生威胁。因此要及时检测正常人肝细胞qsg-7701细胞中的hg²⁺，使用高灵敏技术对hg²⁺进行微量和快速检测，对于能够及早地发现剧毒元素汞在人体内蓄积的情况。

目前常用于检测生物体内hg²⁺蓄积细胞情况的分析检测方法目前主要是利用hg²⁺和指示剂(也可称为化学分子探针)之间的特异性化学反应或超分子作用产生的信号变化来对hg²⁺进行分析检测，这些荧光探针分子对hg²⁺有高选择性以及较高的灵敏度。因此制备一种荧光探针分子用来检测qsg-7701细胞中的hg²⁺，使用高灵敏技术对其进行微量和快速检测，对于能够及早地发现以及监测汞在人体肝组织细胞中的蓄积情况显得尤为重要。

本发明提供了一种能够识别qsg-7701细胞内hg²⁺的荧光探针2-（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲啰啉化合物及其制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的是一种能识别qsg-7701细胞内hg²⁺的2-（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲啰啉荧光探针及其制备方法。本发明提供的荧光探针对qsg-7701细胞内hg²⁺的识别结果准确，灵敏度高。

本发明提供的能够识别qsg-7701细胞内hg²⁺的2-（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲啰啉化合物的荧光探针，具有式(i)所示

（i）

本发明还提供了一种能识别qsg-7701细胞内hg²⁺的2-（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲啰啉荧光探针的制备方法。更详细地说是以1,10-菲啰啉为原料，合成出中间体1,10-菲啰啉-5,6-二酮，然后中间体与4-硝基苯甲醛合成2-（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲啰啉化合物。

实现本发明的技术方案如下：

反应步骤如下：

（1）将1,10-菲啰啉、二氧化锡、浓硫酸、浓硝酸混合物加热回流后，反应结束后得到粗产物，经重结晶得到纯的化合物（ⅱ），为黄色固体。

（2）将化合物（ⅱ）与4-硝基苯甲醛、氯化铵溶于盐酸中加热回流，反应后经柱层析得到化合物（i），为黄色针状晶体。

根据本发明，优选的，步骤（1）所述的1,10-菲啰啉、二氧化锡的的摩尔比为1:3；

根据本发明，优选的，步骤（2）所述的化合物（ⅱ）1,10-菲罗啉-5,6-二酮、4-硝基苯甲醛的的摩尔比为1:2；

根据本发明，优选的，步骤（1）所述的反应温度为100-140℃，更优选为110-130℃；

根据本发明，优选的，步骤（2）所述的反应温度为100-120℃，更优选为100-110℃；

更为详细的，所述的能够识别qsg-7701细胞内hg²⁺的2-（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲啰啉荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）称取1,10-菲啰啉3.600g，二氧化锡4.500g，于烧瓶中混合均匀，将20ml浓硫酸，10ml浓硝酸混合，冰水浴冷却形成冷却的混合酸。沿烧瓶壁缓慢滴加冷却的混合酸，滴加完毕，加热回流，瓶内逐渐生成红棕色气体。停止加热，得到红棕色透明溶液；把红棕色透明溶液倒入至冰水中，用naoh缓慢中和酸，直到反应混合物的ph=7，此过程生成较多黄色絮状沉淀，抽滤得黄色沉淀，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，水洗两次，合并有机相，有机相旋转蒸干得黄色粉末为化合物（ⅱ），甲醇重结晶烘干，产率90%。

（2）称取化合物（ⅱ）1,10-菲啰啉-5,6-二酮0.2100g，氯化铵0.1060g，4-硝基苯甲醛0.3020g，分别加入到圆底烧瓶中，用盐酸溶解，磁力搅拌下油浴加热回流反应；溶液由黄色变为红棕色，冷却至室温，反应液倒入冰水中，再缓慢滴加氨水，中和酸直至ph=7，此过程中有大量淡黄色沉淀产生，抽滤，干燥滤饼至恒重得粗产品，粗产品用硅胶柱层析，得到淡黄色针状晶体为化合物（i），产率60％。

本发明的优点是：与现有技术相比，本发明提供了一种能够识别qsg-7701细胞内hg²⁺的荧光探针2-（4-硝基苯基）咪唑并[5,6-f]邻菲啰啉化合物的制备方法，本发明提供的能够识别qsg-7701细胞内hg²⁺的荧光探针2-（4-硝基苯基）咪唑并[5,6-f]邻菲啰啉化合物具有式（i）的结构，本发明所述的2-（4-硝基苯基）咪唑并[5,6-f]邻菲啰啉荧光探针可以用于qsg-7701细胞内hg²⁺检测，对hg²⁺灵敏度高，响应值高；实验结果表明，本发明所述化合物作为荧光探针使用于qsg-7701细胞时，对hg²⁺有显著的响应；对于不同浓度的hg²⁺检测时呈良好的线性关系，在qsg-7701细胞内对hg²⁺有很好的选择性，染有化合物2-（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲啰啉的qsg-7701悬浮细胞经蓝光激发后，在显微镜中观察，细胞发出绿色荧光，检测方法可靠。

附图说明

图1为识别qsg-7701细胞内汞离子荧光探针2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉的紫外吸收谱图。

图1-1为识别qsg-7701细胞内汞离子荧光探针2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉的荧光光谱图。

图2为识别qsg-7701细胞内汞离子荧光探针2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉在450nm的激发波长下测定对于hg²⁺选择性的荧光光谱图。

图3为识别qsg-7701细胞内汞离子荧光探针2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉在450nm的激发波长下测定加入不同浓度的hg²⁺前后的荧光光谱图。

图4为qsg-7701悬浮细胞在汞离子荧光探针2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉溶液中培养2h前后的荧光激发对比图，图中：a为qsg-7701悬浮细胞未激发的图像；b为在有化合物2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉的qsg-7701悬浮细胞经蓝光激发后，在显微镜中观察，细胞发出微弱的绿色荧光；c为qsg-7701悬浮细胞在2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉和hg²⁺混合溶液中培养2小时后，染有2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉和hg²⁺的混合溶液的qsg-7701悬浮细胞经蓝光激发后细胞的荧光强度有增强。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：本实施例为根据所述式(i)结构化合物的反应流程制备的具体实施例。

（4-硝基苯基）咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉：称取1,10-菲啰啉3.600g，二氧化锡4.500g，于烧瓶中混合均匀，将20ml浓度为18mol•l^-1的浓硫酸，10ml浓度为14mol•l^-1的浓硝酸混合，冰水浴冷却形成冷却的混合酸。沿烧瓶壁缓慢滴加冷却的混合酸，滴加完毕，加热回流，瓶内逐渐生成红棕色气体。停止加热，得到红棕色透明溶液；把红棕色透明溶液倒入至冰水中，用naoh缓慢中和酸，直到反应混合物的ph=7，此过程生成较多黄色絮状沉淀，抽滤得黄色沉淀，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，水洗两次，合并有机相，有机相旋转蒸干得黄色粉末为化合物（ⅱ），甲醇重结晶烘干，产率90%。

称取化合物（ⅱ）1,10-菲啰啉-5,6-二酮0.2100g，氯化铵0.1060g，4-硝基苯甲醛0.3020g，分别加入到圆底烧瓶中，用20ml浓度为6mol•l^-1的盐酸溶解，磁力搅拌下油浴加热回流反应；溶液由黄色变为红棕色，冷却至室温，反应液倒入冰水中，再缓慢滴加氨水，中和酸直至ph=7，此过程中有大量淡黄色沉淀产生，抽滤，干燥滤饼至恒重得粗产品，粗产品用硅胶柱层析，得到淡黄色针状晶体为化合物（i），产率60％。

其核磁共振氢谱图数据为：

¹hnmr(100mhz,dmso-d6):7.45-7.85(m,6h),8.15(dd,2h),8.95(d,2h),13.10(s,nh)。

实施例2：实施例1制得的2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉荧光探针的紫外吸收谱图（见图1）和荧光光谱图（见图1-1）。

准确称取2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉，将其移入10ml容量瓶中，用无水乙醇溶解，待样品完全溶解后定容，配制成浓度1.0×10-5mol•l^-1的溶液，分别测定其紫外吸收光谱和荧光激发光谱。测定结果如图1、图1-1所示；图1为汞离子荧光探针2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉的紫外吸收光谱；图1-1为汞离子荧光探针2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉对于聚集有诱导发光效应检测的荧光光谱图。

从图1可以看出2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉的最大吸收波长在250nm处；从图1-1可以看出2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉的最大激发波长在450nm处。因此综合考虑决定化合物的激发波长为450nm。选择最大激发波长是为了获得高激发率的物质形态，提高灵敏度。

实施例3：实施例1制得的2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉荧光探针在450nm的激发波长下测定对于hg²⁺选择性。

准确称取2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉，溶于色谱纯无水乙醇中，配置成浓度为1.0×10^-4mol•l^-1的配体溶液中，分别选取10种不同金属离子（hg²⁺，al³⁺，ni²⁺，mn²⁺，cu²⁺，ag⁺，ca²⁺，k⁺，na⁺，li⁺），配成配体浓度1.0×10^-5mol•l^-1，金属离子浓度1.5×10^-4mol•l^-1的混合溶液，测定溶液荧光光谱的变化。测定结果如图2所示。

从图2可以看出，hg²⁺的荧光强度明显强于其它离子荧光强度，说明2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉荧光探针对hg²⁺有很高的选择性。

实施例4：实施例1制得的2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉荧光探针对不同浓度的hg²⁺的荧光检测。

准确称取2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉，溶于色谱纯无水乙醇中，配置成浓度为1.0×10^-4mol•l^-1的溶液，再分别按照浓度为0μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm加入hg²⁺，配成化合物浓度1.0×10^-5mol•l^-1，金属离子浓度分别为0、0.5×10^-5mol•l^-1、1×10^-4mol•l^-1、1.5×10^-4mol•l^-1、2×10^-4mol•l^-1、2.5×10^-4mol•l^-1、3×10^-4mol•l^-1、3.5×10^-4mol•l^-1、4×10^-4mol•l^-1、4.5×10^-4mol•l^-1的10瓶混合溶液，分别测定溶液荧光光谱的变化。测定结果如图3所示。

从图3看出加入不同浓度的hg²⁺，溶液的荧光光谱最大发射峰都不曾发生了蓝移或红移，而荧光强度随之有明显增强。随着金属离子浓度的升高，2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉的混合溶液荧光强度成上升趋势。

实施例5：qsg-7701悬浮细胞在实施例1制得的2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉溶液中培养2h前后的荧光激发对比。

将培养好的qsg-7701细胞置于配制好的2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉溶液中，浸泡二小时后用磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)洗三次，在倒置荧光显微镜下用蓝光激发，并照相。

将培养好的qsg-7701细胞置于配制好的2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉和金属离子的混合溶液中浸泡二小时后，取出用磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)洗三次，在倒置荧光显微镜下蓝光激发并照相。测定结果如图4所示。

从图4可以看出，图中a为qsg-7701悬浮细胞未激发的图像，与图中a相比，在有化合物2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉的qsg-7701悬浮细胞经蓝光激发后，在显微镜中观察，细胞发出微弱的绿色荧光(图中b)，而qsg-7701悬浮细胞在2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉和hg²⁺混合溶液中培养2小时后，染有2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉和hg²⁺的混合溶液的qsg-7701悬浮细胞经蓝光激发后细胞的荧光强度有增强（图中c）。从而可以说明2-(4-硝基苯基)咪唑并[5，6-f]邻菲罗啉可以特异性识别qsg-7701细胞中的hg²⁺，在qsg-7701细胞内实现了对hg²⁺响应的荧光增强分子开关，这为该体系应用于生物识别等更多领域起到了较大的奠基作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。