肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和KAP1作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和kap1作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。
背景技术：
：目前，肺癌属于世界上致死率较高的肿瘤，特别是非小细胞肺癌，严重地威胁着人类的健康和生命。因此,寻找有效的治疗肺癌药物与方法,彻底攻克肺癌,是当今我国乃至世界医学界的一个重要研究课题。近年来，肿瘤学的研究在我国及世界范围的发展均极为迅速，科技的不断进步对肿瘤的治疗有很大促进作用。随着肿瘤分子生物学研究的进步，对肺癌相关基因的研究也日益深入，确定了许多与肺癌生成的有关基因。如原癌基因ras、myc、erbb基因家族及重要的抑癌基因p53、rb、chr3p、5p、9p等。但是，肺癌基因的发生发展过程中，原癌基因和抑癌基因容易发生突变，使原本与肺癌相关的基因的检测方法受到了限制。由于肺癌相关基因的易突变性，使得靶点治疗肿瘤的方式成为主流。靶向治疗正是肿瘤治疗变革的产物，具有较低的不良反应和良好疗效，能明显提高患者的生活质量，还可以大幅度减低患者发生副作用的风险，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。作为抗肿瘤领域的世界领先者，罗氏公司现拥有5个能延长患者生存期的靶向治疗药物，其中3个产品已经在中国上市。靶向治疗药物具有较光明的治疗模式，因此，筛选出合适的药物靶标为开发多种抗癌药物提供新的思路和方向。与药物作用相关的靶或蛋白质主要有3类：①疾病相关(特异性)蛋白质；②生物标记分子；③信号传导分子。尽管目前现有技术中报道了关于肺癌的药物靶点的种类，但是有些靶点筛选的药物给药后会产生不良反应，例如药物毒副作用较强；还有一些药物靶点治疗效果不佳，容易导致延误患者病情，错过最佳的治疗时期。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和kap1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用，所述抑制剂通过抑制kap1的表达从而能够有效抑制肺癌细胞增殖和迁移。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂grna，具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。本发明提供了所述的抑制剂grna在制备预防和治疗抗肺癌药物中的应用。本发明还提供了kap1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。优选的，所述kap1编码基因trim28具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。优选的，所述抗肺癌的药物为抑制kap1编码基因表达的抑制剂。优选的，所述抑制剂为所述的肺癌靶向治疗抑制剂。优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。本发明提供了一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂grna，具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。所述抑制剂能够有效抑制kap1编码基因的表达，从而显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移。本发明还提供了kap1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。本发明通过检测临床肺癌组织及邻近正常肺组织中kap1的表达水平，临床肺癌组织中kap1的表达水平明显高于邻近正常肺组织的表达水平。通过分子生物学的方法使用crisp/cas9技术成功的在肺癌a549细胞株中敲除kap1。检测了敲除kap1后通过细胞增殖实验、化疗药物敏感实验、transwell实验、划痕实验、细胞成球实验、克隆形成实验、流式细胞术检测细胞周期、emt实验、裸鼠移植瘤实验等对a549细胞生物学功能的影响，结果表明通过抑制kap1的表达水平，能够有效抑制细胞增殖。目前对于kap1在肺癌发生发展的作用还很少，本发明提供的应用，在肺癌发病机制中的作用进行了初步探索，为临床治疗肺癌提供理论依据和筛选新的药物靶点的应用。附图说明图1为实施例1中kap1在肺癌患者的癌组织及癌旁正常组织中表达的结果图；图1-a为kap1癌组织及癌旁正常组织中的表达图，图1-b为kap1表达灰度统计图；图2是肺癌a549细胞敲除kap1结果图及kap1对a549细胞增殖的影响图；图2-a-左为kap1敲除蛋白水平结果图；图2-a-右为kap1敲除基因水平结果图；图2-b为kap1对a549细胞增殖的影响图；图3是kap1在肺癌a549细胞中对化疗药物cddp敏感性的作用；图4是kap1在肺癌a549细胞中对5-fu敏感性影响的可能机制；图4-a为kap1在肺癌细胞中对5-fu敏感性的影响结果图；图4-b为kap1在肺癌细胞中对5-fu敏感性的可能机制结果图；图5是kap1对a549细胞的细胞周期的影响图；图5-a为流式细胞术检测野生a549细胞和kap1敲除a549细胞的结果图；图5-b为细胞周期统计柱状图；图6是kap1敲除对肺癌a549细胞迁移的影响图；图6-a为transwell结果图及统计柱状图；图6-b为划痕结果图及统计柱状图；图7是kap1敲除对肺癌a549细胞emt的影响图；图7-a为emt标志物westernblot检测结果图；图7-b为emt形态学改变结果图；图8是kap1敲除对肺癌a549细胞干性及侵袭能力的影响图；图8-a为细胞干性表型——细胞成球结果图及统计柱状图；图8-b为细胞干性标志物westernblot检测结果图；图8-c为细胞侵袭表型—软琼脂克隆形成结果图及统计柱状图；图9是kap1敲除对肺癌a549细胞裸鼠移植瘤的影响图；图9-a为裸鼠移植瘤结果图；图9-b为裸鼠移植瘤重量统计柱状图；图9-c为裸鼠移植瘤体积统计折线图；图9-d为裸鼠重量统计折线图；图9-e为裸鼠移植瘤he染色结果图。具体实施方式本发明提供了一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂grna，具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。本发明中，所述抑制剂通过人工合成方法获得。本发明中，所述抑制剂委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明中，所述抑制剂能够有效抑制肺癌细胞中kap1编码基因的表达，从而使erk会被异常激活，细胞增殖受到抑制。本发明提供了所述的抑制剂grna在制备预防和治疗抗肺癌药物中的应用。本发明中，所述抗肺癌药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的基因药物制备的技术方案即可。本发明还提供了kap1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。本发明中，所述kap1编码基因trim28优选具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。kap1蛋白优选具有如序列表中seqidno.3所示的氨基酸序列。本发明中，所述抗肺癌的药物优选为抑制kap1编码基因表达的抑制剂。所述抑制剂优选为上述方案中所述肺癌靶向治疗抑制剂。本发明中，所述肺癌优选为非小细胞肺癌。本发明中，为了验证所述药物靶标的作用，构建基因敲除细胞模型(记为细胞-kap1-ko模型)。所述基因敲除细胞模型的方法，优选包括以下步骤：a.设计kap1编码基因抑制剂grna的dna寡核苷酸片段的正反向序列；b.将设计得到的正反向序列进行磷酸化，得到双链片段；c.将所述双链片段连接至质粒载体中，得到连接产物；d.将所述连接产物进行纯化；e.将纯化后的连接产物转染至肺癌细胞中，检测基因和蛋白的表达结果。本发明中，所述设计抑制剂的dna寡核苷酸片段的正反向序列用软件没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的设计软甲即可。本发明实施例中，采用麻省理工学院的crisprdesign进行设计。所述crisprdesign网址：http://crispr.mit.edu/。本发明中，抑制剂的dna寡核苷酸片段的正反向序列的长度优选为18～22bp。所述正反向序列优选在5’端添加上粘性末端序列。所述粘性末端序列优选为cacc或aaac。在正反向序列的5’端添加上粘性末端序列有利于后期与质粒易于连接。本发明中，将设计得到的dna正反向序列进行磷酸化使人工合成的dna正反向序列形成双链结构。所述磷酸化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的磷酸化方法即可。本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接方案即可。本发明中，所述纯化是将所述连接产物中存在的未连接在载体上的dna寡核苷酸片段的正反向序列进行线性化。本发明对所述线性化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的线性化的方法即可。本发明中，转染的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的转染方案即可。本发明实施例中，转染采用vefactor进行转染。所述肺癌细胞优选传代15代以内的细胞。所述肺癌细胞在平时培养时，密度优选低于超过70％，当转染时，细胞的密度优选为70％～90％。本发明中，转染后优选培养48h后筛选阳性细胞克隆。所述培养优选在细胞培养基中添加0.6～1.0μg/ml的嘌呤霉素。所述阳性克隆的筛选方法依次包括细胞稀释、多克隆细胞淘汰、westernblotting及pcr法检测这些细胞克隆的基因敲除步骤。本发明中，稀释的程度为至0.5个细胞/100μl培养液。优选将稀释后的细胞接种至96孔板中，每孔中1个细胞。本发明中，所述多克隆细胞淘汰和westernblotting实验没有特殊限制，采用本领域所熟知的方案即可。本发明中，所述pcr法的扩增引物为引物为f:gttgtgcttgtgcttgtgg(seqidno.4)和r:cacttcgtacttaccggtgc(seqidno.5)。所述扩增程序为：当细胞中不能扩增所述kap1编码基因片段，同时野生型对照组细胞扩增得到目的kap1编码基因片段时，说明构建成功基因敲除细胞模型。为了验证基因敲除的细胞模型中kap1编码基因的沉默表达是由抑制剂导致的，构建kap1恢复表达细胞模型(记为细胞-kap1-rescue模型)。用于构建kap1恢复表达细胞模型中用的引物f:atgaaccgccttggaaaggcggcgctgagcggtggcggt(seqidno.6)和r:ccgatatctcagtggacaggaaacgcaccatatcc(seqidno.7)。将野生型肺癌细胞、细胞-kap1-ko模型和细胞-kap1-rescue模型分别进行westernblotting验证kap1蛋白表达情况。本发明对所述westernblotting的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的westernblotting方案即可。下面结合实施例对本发明提供的肺癌靶向治疗的抑制剂及kap1作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1选择云南省第一人民医院胸外科30例患非小细胞肺癌的患者肺癌组织和癌旁正常组织作为检测样本。将肿瘤组织和癌旁组织分别放入不同的冻存管，直接放入液氮保存，运输过程中用干冰保存。裂解细胞是取米粒大小的组织块，用冰冷的pbs溶液将组织块的血迹清洗感觉，去除多余的液体后加入含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液200μl。用组织研磨器在1.5ml离心管中研磨组织，整个研磨过程不要离开冰上，每研磨5秒暂停十秒，防止组织过度发热破坏蛋白的完整。部分结缔组织无法被研磨完全属正常现象。研磨后将溶液置于冰上裂解半个小时后以12000g的速度离心，取上清液，待用。westernblot实验步骤：1.用洗涤精把玻璃板洗干净，再用去离子水冲洗，然后将玻璃板置于烘箱中至烘干。2.配胶：配分离胶和浓缩胶，先配分离胶，配完分离胶后要加95％的分析纯乙醇液封，大约500μl；等分离胶充分凝固后，再配浓缩胶，根据样品数，选择合适孔的梳子插入收缩胶中。3.上样：将凝胶板放到电泳槽中，倒入适量的的1×电泳buffer，然后小心缓慢地拔去梳子，将准备好的蛋白样品以及蛋白marker加入sds-page凝胶的各泳道中。4.电泳：打开电源，电泳仪条件为u＝80v，i＝100ma，电泳大约30min；然后将电压调至120v，电泳约1.5h。5.转膜：预先配好转膜液，放入4℃预冷。转膜用的装置需提前洗干净。胶板从电泳槽中取出后，先切去浓缩胶。转膜前要把pvdf膜浸泡在甲醇中，待其浸透无白点时，才可放入转膜液中进行转膜。打开转膜用具，黑板朝下，放上一块棉垫，加三张滤纸(6×8cm)，每一步都需赶走气泡，将凝胶放在滤纸上，对整齐，加pvdf膜，赶气泡，再加三张滤纸，最后再放另一块棉垫，然后整齐的拿出三明治，放到电泳槽中。转膜条件为：u＝110v恒压t＝1h10min。6.封闭：用5％的脱脂牛奶(1×tbst配用)封闭。转膜结束后，将pvdf膜放入杂交袋中，加入适量的5％脱脂牛奶，用塑料薄膜封口机封口，室温摇床上2h。7.孵育一抗：3％的脱脂牛奶(1×tbs配用)作为配置液，按比例加入kap1蛋白一抗。用镊子将pvdf膜从脱脂牛奶中拿出。然后将pvdf膜放入杂交袋中，加入配制好的kap1蛋白一抗，赶走杂交袋中膜上气泡，用封口机封口，保证抗体与膜充分接触，放在摇床上，4℃过夜孵育。8.孵育二抗：取出pvdf膜，kap1蛋白一抗回收利用，将膜放在摇床上用0.1％的1×tbst漂洗3次，每次5min。将pvdf膜放入杂交袋中，加入配制好的对应的二抗，用封口机封口，保证抗体与膜充分接触，放在摇床上，室温孵育60min。9.化学发光仪显影：二抗孵育完后，取出pvdf膜，用0.1％的1×tbst漂洗3次，每次10min。漂洗后将pvdf膜浸泡于配制好的发光底物中，孵育5min，将膜转移到杂交袋中，放入化学发光仪中，调好曝光时间进行显影。检测结果见图1。图1为kap1在肺癌患者的癌组织及癌旁正常组织中表达的结果图。图1-a图为kap1在癌组织及癌旁正常组织中的表达图，图1-b图为kap1表达灰度统计图。由图1可知，kap1蛋白在肺癌患者的癌组织比在癌旁正常组织中表达量提高。实施例2质粒构建1：设计和合成grna设计gdna序列设计一对20bp左右的gdna，我们可以通过以下在线工具设计：麻省理工学院的crisprdesign：http://crispr.mit.edu/设计靶向kap1编码基因的grna序列，具体如下表所示：表1grna-kap1核酸序列注：小写部分是与质粒相连接的核酸序列，大写部分为grna序列2：将sgrna克隆至pspcas9(bb)质粒(i)将每条grna溶解至终浓度100μm，按照以下配方对sgrna进行磷酸化和退火。成分用量(ul)sgrna正向序列(100um)1sgrna反向序列(100um)1t4连接缓冲液10x1t4pnk1水6共计10(ii)将上述混合物放置pcr仪中，利用以下程序对sgrna进行磷酸化和退火：37℃30min，95℃5min，然后以5℃/min降至25℃。(iii)将上述已经磷酸化和退火的产物按1:200进行稀释，即取1μl加199μl的pcr水。(iv)按照以下配方将上述稀释的产物与载体进行连接成分用量(ul)pspcas(bb)质粒100ng上一步稀释产物(200倍稀释)2tango缓冲液,10×2dtt,10mm1atp,10mm1bbsi1t7连接酶0.5水to20共计20(v)将上述混合物放在pcr仪中，按照以下程序进行连接反应循环数条件637℃5分钟，21℃5分钟(vi)利用plasmidsafe核酸酶来处理连接产物，将一些线性化的dna水解掉。具体反应体系如下：成分用量(ul)上一步连接产物11plasmidesafe缓冲液,10x1.5atp,10mm1.5plasmidesafe核酸酶1共计15(vii)将plasmidsafe反应体系放在pcr仪中：先37℃30min，再70℃30min。后面就是取上述2μl产物来转染大肠杆菌(dh5α)，挑单克隆，抽提质粒，测序等，测序所用的引物为u6启动子通用序列。3.a549细胞的准备，细胞最好是15代以内的，平时培养时细胞密度一定不要超过70％。4.将细胞传至6孔板，每个孔加2ml培养基，在转染前16至24h不加抗生素，转染时细胞密度最好能达到70-90％，可用vefactor来转染测序正确的1000ngpspcas9(sgrna)，同时另外转染未连接sgrna的pspcas9作为阴性对照，pspcas9(sgrna)组和阴性对照组均设三个平行重复。5.转染24h后，可加入0.8μg/ml的puromycin继续培养48h来筛选阳性细胞克隆。6.利用稀释法筛选单克隆细胞系。将细胞充分消化化后，用培养基稀释至0.5个细胞/100μl，按照此种稀释程度，24孔板的一个孔细胞最终至少接种至2个96孔板。(这步，对细胞的稀释至关重要，确保使大多数的孔不能多于1个细胞，在稀释前需对细胞计数)。7.取100μl稀释好的细胞接种于96孔板，即每孔100μl。大概1周左右能长出单克隆，注意观察，如果某些孔长出多克隆，应将此孔标记去除。大约培养至2到3周，孔内细胞能长满，这时可将这些细胞消化下来扩大培养。8.用实施例1的方法进行westernblotting及pcr法检测上述细胞克隆的基因敲除情况。验证pcr：引物f:gttgtgcttgtgcttgtgg；引物r:cacttcgtacttaccggtgc。所扩增的片段涵盖了grna打靶的位点。pcr合成反应混合液组分如下：名称体积(μl)gxl酶2.0kap1f引物(10μm)1.0kap1r引物(10μm)1.0cdna1.0dntps4.0水18.05×缓冲液10.0共计50.0扩增kap1pcr反应条件如下：将获得的产物送测序并将敲除组的序列与野生型a549-wt细胞序列比对。将成功基因敲除的细胞记为a549-kap1-ko。结果见图2。图2是肺癌a549细胞敲除kap1结果图及kap1对a549细胞增殖的影响图，其中图2-a-左为kap1敲除蛋白水平结果图；图2-a-右为kap1敲除基因水平结果图。由图2-a可知，基因敲除细胞中不能表达kap1编码基因。crispr-cas9系统通过grna序列的引导结合于指定的基因组序列上，并由cas9酶造成该序列附近的基因组dna双链切口，细胞便启动非同源重组修复方式，伴随对基因组dna的随机增删，造成基因组dna片段缺失71个碱基，并产生移码突变，最终导致kap1蛋白的缺失。实施例3细胞增殖：1.显微镜观察细胞，当实施例2中制备的a549-kap1-ko细胞汇合度达到80％～90％时，弃去培养基，加入pbs溶液轻轻冲洗，并弃去冲洗溶液。2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的co2细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含有10％的胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μl的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/ml＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以野生型a549-wt细胞做对照组。4.配置细胞密度为每孔2000个单细胞悬液，然后向96孔板中的每个孔中加入单细胞悬液，放入细胞培养箱中培养。5.分别在培养箱中培养1d，2d，3d和4d后，向96孔板中加入10ul10mg/ml的cck8试剂，随后在37℃，5％的co2细胞培养箱中孵育2h。6.将96孔板放入酶标仪中，读取吸光值。使用graphpadprism6软件对数据进行统计分析作图。结果见图2-b。图2-b为kap1对a549细胞增殖的影响图。由图2-b可知，a549-kap1-ko细胞和野生型a549-wt细胞同时培养1d后，细胞增长率差距逐渐增加，a549-kap1-ko细胞较野生型a549-wt细胞的增殖率明显降低。这说明，敲除kap1编码基因能够有效抑制a549细胞增殖。实施例4化疗药物敏感：1.显微镜观察细胞，当细胞汇合度达到80％～90％时，弃去培养基，加入pbs溶液轻轻冲洗，并弃去冲洗溶液。2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的co2细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含有10％的胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μl的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/ml＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以野生型a549-wt细胞做对照组。4.配置细胞密度为每孔8000个单细胞悬液，然后向96孔板中的每个孔中加入单细胞悬液，放入细胞培养箱中培养。5.当细胞贴壁后，向96孔板中加入顺铂，并设定浓度梯度，加入到96孔板。顺铂的浓度梯度为：0，1，3，10，30，100，300μmol。6.在5％的co2细胞培养箱中培养24h后，向96孔板中加入10ul10mg/ml的cck8试剂，随后在细胞培养箱中孵育2h。7.将96孔板放入酶标仪中，读取吸光值。利用graphpadprism6软件对数据进行统计分析作图。结果见图3。为了探究kap1蛋白是否影响a549细胞对常规化疗药物的敏感性，本发明将kap1编码基因敲除之后，a549对cddp(顺铂)的敏感性并未发生明显变化。实施例5kap1恢复表达(kap-rescue)步骤：构建kap1高表达质粒(pcdna3.1)验证pcr：引物f:atgaaccgccttggaaaggcggcgctgagcggtggcggt；引物r:ccgatatctcagtggacaggaaacgcaccatatcc。所扩增的片段涵盖了grna打靶的位点。pcr合成反应混合液组分如下：扩增kap1pcr反应条件如下：将得到的产物按照试剂盒说明书回收。酶切获得带有hidⅲ，ecorⅴ酶切位点粘性末端的kap1和pcdna3.1表2酶切反应混合组分名称体积(μl)10×连接酶缓冲液2.0回收的kap1片段10.0回收的载体片段2.0水4.0共计20.016℃连接过夜，转化，挑单克隆后测序验证。取测序正确的质粒扩增抽质粒。将阳性的kap1高表达质粒瞬时转染入实施例2制备的a549-kap1-ko细胞中，得到kap1恢复表达的a549细胞，即a549-kap1-rescue。将a549-wt，a549-kap1-ko及a549-kap1-rescue细胞铺入六孔板中培养。实施例6化疗药物敏感：1.显微镜观察细胞，当实施例5中制备的3组细胞汇合度达到80％-90％时，弃去培养基，加入pbs溶液轻轻冲洗，并弃去冲洗溶液。2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的co2细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含有10％的胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μl的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/ml＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以野生型a549-wt细胞做对照组。4.配置细胞密度为每孔8000个单细胞悬液,然后向96孔板中的每个孔中加入单细胞悬液，放入细胞培养箱中培养。5.当细胞贴壁后，向96孔板中加入顺铂，并设定浓度梯度，加入到96孔板。5-氟尿嘧啶的浓度梯度为：0.05，0.1，0.5，1，5，10，50ug/ml。6.在5％的co2细胞培养箱中培养24h后，向96孔板中加入10ul10mg/ml的cck8试剂，随后在细胞培养箱中孵育2h。7.将96孔板放入酶标仪中，读取吸光值。利用graphpadprism6软件对数据进行统计分析作图。westernblot实验步骤如图4。图4是kap1在肺癌a549细胞中对5-fu敏感性影响的可能机制。图4-a为kap1在肺癌细胞中对5-fu敏感性的影响结果图；图4-b为kap1在肺癌细胞中对5-fu敏感性的可能机制结果图。由图4可知，为了探究kap1是否影响a549细胞对常规化疗药物的敏感性，本发明将kap1编码基因敲除之后，a549对5-fu(五氟尿嘧啶)的敏感性发生明显变化：kap1敲除后a549细胞对5-fu的敏感性显著提高，这种敏感性的提高和erk的激活有关，这种由kap1敲除带来的5-fu激活erk的磷酸化在kap1表达恢复后消失。在使用不同浓度的5-fu处理细胞后，kap1敲除后的细胞呈现出erk的磷酸化激活，并且这种磷酸化程度呈现出对5-fu浓度的依赖。在将敲除细胞中kap1表达恢复之后，这种对5-fu依赖的erk磷酸化现象便消失。实施例7流式细胞术：1.离心收集细胞，弃上清，用预冷pbs洗细胞两次。2.加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜。3.细胞染色：离心收集细胞，以1ml的pbs洗细胞一次，加入500ulpbs含50ug/ml溴化乙锭(pi)，100ug/mlrnasea，0.2％tritonx-100，4℃避光孵育30分钟。4.流式检测：以标准程序用流式细胞仪检测，计数1万个细胞，fl-2通道检测荧光值。检测结果见图5。图5是kap1对a549细胞的细胞周期的影响图，图5-a为流式细胞术检测野生a549细胞和kap1敲除a549细胞的结果图，图5-b为细胞周期统计柱状图。由图5-a可知，kap1敲除a549细胞处于g0/g1期增加，s期细胞数量明显少于野生a549细胞，同时kap1敲除a549细胞处于g2/m期细胞数量未见明显变化。这表明，kap1编码基因敲除后，细胞周期阻滞在g0/g1期。实施例8transwell实验：1.显微镜观察细胞，当a549-kap1-ko细胞融合度达到80％～90％时，弃去培养基，加入pbs溶液轻轻冲洗一次，并吸取冲洗溶液，加入无血清的培养基饥饿12h。2.在超净台中取出transwel小室，放置于24孔培养板中，小室内和放小室的孔内先加入pbs进行润洗3次，随后加入无血清的培养基润化10min，备用。3.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的co2细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆。4.在超净工作台中加入无胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。收集在10ml的离心管中，离心3min，800rpm。5.弃除上清，加入适量无血清的培养基重悬细胞，用微量移液器取10μl的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/ml＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以野生型a549-wt细胞做对照组。6.计数后，取无血清培养基重悬一定数量的细胞悬液，将细胞密度调整至5×104/ml。7.将transwell小室放入24孔板中，取上述细胞悬液200μl加入小室；取含10％fbs的培养基500μl沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间没有气泡。8.将接种好的细胞放入培养箱，37℃，5％co2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。9.24h后，取出transwell小室，并用棉签擦去靠近内室一面的细胞，然后用多聚甲醛室温固定30分钟，0.5％结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，然后在显微镜下观察小室中的细胞，记数，并拍下照片，用graphpadprism6软件对数据进行统计分析作图。结果见图6-a。图6-a为transwell结果图及统计柱状图。由图6-a可知，基因敲除组细胞的数量比野生型细胞数量明显降低。这表明，基因敲除组细胞的迁移能力明显下降。实施例9划痕实验1.显微镜观察细胞，当a549-kap1-ko细胞汇合度达到80％～90％时，弃去培养基，加入pbs溶液轻轻冲洗一次，并弃去冲洗溶液。2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的co2细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含有10％的胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μl的细胞悬浮液，从血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/ml＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以野生型a549-wt细胞做对照组。4.每个划痕小室中均匀的加入约1×105个细胞，细胞放入37℃，5％的co2细胞培养箱中。5.第二天用取出划痕小室，并加入丝裂霉素拍照记录。6.放入37℃5％co2培养箱，培养。每天拍照记录直到划痕消失。7.统计方法：使用imagej软件得出划痕面积，用graphpadprism6软件对数据进行统计分析作图。结果见图6-b。图6-b为划痕结果图及统计柱状图。由图6-b可知，划痕处理24h后，野生型a549-wt细胞开始向划痕线迁移，划痕处理48h后，野生型a549-wt细胞已经几乎长满划痕线；而a549-kap1-ko细胞在划痕处理24h后，细胞基本上没有向划痕线迁移，培养48h后，有少量细胞向划痕线部分迁移，但是仍然能够看到明显的划痕线。这表明，敲除kap1编码基因，能够有效抑制或降低细胞的迁移能力。实施例10emt转化实验：1.把野生型肺癌a549细胞及a549-kap1-ko细胞铺入6孔板中，密度大约30％～40％。2.贴壁后更换为0.2％血清的培养基，8h后加入tgf-β(20μg/ml)1μl。3.12h后拍照记录细胞形态，24h后收样，westernblot验证emt相关蛋白。westernblot步骤同实施例1。图7是kap1敲除对肺癌a549细胞emt的影响图，其中，图7-a为emt标志物westernblot检测结果图；图7-b为emt形态学改变结果图。实施例11成球实验：1.显微镜观察细胞，当a549-kap1-ko细胞融合度达到80％-90％时，弃去培养基，加入pbs溶液轻轻冲洗一次，并弃去冲洗溶液2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入5％的co2，37℃细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μl的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/ml＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以野生型a549-wt细胞做对照组。4.配置细胞密度为每孔1000个单细胞悬液，然后向细低粘附的6孔板里孔板中加入单细胞悬液，放入细胞培养箱中培养。设置3个复孔。5.细胞置于培养箱内培养10-14天，每2-3天加入100ul培养基，并观察克隆球的形成情况。6.细胞培养14天左右，即可进行拍照计数，用graphpadprism6软件对数据进行统计分析作图。为了验证kap1敲除对肺癌a549细胞干性及侵袭能力的影响，本发明进行成球实验，图8-a为细胞干性表型—细胞成球结果图及统计柱状图。由图8可知，a549野生型细胞成球率显著高于kap1敲除的a549细胞，表明随着kap1表达的消失，a549细胞的干性减弱。实施例12对干性marker的检测，以gapdh、cd44、cd133和kap1蛋白为检测对象，westernblot步骤如实施例1。图8-b为细胞干性标志物westernblot检测结果图。观察到肿瘤细胞干性的变化这一表型后，通过对细胞干性标志物的表达变化的检测进一步证明，kap1是通过影响cd44、cd133两个干性标志物的表达来达到最终影响细胞干性的。实施例13软琼脂克隆形成：1.显微镜观察细胞，当a549-kap1-ko细胞融合度达到80％-90％时，弃去培养基，加入pbs溶液轻轻冲洗一次，并弃去冲洗溶液。2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入5％的co2，37℃细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μl的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/ml＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以野生型a549-wt细胞做对照组。4.配置细胞密度为每孔10000个单细胞悬液，设置3个复孔。5.用无酚红培养基分别配制出1.2％和0.7％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中水浴锅中。6.按1:1比例使1.2％的琼脂糖和无酚红dmem培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取2ml混合液注入6cm的皿中中，冷却凝固，可作底层琼脂置co2温箱中备用。7.按1:1比例让0.7％的琼脂糖和无酚红dmem培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入200μl的细胞悬液(10000个细胞)，充分混匀，加入铺有1.2％琼脂糖底层平板中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5％co2温箱中培养20天。8.把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。用graphpadprism6软件对数据进行统计分析作图。结果见图8-c。图8-c为细胞侵袭表型—软琼脂克隆形成结果图及统计柱状图。由图8-c可知，通过软琼脂模拟体内半固液的状态，并指示单个细胞的恶性程度，kap1敲除之后软琼脂中形成的克隆数量和大小均显著小于野生型，可推断kap1促进了肿瘤细胞的恶性程度。根据图8-a、图8-b和图8-c可知，kap1敲除后肺癌a549细胞的干性及侵袭能力均显著降低。实施例14移植瘤实验选取健康的上述实验裸鼠12只，饲养一周，待体重约为20g，每只裸鼠左侧腋窝皮下注射0.2ml的细胞悬液，细胞浓度5×107个/ml。用游标卡尺测量移植瘤直径大小，动态观察敲除kap1后的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数为每5天一次。30天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。以a549-wt细胞为对照组。肿瘤体积(tumorvolume,tv)的计算公式为：tv＝1/2×a×b2其中a、b分别表示长宽。he染色：石蜡包埋：50％酒精，1小时；70％酒精，1小时；80％酒精，1小时；90％酒精，1小时；95％酒精，1小时；无水酒精，1小时；无水酒精，1小时；无水酒精：二甲苯1:1，1小时；二甲苯透明，时间按组织块大小浮动；二甲苯：石蜡1:1时间按组织块大小浮动；石蜡，1.5小时；石蜡1.5小时。事先将组织块切片，准备好盖玻片，1.脱蜡：脱蜡二甲苯ⅰ、ⅱ各10min2.覆水：100％(ⅰ、ⅱ)、90％、80％、70％酒精各5min，自来水冲洗5min×33.苏木精染色5min(根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间)，流水冲洗。4.5％乙酸分化1min，流水冲洗。(用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅了一些，成为蓝色)5.返蓝：返蓝液(实验室没有，也可不用)6.伊红染色1min(根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间)，流水冲洗。7.脱水：70％、80％、90％、100％酒精各10s，二甲苯1min(可以在通风橱自然晾干再封片，约5min左右)8.滴上中性树胶，封片。(用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡)。测量结果如图9。图9是kap1敲除对肺癌a549细胞裸鼠移植瘤的影响图，其中，图9-a为裸鼠移植瘤结果图；图9-b为裸鼠移植瘤重量统计柱状图；图9-c为裸鼠移植瘤体积统计折线图；图9-d为裸鼠重量统计折线图。由上述结果可知，野生型a549-wt细胞随着时间的延长，肿瘤的体积和质量增加变化较大，而a549-kap1-ko细胞随着时间的延长，肿瘤体积变化不大，肿瘤的质量与野生型a549-wt细胞变化趋势一致。这说明，通过抑制kap1的基因表达，能够有效抑制肿瘤的生长。染色结果如图9-e所示。图9-e为裸鼠移植瘤he染色结果图。将a549细胞中kap1编码基因敲除后，肿瘤细胞形态不规则，结构疏松，胞核变小，细胞分裂相少见。说明kap1敲除后，细胞周期阻滞并影响了肿瘤的形成。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>昆明理工大学<120>肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和kap1作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gggagcgcuuuucgccgccag21<210>2<211>2508<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atggcggcctccgcggcggcagcctcggcagcagcggcctcggccgcctctggcagcccg60ggcccgggcgagggctccgctggcggcgaaaagcgctccaccgccccttcggccgcagcc120tcggcctctgcctcagccgcggcgtcgtcgcccgcggggggcggcgccgaggcgctggag180ctgctggagcactgcggcgtgtgcagagagcgcctgcgacccgagagggagccccgcctg240ctgccctgtttgcactcggcctgtagtgcctgcttagggcccgcggcccccgccgccgcc300aacagctcgggggacggcggggcggcgggcgacggcaccgtggtggactgtcccgtgtgc360aagcaacagtgcttctccaaagacatcgtggagaattatttcatgcgtgatagtggcagc420aaggctgccaccgacgcccaggatgcgaaccagtgctgcactagctgtgaggataatgcc480ccagccaccagctactgtgtggagtgctcggagcctctgtgtgagacctgtgtagaggcg540caccagcgggtgaagtacaccaaggaccatactgtgcgctctactgggccagccaagtct600cgggatggtgaacgtactgtctattgcaacgtacacaagcatgaaccccttgtgctgttt660tgtgagagctgtgatactctcacctgccgagactgccagctcaatgcccacaaggaccac720cagtaccagttcttagaggatgcagtgaggaaccagcgcaagctcctggcctcactggtg780aagcgccttggggacaaacatgcaacattgcagaagagcaccaaggaggttcgcagctca840atccgccaggtgtctgacgtacagaagcgtgtgcaagtggatgtcaagatggccatcctg900cagatcatgaaggagctgaataagcggggccgtgtgctggtcaatgatgcccagaaggtg960actgaggggcagcaggagcgcctggagcggcagcactggaccatgaccaagatccagaag1020caccaggagcacattctgcgctttgcctcttgggctctggagagtgacaacaacacagcc1080cttttgctttctaagaagttgatctacttccagctgcaccgggccctcaagatgattgtg1140gatcccgtggagccacatggcgagatgaagtttcagtgggacctcaatgcctggaccaag1200agtgccgaggcctttggcaagattgtggcagagcgtcctggcactaactcaacaggccct1260gcacccatggcccctccaagagccccagggcccctgagcaagcagggctctggcagcagc1320cagcccatggaggtgcaggaaggctatggctttgggtcaggagatgatccctactcaagt1380gcagagccccatgtgtcaggtgtgaaacggtcccgctcaggtgagggcgaggtgagcggc1440cttatgcgcaaggtgccacgagtgagccttgaacgcctggacctggacctcacagctgac1500agccagccacccgtcttcaaggtcttcccaggcagtaccactgaggactacaaccttatt1560gttattgaacgtggcgctgccgctgcagctaccggccagccagggactgcgcctgcagga1620acccctggtgccccacccctggctggcatggccattgtcaaggaggaggagacggaggct1680gccattggagcccctcctactgccactgagggccctgagaccaaacctgtgcttatggct1740cttgcggagggtcctggtgctgagggtccccgcctggcctcacctagtggcagcaccagc1800tcagggctggaggtggtggctcctgagggtacctcagccccaggtggtggcccgggaacc1860ctggatgacagtgccaccatttgccgtgtctgccagaagccaggcgatctggttatgtgc1920aaccagtgtgagttttgtttccacctggactgtcacctgccggccctgcaggatgtacca1980ggggaggagtggagctgctcactctgccatgtgctccctgacctgaaggaggaggatggc2040agcctcagcctggatggtgcagacagcactggcgtggtggccaagctctcaccagccaac2100cagcggaaatgtgagcgtgtactgctggccctattctgtcacgaaccctgccgccccctg2160catcagctggctaccgactccaccttctccctggaccagcccggtggcaccctggatctg2220accctgatccgtgcccgcctccaggagaagttgtcacctccctacagctccccacaggag2280tttgcccaggatgtgggccgcatgttcaagcaattcaacaagttaactgaggacaaggca2340gacgtgcagtccatcatcggcctgcagcgcttcttcgagacgcgcatgaacgaggccttc2400ggtgacaccaagttctctgctgtgctggtggagcccccgccgatgagcctgcctggtgct2460ggcctgagttcccaggagctgtctggtggccctggtgatggcccctga2508<210>3<211>835<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metalaalaseralaalaalaalaseralaalaalaalaseralaala151015serglyserproglyproglygluglyseralaglyglyglulysarg202530serthralaproseralaalaalaseralaseralaseralaalaala354045serserproalaglyglyglyalaglualaleugluleuleugluhis505560cysglyvalcysarggluargleuargprogluarggluproargleu65707580leuprocysleuhisseralacysseralacysleuglyproalaala859095proalaalaalaasnserserglyaspglyglyalaalaglyaspgly100105110thrvalvalaspcysprovalcyslysglnglncyspheserlysasp115120125ilevalgluasntyrphemetargaspserglyserlysalaalathr130135140aspalaglnaspalaasnglncyscysthrsercysgluaspasnala145150155160proalathrsertyrcysvalglucyssergluproleucysgluthr165170175cysvalglualahisglnargvallystyrthrlysasphisthrval180185190argserthrglyproalalysserargaspglygluargthrvaltyr195200205cysasnvalhislyshisgluproleuvalleuphecysglusercys210215220aspthrleuthrcysargaspcysglnleuasnalahislysasphis225230235240glntyrglnpheleugluaspalavalargasnglnarglysleuleu245250255alaserleuvallysargleuglyasplyshisalathrleuglnlys260265270serthrlysgluvalargserserileargglnvalseraspvalgln275280285lysargvalglnvalaspvallysmetalaileleuglnilemetlys290295300gluleuasnlysargglyargvalleuvalasnaspalaglnlysval305310315320thrgluglyglnglngluargleugluargglnhistrpthrmetthr325330335lysileglnlyshisglngluhisileleuargphealasertrpala340345350leugluseraspasnasnthralaleuleuleuserlyslysleuile355360365tyrpheglnleuhisargalaleulysmetilevalaspprovalglu370375380prohisglyglumetlyspheglntrpaspleuasnalatrpthrlys385390395400seralaglualapheglylysilevalalagluargproglythrasn405410415serthrglyproalaprometalaproproargalaproglyproleu420425430serlysglnglyserglyserserglnprometgluvalglnglugly435440445tyrglypheglyserglyaspaspprotyrserseralagluprohis450455460valserglyvallysargserargserglygluglygluvalsergly465470475480leumetarglysvalproargvalserleugluargleuaspleuasp485490495leuthralaaspserglnproprovalphelysvalpheproglyser500505510thrthrgluasptyrasnleuilevalilegluargglyalaalaala515520525alaalathrglyglnproglythralaproalaglythrproglyala530535540proproleualaglymetalailevallysgluglugluthrgluala545550555560ala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