一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法与流程

本发明属于棉花基因工程技术领域，具体涉及一种高效快速的农杆菌介导的棉花瞬时转化体系的建立。

背景技术：

棉花是食用油、蛋白和纤维的重要原料，因此是一种重要的经济作物。全世界有超过80个国家种植棉花，包括美国、中国、印度和许多其他的发展中国家。虽然我国广泛种植棉花，但随着我国对原棉的需求日益增加，仅依靠扩大耕地面积提高总产量是不现实的。

棉花是一种非常容易感染病虫害的农作物，现有研究普遍认为培育转基因棉花是解决产量和生态环境问题最根本和最有效的方式。从上个世纪开始，转基因抗虫棉被广泛种植于世界各地。

自2015年中国农业科学院棉花研究所揭示陆地棉的全基因组序列以来，对棉花功能基因的研究进入了新的高潮。而伴随基因编辑技术的广泛应用，有望克隆与揭示许多棉花基因的功能。但已有转基因棉花育种方式中，传统的依赖农杆菌介导的转基因棉花的转化效率非常低。相对于烟草和大豆等其他作物，成功获得的转基因棉花的数量非常少。因而现有转基因技术的低转化率较大程度上限制了基因功能的揭示和深入研究。

现有的农杆菌介导的转基因转化方法，其主要发展历程为：1979年price和smith报道通过克劳茨基棉细胞悬浮培养得到胚状体；1986年，美国agracetus公司的umbeck通过农杆菌介导法，在世界上首次成功的将bt基因导入了棉花；而我国早在1991年就已有将外源bt基因导入棉株中的报道。

总体而言，现有获得转基因棉花的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管导入法等。其中采用农杆菌介导法进行转化，转化效率偏低，转化细胞直接分化成植株比较难；而基因枪法最大的特点就是不受受体基因型影响，但是容易形成多拷贝造成基因沉默或者容易形成嵌合体，应用并不广泛。获得转基因棉花的方法还有很多，例如peg介导法、脂质体介导法、超声波介导法、电激法、注射法、浸泡法等，但转基因的效率受到多种因素的影响，包括植物品种，生长时期，生长环境和转化方法等。另外，由于棉花花器官的特殊构造和农杆菌转化受基因型的限制，国内有些研究机构也有采用花粉管通道技术培育转基因棉花的尝试。总之，不管是农业生产，还是对棉花基因功能的研究，都需要建立一种稳定、高效、简单的棉花转基因的方法，从而为农业生产和理论研究方面提供方法学基础。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种高效、简单和快速的农杆菌介导的棉花瞬时转化的方法，从而为同源基因或异源基因在棉花中的表达提供方法学研究基础，同时也可以为棉花功能基因在棉花中的亚细胞定位和相互作用研究奠定方法学基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，具体包括如下步骤：

（1）制备瞬时转化溶液

将含有待转化基因（待测基因）的重组质粒转化农杆菌后，将重组的农杆菌在yep液体培养基中摇瓶培养，培养结束后，离心、收集菌体，用重悬液重悬菌体，调整od600=0.8~1.0作为瞬时转化溶液；

所述重悬液为1/2ms培养液（ph=5.8），其中含有150~170μm乙酰丁香酮、2~4%（w/v）蔗糖和0.01~0.02%（v/v）的tween20（优选比例为：165μm乙酰丁香酮、3%（w/v）蔗糖和0.01%（v/v）的tween20）；

以具体目标基因和质粒为例而言：

分别将pghgpx1pro-gus、p35s-ghgpx1-gfp、pghgpx8pro-gus和p35s-ghgpx8-gfp质粒转化eha105农杆菌后，将转化后重组的eha105农杆菌菌株分别在yep液体培养基（含50mg/l卡纳霉素和50mg/l利福平）中培养，28℃、220rpm摇瓶培养16~17h左右；

然后，取2ml培养的菌液，添加到yep液体培养基，培养至菌液浓度od600约为1.2~1.5，2000g离心10min，收集农杆菌；

用重悬液（优选配方为：含有165μm乙酰丁香酮、3%（w/v）蔗糖和0.01%（v/v）的tween20的1/2ms（ph=5.8））调节农杆菌浓度至od600=0.8~1.0左右，该溶液即为瞬时转化溶液；

（2）培养棉花幼苗，并进行高渗预处理

将棉花种子播种后，取生长6~8天左右的棉花幼苗，清洗、消毒后，置于高渗液中进行高渗预处理；

所述高渗液配方为：含乙酰丁香酮和蔗糖的1/2ms溶液，具体例如为：含165μm乙酰丁香酮和3%蔗糖，ph=5.8的1/2ms溶液；

所述高渗液的渗透压力优选为0.7~0.75kg/cm²，高渗预处理时间优选为3min左右；

所述棉花材料具体例如为：中棉所36；

（3）瞬时转化处理

将步骤（2）中高渗处理后的幼苗放入步骤（1）中的瞬时转化溶液中浸渍培养，优选培养条件为：25℃、120rpm（最好提供适宜光照）培养5h左右（超过5h或无光照条件下，幼苗容易死亡）；

培养结束后，将转化后的幼苗清洗干净，置于含有抗生素和0.8%（w/v）琼脂粉的1/2ms培养基中继续培养生长；培养条件为：光周期16h光照/8h黑暗，光强为80~90μmolm^-2s^-1，培养温度为：日25℃/夜20℃；培养5天后即可进行基因表达检测或其他分析，或者继续培养即可用于转基因植株培育；

需要注意的是，培养期间如果幼苗周围出现农杆菌菌落，需将植株移至另一个新鲜的培养基中进行培养。

所述农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，也可以理解为一种转基因植株构建方法。

所述农杆菌介导的棉花瞬时转化方法在转基因植株构建中的应用，用于构建获得转基因棉花新品种。

所述农杆菌介导的棉花瞬时转化方法在棉花研究中应用，用于基因表达模式研究和蛋白质的亚细胞定位研究。

本申请所提供的棉花瞬时转化方法中，主要是利用渗透作用使农杆菌侵染幼苗，从而将外源基因携带至棉花中，进而在棉花中表达转入的基因。总体而言，该方法具有成本低廉、操作方便、转化效率高等优点，可以为棉花中基因功能研究奠定方法学基础，同时也可为棉花功能基因在棉花中的亚细胞定位和相互作用提供参考方法，如利用双分子荧光互补体系（黄色荧光蛋白，yfp）或荧光素酶（luc），结合本申请的瞬时转化方法，即可检测棉花蛋白在体内的亚细胞定位和相互作用等，因而具有较好的实用性和科研应用价值。

附图说明

图1为本申请所提供的农杆菌介导棉花瞬时转化流程的模式图，其中eha105为转化所用农杆菌，gfp为绿色荧光蛋白，gus为β-葡萄糖苷酶，kan+为卡那霉素；

图2为转化过程中的陆地棉照片，其中：a，生长7天用于转化的棉花材料；b，以转化溶液进行转化的陆地棉；c，转化后在筛选培养基中生长的陆地棉；

图3为超表达ghgpx1和ghgpx8的不同植物中，实时荧光定量pcr检测ghgpx1（a）和ghgpx8（b）表达量；其中误差表示实验进行了至少三次单独的重复，以student’st-test分析数据差异显著性，**p<0.01；

图4为ghgpx1和ghgpx8基因表达特征分析，其中：检测ghgpx1（a）和ghgpx8（b）的启动子驱动的β-葡萄糖苷酶（gus）活性；a，b和c分别为基因在叶子、茎和根中的表达特征；c和d分别为提取同时期棉花根尖、根、茎、子叶和真叶的rna，利用荧光定量pcr检测不同组织中ghgpx1（c）和ghgpx8（d）的表达模式；

图5为陆地棉中ghgpx1（a）和ghgpx8（b）的亚细胞定位分析；其中：a，ghgpx1亚细胞定位于叶绿体中；b，ghgpx8定位于细胞质中；c，gfp蛋白（空载体表达）的亚细胞定位，阳性对照实验组；标尺长度：白色为5微米（图a下行），红色为10微米（图a上行，图b，图c左侧两幅图），黄色为100微米（图c右侧两幅图）。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂及实验设备情况简要介绍说明如下。

生物材料：

菌种：

eha105农杆菌菌种，由中国农业大学任东涛教授友情提供（当然，也可以采用其他商品化的农杆菌菌株进行相关转基因操作实验）；

转化过程中所用大肠杆菌dh5α菌株，一种商品化菌株；

棉花材料：中棉所36，由中国农业科学院棉花研究所提供；

质粒：

pcambia1381质粒，由河南大学宋纯鹏教授友情提供；

p35s-gfp，由中国农业大学郭岩教授友情提供；

pghgpx1pro-gus，pghgpx1-gfp（p35s-ghgpx1-gfp），pghgpx8pro-gus和pghgpx8-gfp（p35s-ghgpx8-gfp）是由以上两种质粒构建的重组质粒，具体构建步骤在实施例中简要介绍；

实验试剂

乙酰丁香酮、卡那霉素、利福平、tween20、x-gluc等试剂均为solarbio公司产品；

提取rna并将其反转录为cdna的试剂盒为天根（tiangen，中国）公司产品；

实时荧光定量pcr试剂盒为普洛麦格（promega，美国）公司产品；

部分培养基具体配方为：

yep培养基：10g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/l氯化钠；

ms培养基（含0.8%（w/v）琼脂粉）：4.4g/l的ms盐（murashige&skoogbasalmediumwithvitamins,phytotechnologylaboratories）；3g/l蔗糖；6g/l琼脂粉；1/2ms是将ms盐的含量减少一半，其他成分含量相同。

实验设备：

pcr仪，biometragmbh，easycycler96，德国；

激光共聚焦显微镜，蔡司710，德国。

实施例1

以重组质粒pghgpx1pro-gus、p35s-ghgpx1-gfp、pghgpx8pro-gus和p35s-ghgpx8-gfp为例，本实施例主要介绍一下相关重组质粒的构建过程。

pghgpx1pro-gus和pghgpx8pro-gus是分别克隆ghgpx1和ghgpx8的启动子区域（是起始密码子atg上游约2000bp的序列），然后连接到pcambia1381的重组质粒；

pghgpx1-gfp（p35s-ghgpx1-gfp）和pghgpx8-gfp（p35s-ghgpx8-gfp）是分别克隆ghgpx1和ghgpx8的编码序列，连接到p35s-gfp质粒构建的重组质粒；

相关重组质粒构建过程中所用引物序列及酶切位点具体参考如下表所示：

。

具体构建过程参考现有分子生物学技术相关操作，首先进行基因克隆，然后进行酶切并与对应质粒连接后，转化、筛选鉴定即可，具体可参见《theglutathioneperoxidasegenefamilyingossypiumhirsutum:genome-wideidentification,classification,geneexpressionandfunctionalanalysis》（chenetal.,2017，scientificreports,7:44743.doi:10.1038/srep44743）中相关操作介绍。

实施例2

本申请所提供的农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，具体包括如下操作步骤，其操作流程示意图见图1所示。

（一）制备瞬时转化溶液，具体步骤如下：

分别将实施例1所制备的pghgpx1pro-gus、p35s-ghgpx1-gfp、pghgpx8pro-gus和p35s-ghgpx8-gfp重组质粒的转化后eha105农杆菌菌株，进行抗性筛选，并进行菌落pcr验证，挑取验证正确的菌落接种于yep液体培养基（含50mg/l卡纳霉素和50mg/l利福平）中培养，28℃、220rpm摇瓶培养16~17h左右。

然后进行重新培养：取5ml培养的菌液转至300ml新鲜液体yep培养基（不含抗生素）中，28℃、220rpm摇瓶培养至od600约为1.2~1.5，然后2000g离心10min，收集农杆菌菌体备用。

将上述离心后所收集的菌体进行重悬，重悬液具体为：含有165μm乙酰丁香酮、3%（w/v）蔗糖和0.01%（v/v）的tween20的1/2ms（ph=5.8）溶液，用重悬液调整农杆菌浓度至od600=0.8~1.0左右，此即为瞬时转化溶液。需要说明的是，转化液中各试剂浓度的改变针对不同质粒转化应用时，其转化效率有不同影响，上述浓度仅是针对本实施例的较佳浓度。

（二）培养棉花幼苗，并进行高渗预处理，详细操作如下：

将中棉所36棉花品种种子播种后进行培养，培养条件为：光周期16h光照/8h黑暗，光强为150~200μmolm^-2s^-1，培养温度为日26℃/夜20℃；

取生长7天左右的棉花幼苗（真叶未出现之前，见图2左图），先用清水洗去沾在幼苗上的培养液和其它杂质，轻微喷施酒精（75%，v/v）后放入超净工作台，用0.1%（w/v）的hgcl2进行全面洗涤，再将幼苗浸泡于ddh2o中5min，轻微晃动洗去残留的hgcl2，反复更换ddh2o，清洗4~5次以确保清洗干净；

将清洗消毒后棉花幼苗置于高渗液中进行高渗预处理3min，高渗液具体为：含165μm乙酰丁香酮和3%蔗糖，ph=5.8的1/2ms溶液，高渗液的渗透压力为0.7~0.75kg/cm²左右（需要注意的是，过高的渗透压力容易损伤幼苗，但过低时则无法有效促进基因转化）。

（三）瞬时转化处理，具体而言：

将步骤（2）中高渗处理后的幼苗放入步骤（1）中的瞬时转化溶液中，25℃、120rpm（提供适宜光照，光照强度约80μmolm^-2s^-1即可）培养5h（见图2中间图片，培养时间过长和无光照条件下培养，幼苗容易死亡）。

将转化后的幼苗用ddh2o洗涤两次，除去幼苗上沾着的农杆菌后，置于含有抗生素（50mg/l卡纳霉素和50mg/l利福平）和0.8%（w/v）琼脂粉的1/2ms培养基生长；培养条件为：光周期16h光照/8h黑暗，光强为80~90μmolm^-2s^-1，培养温度为：日26℃/夜20℃；

培养5~7天后即可进行基因表达检测或其他分析（见图2右图）；

需要注意的是，培养期间如果幼苗周围出现农杆菌菌落，为避免农杆菌污染，需将植株移至另一个新鲜的培养基中进行培养。

实施例3

基于实施例2所构建的转基因瞬时超表达的陆地棉植株，可用于检测陆地棉基因的表达模式和亚细胞定位等实验，相关实验应用简要介绍如下。

（一）瞬时转化方法可用于构建基因短期超表达的陆地棉

基于实施例2的转基因转化操作方法，构建了瞬时转化p35s-ghgpx1-gfp和p35s-ghgpx8-gfp的陆地棉，分别各取3株转化p35s-ghgpx1-gfp和p35s-ghgpx8-gfp的陆地棉，提取rna并反转录为cdna，以实时荧光定量pcr检测瞬时转化植株中ghgpx1和ghgpx8的基因表达量（ubq7为内参基因，基因检索号为dq116441）。

实时荧光定量pcr检测时，引物序列如seqidno.1~6所示，具体列表如下：：

。

检测结果显示，在瞬时表达ghgpx1的植株中，最高的ghgpx1表达量是野生型（wt）陆地棉的10倍以上；而在瞬时表达ghgpx8的植株中，最高的ghgpx8表达量是野生型（wt）陆地棉的5倍以上（参见图3）。该结果表明，本申请的瞬时转化方法能够在陆地棉中表达陆地棉基因，获得基因瞬时超表达的陆地棉。实时荧光定量pcr使用引物见表2.

（二）瞬时转化方法用于分析陆地棉的基因表达模式

基于实施例2所构建的瞬时转化pghgpx1pro-gus和pghgpx8pro-gus的陆地棉，分别取瞬时转化陆地棉的根、茎和叶等材料，采用化学染色的方法检测ghgpx1和ghgpx8的启动子驱动的gus基因的表达情况（相关操作可参见《aik1,amitogen-activatedproteinkinase,modulatesabscisicacidresponsesthroughthemkk5-mpk6kinasecascade》lietal.,2017,plantphysiology,173(2):1391-1408.doi:10.1104/pp.16.01386），从而确定ghgpx1和ghgpx8基因的表达模式。

实验数据显示，ghgpx1在根、茎和叶中均有表达（图4a），以子叶中表达量最高（图4c）；ghgpx8在根、茎和叶中均有表达（图4b），以茎中表达量最高（图4d）。

（三）瞬时转化方法用于分析陆地棉蛋白质的亚细胞定位

基于实施例2所构建的瞬时转化p35s-ghgpx1-gfp和p35s-ghgpx8-gfp的陆地棉，分别取瞬时转化材料的叶片表皮条和根部，以激光共聚焦扫描显微镜观察ghgpx1-gfp和ghgpx8-gfp的绿色荧光分布情况（激光共聚焦扫描显微镜检测操作参见《aik1,amitogen-activatedproteinkinase,modulatesabscisicacidresponsesthroughthemkk5-mpk6kinasecascade》lietal.,2017,plantphysiology,173(2):1391-1408.doi:10.1104/pp.16.01386）。

结果显示，ghgpx1-gfp的绿色荧光与叶绿体的自发光完全重合，表明ghgpx1-gfp定位于保卫细胞的叶绿体中（叶绿体自发荧光为红色荧光，与gfp的绿色荧光叠加后为黄色荧光）（图5a）；而ghgpx8-gfp定位于保卫细胞和根细胞的细胞质中（图5b）；图5c为p35s-gfp空载体瞬时转化陆地棉中gfp的分布，是实验的对照组。

需要补充说明的是，以双分子荧光互补系统为基础，采用本申请中的瞬时转化方法，共转化两个陆地棉基因，可以用于检测陆地棉中蛋白质的相互作用。

还需解释说明的是，上述实施例仅以gus、gfp基因为例，制备了重组质粒，并将其转化棉花幼苗进行了初步试验，在上述技术思路基础上，选择其他基因及质粒，同样可以获得类似的技术效果，在此不再重复描述。

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