本发明属于小种鉴定技术领域，具体涉及一种猪链球菌小种分离鉴定方法。
背景技术：
猪链球菌病是由不同群的链球菌引起的一种急性高热性传染病。流行特点是仔猪以败血型和脑膜炎型为主，中、大猪以关节炎型为主，一年四季均可发病，传播迅速，死亡率高。猪链球菌病的病情复杂，流行情况无特征，有的根据临床症状和病理变化可做出初步诊断，有的还需实验室检查，且不同小种的病原菌的致病性不同；该病在诊断时要和急性猪丹毒、猪瘟、猪李氏杆菌病等相区分。
小种又称生理小种、株系等，是指形态上没有明显差异，但在生理生化特性、培养性状、致病性等方面存在差异的同种微生物的不同群体。由于这些小种在致病性等特性上具有明显的差异，因此在做菌种分离和鉴定时往往需要做到小种的水平才具有意义。
在现有技术中，至少存在以下问题：由于各小种之间在形态上没有明显差异，在获取样品并做分离培养后依然无法知道样品中包含有几个小种，具体是什么小种，只能通过一系列分离培养和生理生化测试来鉴别。这导致三个问题，一是某些小种会被漏筛；二是挑取需反复对多个单克隆菌落做生理生化分析来筛选小种；三是无法在链球菌感染后快速针对性的对猪场消毒，杀灭存在的各个链球菌小种。
技术实现要素：
本发的明目的是提供一种猪链球菌小种分离鉴定方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种猪链球菌小种分离鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取需要分离和鉴定的病猪的总核酸，然后构建高通量测序文库；
(2)采用高通量测序的方法对文库进行高覆盖深度的测序，并将测序结果比对到相应物种的参考基因组上；
(3)根据比对结果获取所有的变异位点，然后按照窗口平移获得每个窗口的基因型数目，计算每个窗口的多态性，选择多态性高且处于单拷贝区域作为候选分子标记位点；
(4)在每个分子标记位点的两侧寻找保守区域，在保守区域设计扩增引物；
(5)将需要分离和鉴定的病猪组织样品研磨后做10倍稀释后涂平板，恒温培养后挑取单个的菌落并在新的固体培养基平板上纯合后获得单克隆的菌落；
(6)提取菌落的核酸后用步骤(4)设计的引物进行扩增，对扩增产物测序后分型；
(7)所有分型结果相同的单克隆仅保留一个；若有部分已发现基因型在所有克隆中都不存在，则重新挑取菌落纯化并重复上述过程，直到获得该猪链球菌小种。
进一步地，所述步骤(1)中提取需要分离和鉴定的病猪的总核酸时需要充分裂解细胞，确保提出每个小种的基因组序列。
进一步地，所述步骤(2)中测序时产生的测序片段数量要达到200倍数据，确保所有小种均可以被有效检测到。
进一步地，所述步骤(3)中分子标记位点的筛选以窗口平移的方式进行，窗口长度设为l；在窗口平移的过程中仅仅考虑可以完整覆盖该窗口的测序片段，其他测序片段均不考虑。
进一步地，所述步骤(3)中变异位点的分析以测序片段为单位展开，标记出每条测序片段上与参考基因组不同的每个碱基位点及其突变类型；把具有相同突变碱基位点和突变类型的reads定义为该窗口内的一个基因型。
更进一步地，所述获得该窗口的所有候选基因型，统计每类基因型的测序片段数量，并除以完整覆盖该窗口的测序片段的总数量，从而获得该基因型的频率。
进一步地，混合样品完成基因组测序后获得准确获得所有的基因型，排除错误的基因型。
优选地，所述步骤(3)中选取的分子标记位点在该物种中具有特有的特征片段，且在混合测序的样品中表现出很高的多态性，多态性的计算方法为：
进一步地，所述步骤(3)中选取的分子标记在基因组上处于单拷贝区域，基因组上其他位置不存在对该区域形成干扰的基因组片段；
单拷贝区域的判断标准为：1.基于相似性判断：如果有参考基因组，则首先保证参考基因组上其他位置没有相似性大于90％、匹配长度大于100bp的区段；2.基于测序深度的判断：其测序深度不超过临近区域平均测序深度±3倍标准差，临近区域指的是上下游各1，000bp的基因组区域。
进一步地，所述步骤(4)中分子标记两侧应有适合于引物设计的保守区域；对于长度为l的一个滑动窗口，窗口在基因组上的起始位置设为s，该窗口终止位置为e，则窗口左侧保守区定义为坐标位置小于s、在测序数据中以及已有的数据中均未发现变异的连续n个碱基位点，窗口左侧保守区定义为坐标位置大于e、在测序数据中以及已有的知识中均未发现变异的连续n个碱基位点(n≥50)；
所述保守区内设计的引物3末端不含有低复杂序列，如polya\t\c\g。
进一步地，所述步骤(5)中稀释涂平板后要依据形态特征挑取目标微生物的菌落，并确保挑取的是单个的菌落；在进一步纯化后挑取单克隆菌落，并通过菌落pcr获得每个位点的扩增产物；对扩增产物测序后即可获得每个扩增位点的基因型信息。理论上每个克隆的每个扩增位点只有一个基因型，若出现两个及以上的基因型，且次高丰度的基因与最高丰度的基因型的丰度比值超过0.1；则认为该菌落为非单克隆菌落，需重新纯合；若丰度比值低于0.1，则认为其他次高丰度的基因型为测序错误引入，最高丰度基因型为该扩增位点的真实基因型；
做稀释涂平板时，稀释的倍数应以最低基因型的频率为参考值：低于该值则会造成部分小种在在固体培养基丢失，高于该值则无法确保每个小种的都可以形成单菌落。
优选地，比较两个单克隆菌落是否相同时，要求每个扩增位点的基因型均相同才认为是两者属于同一个小种，否则为不同。
进一步地，一次性确定混合样品中的小种数量，以保证不会漏筛某些小种；各基因型丰度的比值可以确定稀释涂布的倍数，提高筛选的效率。
本发明具有以下优点：
本发明的方法不需要预先知道样品中的小种数量以及丰度等信息，也无需传统的筛选过程中所需要生理生化鉴定试验，只需通过高通量测序和扩增即可分离培养出样品中的全部小种，过程简单、快速且流程规范。对每个单克隆的筛查过程简单、快速、准确，且通量高，普遍适用于临床、农业以及食品等行业快速筛查致病小种，以及从各种复杂环境样品中分离目标微生物小种的研究。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。如未加特殊说明，本发明中所用试剂均为市场上常见试剂，大多数生物技术公司均有销售，且效果等同。
病猪感染的猪链球菌小种的分离和鉴定
本实施例中，病猪的组织样本和猪场内的废水为材料，本实施例的目的是分离鉴定出猪场中存在的猪链球菌的不同小种。
一、混合基因组dna的提取
从病猪肝脏取5mg组织，用去离子水将其表面清洗后加入液氮研磨。然后用purelinkmicrobiome纯化试剂盒(货号：a29790，生产单位为赛默飞世尔科技(中国)有限公司)提取样本总的基因组dna。取猪场中的废水1ml，超声振荡1min后，10000rpm离心沉淀后去掉上清，然后利用上述试剂盒提取其中的总dna。将两种dna合并在一起作为一个样品。
二、高通量测序文库的构建及测序
利用紫外分光光度计(nanodroponec，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)测定核酸的od260/280值为1.90。用qubit对提取核酸进行定量，确定提取的dna浓度达到文库构建的量。采用covarissystem超声波打断仪(covarism220)，将待测dna打断成250bp大小，然后按照iontorrent的全基因组文库构建试剂盒构建面pcr扩增的高通量测序文库。采用iontorrents5高通量测序仪进行测序。
三、多态性分子标记位点的筛选方法
3.1测序片段与基因组序列比对
采用bowtie2(版本号2.1.0)把所有测序片段比对到猪链球菌的参考基因组上，猪链球菌参考基因组的版本号为nc＿009442.1，下载地址为：ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/gca/000/014/305/gca＿000014305.1＿asm1430v1/gca＿000014305.1＿asm1430v1＿genomic.fna.gz，比对参数全部采用默认值。
3.2变异位点分析
根据比对结果统计基因组上的变异位点，方法如下：设定滑动窗口的大小为100bp，窗口每次向前移动30bp；对于每一个窗口，首先统计每条reads的变异位点信息，如基因组上的碱基为a，测序片段上对应的位点为t，则将该位点记录为t；如与基因组上的碱基信息相同，则记录为r。将所有碱基位点的信息作为一个整体表示该测序片段在该窗口上的基因型。由于在测序过程中引入的插入、缺失的发生比例较高，尤其是在简单重复序列的位置发生测序错误的比例会更高，因此我们忽略掉所有的插入、缺失位点，以及出现在简单重复区的所有变异位点。
3.3计算每个窗口的多态性指数。
统计每一个基因型的测序片段数量，并除以完全覆盖该窗口的测序片段的总数，则得到该基因型的百分比频率。该窗口的多态性指数计算公式如下：
3.4分子标记位点的筛选
窗口向前平移30bp，重复步骤3.1－3.3的步骤，从而得到每条染色体上的候选分子标记位点。然后按照多态性的高低选取前30个位点，然后去掉基因组上距离较近的位点，方法如下：设定一个长度为10，000bp的窗口检查该区域内是否有候选多态性位点，若无，则向前延伸5，000bp后重新寻找；若有一个位点，则将该位点保留；若存在多个位点，则选择多态性最高的一个位点保留。本实施例筛选出的高多态性分子标记位点见表1。
表1猪链球菌高多态性分子标记位点
四、引物设计方法
登录lifetechnology公司多重扩增引物在线设计网页https：//ampliseq.com，点击“myreferences”选项，在新跳出的页面中选择“addreference”选项，在跳出的页面中选中自己的参考基因组，并点击“save”，从而将所用的猪链球菌的参考基因组序列上传上去。然后点击”mydesign”选项下的”startanewdesign”选项，从而进入引物设计页面。在跳出的页面中，在“selectgenometouse”选项中选择“custom”，然后选择上述步骤上传的猪链球菌参考基因组序列，然后在“applicationtype”选项选择“dnahotspotdesigns(single－pool)”。然后选择“addtargets”按钮，在新的界面中输入每个候选多态性分子标记位点的起止信息，然后点击“submittargets”选项开始引物设计。引物设计完成后，检测每个引物的3’末端是否有低复杂序列存在，包括连续多个a或者t或者c或者g，以及类似atatat这样的序列：如有，则需要在参考基因组上将此引物在基因组上的对应位点设为n后重新设计。本实施例获得分子标记位点的引物序列见表2。
表2分子标记引物信息
五、利用固体培养基分离样品中的单菌落
取1g患病猪的肌肉组织，用75％的酒精进行表面消毒；然后在研钵内将其磨碎后加入10ml无菌水，震荡1min将其摇匀后从中取1ml做10倍梯度稀释至10－4。猪场废水取1ml放入9ml无菌生理盐水内，震荡5min后从中取1ml和9ml生理盐水混匀。按照如下配方制备兔鲜血平板：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，无菌水1000ml，ph值7.3±0.1，配制完成后置于121℃高压灭菌10min，灭菌后冷却至45～50℃时，加入无菌鲜血达5％(即每100毫升营养琼脂中加入鲜血5～6毫升)倾注于平皿。然后取三个固体培养基平板，每个平板上加入1ml上述稀释液，并将其均匀涂布在平板上。将涂布后的平板放在37℃下恒温培养48小时。
六、单克隆菌落的获得
用接菌环从单菌落挑取少量微生物菌体，在新的平板上划z型线。划线后的平板重新在37℃下过夜培养。如此反复传代三次后获得单克隆菌落。用无菌牙签从每个单克隆菌落上挑取少量菌体加入到如下的pcr反应体系中：10×扩增缓冲液10ul，dntp混合物200ul，引物100pmol，taqdna聚合酶2.5ul，mg2+1.5mmol/l，加双蒸水至100ul。pcr的扩增程序如下：95℃，2分钟；(95℃，10秒；55℃，30秒)×25个循环；4℃保温。
七、各扩增位点的分型
将各个分子标记位点的扩增产物做sanger测序，并将测序结果与已检测到的该位点的所有基因型做比对，与其没有碱基差异的基因型则认为
该位点属于这个的基因型。综合每个扩增位点的基因型信息确定对该单克隆菌落分型，所有分型相同的单克隆菌落即认为是属于同一个小种。本实施例中分离到的猪梨链球菌的小种及其基因型信息见表3。
表3各分子标记在8个鉴定出的小种中的基因型信息
本发明的方法不需要预先知道样品中的小种数量以及丰度等信息，也无需传统的筛选过程中所需要生理生化鉴定试验，只需通过高通量测序和扩增即可分离培养出样品中的全部小种，过程简单、快速且流程规范。对每个单克隆的筛查过程简单、快速、准确，且通量高，普遍适用于临床、农业以及食品等行业快速筛查致病小种，以及从各种复杂环境样品中分离目标微生物小种的研究。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。