化合物、医药组成物及其用途的制作方法

本发明系主张美国专利申请案第62/438,707号(申请日：2016年12月23日)之国际优先权，该申请案之完整内容纳入为本发明专利说明书的一部分以供参照。

【技术领域】

本发明涉及一种化合物及医药组成物及其用途，特别是涉及一种用于调控pcsk9的化合物及医药组成物。

【先前技术】

现有技术中已知，低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)血浆水平的升高是造成胆固醇和脂蛋白代谢紊乱(例如冠心病)的危险因素之一，而藉由ldl受体(ldl-r)的作用，从血浆中清除ldl-c主要是在肝脏进行的。

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(pcsk9)是一种丝氨酸蛋白酶，其与ldl-r结合以调节其在细胞表面的表达。细胞分泌的pcsk9与肝细胞上的ldl-r结合形成复合物，再于溶酶体中内化并降解。此等步骤抑止ldl-r再循环至细胞表面，因此抑制ldl-r在其上的表达，从而提高了ldl-c血浆水平。控制ldl-c血浆水平的方法可藉由调节降低细胞的pcsk9分泌，以降低血浆pcsk9水平，提高肝细胞上的ldl-r，或通过改变pcsk9与ldl-r之间相互作用的动力学来达成。

2015年7月24日，fda批准alirocumab2015年8月27日批准evolocumab(repatha^tm)。而第三种药物bococizumab目前正在进行第3期临床试验。该等药物都是藉由每月或双月注射针对pcsk9的单株抗体，改变pcsk9与ldl-r之间相互作用，以促进肝细胞上的ldl-r并增加肝脏ldl吸收以降低ldl-c血浆水平。目前并无降低细胞分泌pcsk9之药物，因此，设计用于靶向pcsk9蛋白的小分子口服药物将是新的并具有优于抗体药物优势。

因此，提供能有效降低细胞分泌pcsk9的新化合物已成为本领域所欲解决的重要课题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，针对现有技术的不足提供一种化合物、医药组成物及其用途。

为了解决上述的技术问题，本发明所采用的其中一技术方案是，提供一种化合物，其具有式(i)结构：

其中，r1为杂芳基；r2、r3、r5和r6各自独立地为h、卤素、oh、cn、nh2、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-10环烷基、c1-6烷基氨基或c3-10环烷基氨基；r4为c1-6烷基、c1-6烷氧基、c3-10环烷基、c1-6烷基氨基、c3-10环烷基氨基或芳基；r7为c1-6烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-10环烷基、c1-10杂环烷基、芳基或杂芳基；每个l1和l2独立地为直接键、o或nh；m是1、2或3；以及n是0、1、2或3；其中，c1-6烷基、c1-6烷氧基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-10环烷基、c1-10杂环烷基、c1-6烷基氨基、c3-10环烷基氨基、芳基和杂芳基中是经卤素、oh、cn、nh2、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-10环烷基、c1-10杂环烷基、芳基或杂芳基取代或未经取代。

本文中的术语「烷基」意指饱和的直链或支链烃部分，如-ch3或支链的-c3h7；术语“烷氧基”是指-o-烷基，烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基以及第四氧基；术语“链烯基”是指含有一个或多个双键的直链或支链烃部分，如乙烯基或丙烯基；术语“炔基”是指含有一个或多个三键的直链或支链烃，如丙炔基或丁炔基；术语“环烷基”是指非芳族、单环、双环、三环或四环烃，如环己基、环己烯-3-基或金刚烷基；术语“杂环烷基”意指具有一个或多个杂原子(例如o、n、p及s)的非芳族5至8员单环、8至12员双环或11至14员三环环，杂环烷基的实例包括但不限于哌嗪基、咪唑烷基、氮杂环庚烷基、吡咯烷基、二氢噻二唑基、二恶烷基、吗啉基、四氢呋喃基以及四氢呋喃基；术语“烷基氨基”是指被氨基取代的烷基，例如甲氨基或乙氨基；术语“环烷基氨基”是指被氨基取代的环烷基，例如环丙基氨基或环戊基氨基；术语“芳基”是指具有一个或多个芳环的烃基，芳基的实例包括但不限于苯基、亚苯基、萘基、亚萘基、芘基、蒽基及菲基。术语“杂芳基”是指具有一个或多个含有至少一个杂原子(例如n、o或s)的芳环基，杂芳基的实例包括但不限于呋喃基、呋喃基、芴基、吡咯基、噻吩基、恶唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基、喹啉基、异喹啉基以及吲哚基。

除非另有说明，本文提到的烷基，烯基、炔基，环烷基、杂环烷基、烷基氨基、环烷基氨基、芳基以及杂芳基包括经取代及未经取代的基团，环烷基、杂环烷基、芳基以及杂芳基上可能的取代基包括c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-20环烷基、c3-20环烯基、c1-20杂环烷基、c1-20杂环烯基、c1-10烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、羟基、氨基硫代酰基、脒基、胍、脲基、氰基、硝基、酰基、硫代酰基、酰氧基、羧基和羧酸酯。另一方面、烷基上可能的取代基包括所有上述取代基(除c1-10烷基、c2-10烯基以及c2-10炔基之外)；环烷基、杂环烷基、芳基以及杂芳基也可以彼此稠合。

上述化合物包括化合物本身及适用的其盐类、前驱药物及溶剂合物。举例而言，可以在杂环化合物上的阴离子和带正电荷的基团(例如氨基)之间形成盐，合适的阴离子包括氯化物、溴化物、碘化物，硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、甲苯磺酸盐、酒石酸盐。同样地，亦可在杂环化合物上的阳离子和带负电的基团(例如羧酸酯)之间形成盐，合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵阳离子(如四甲基铵离子)，这些化合物更包括含有季氮原子的盐。前驱药物的实例包括酯和其药学上可接受的衍生物，其在给予受试者时能够提供活性杂环化合物。溶剂合物是指在活性杂环化合物和药学上可接受的溶剂之间形成的络合物，药学上可接受的溶剂的实例包括水、乙醇、异丙醇，乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。

本发明的化合物可含有非芳族双键，其可以顺式或反式异构形式存在，此异构式是可预期的。

为了解决上述的技术问题，本发明所采用的另外一技术方案是，提供一种医药组成物，其包含治疗有效量之如本发明上述之式(i)化合物及医药学上可接受的载剂。

为了解决上述的技术问题，本发明所采用的另外再一技术方案是，提供一种医药组成物的用途，其是用于制造用以治疗个体的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)相关疾病的药物。

本发明的一具体实施例中，所述前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)相关疾病是胆固醇和脂蛋白代谢紊乱。

本发明的一具体实施例中，所述胆固醇和脂蛋白代谢紊乱包括但不限于冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化以及高胆固醇血症。

本发明中术语“治疗”是指将一种或多种上述化合物给予具有上述疾病、具有该疾病的症状或该疾病的倾向的受试者，其目的为赋予治疗效果，例如治愈、缓解、改变、影响、改善或预防上述疾病、其症状或其倾向。而术语“有效剂量”是指达到预期治疗效果所需的活性剂剂量，如所属技术领域具有通常知识者所习知的，有效剂量将根据所治疗的疾病的类型、给药途径、赋形剂的使用以及可能同时使用其它药物而有所差异。

有效剂量的测定，对于所属技术领域具有通常知识者而言，无需过度实验仅需要常规技能，即可确定预定用途的有效剂量。需要治疗的个体可为哺乳动物。术语“哺乳动物”是指人类或非人类之哺乳动物，例如：狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠、或小鼠。

为了实施本发明的方法，具有一种或多种上述化合物的组成物可以肠胃外、口服、经鼻、经直肠、局部或口腔给药。本文使用的术语“肠胃外”是指皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、蛛网膜下腔、损伤内或颅注注射以及任何合适的注入技术。

无菌可注射组成物可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的溶液或悬浮液，例如1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中可以使用的是甘露醇、水、林格氏溶液(ringer’ssolution)以及等渗氯化钠溶液。此外，通常使用无挥发性油常用作为溶剂或悬浮介质(例如合成的单或双甘油酯)。脂肪酸可用于制备注射剂，如油酸及其甘油酯衍生物，天然物药理上可接受的油如橄榄油和蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂、羧甲基纤维素或类似的分散剂。其他常用的表面活性剂通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型也可用于配制目的，如tweens、spans或其他类似的乳化剂或生物利用度增强剂。

用于口服给药的组成物可以是任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、锭剂、乳液和水性悬浮液、分散体以及溶液。在锭剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉，通常还可以加入润滑剂如硬脂酸镁；对于胶囊形式的口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉；当口服施予水性悬浮液或乳剂时，活性成分可以悬浮或溶解在与乳化剂或悬浮剂结合的油相中。视需求可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。鼻用气溶胶或吸入组成物可根据药物制剂领域熟知的技术制备。例如，可以使用任何合适的防腐剂或吸收促进剂(例如苯甲醇)或任何增溶剂或分散剂(例如氟碳化合物)将该等组成物制备成盐水溶液。

具有一种或多种上述化合物的药物组成物亦适用于直肠给药的栓剂形式给药。

医药组成物中的载体必须是“可接受的”，即能够与组成物中的活性成分兼容(若能够使其稳定化更佳)且对待治疗之个体无害。一种或多种增溶剂可以用作药物赋形剂用于递送活性化合物。其它载体的例子包括胶体二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠。

本发明的其中一有益效果在于，本发明所提供的化合物、医药组成物及其用途，其能通过“式(i)的化合物”以及“施用有效量的式(i)的化合物”的技术方案，下调pcsk9表达的水平，以治疗个体的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型相关疾病。

为使能更进一步了解本发明的特征及技术内容，请参阅以下有关本发明的详细说明与图式，然而所提供的图式仅用于提供参考与说明，并非用来对本发明加以限制。

【图式简单说明】

图1为经由本发明实施例所提供的化合物处理的hepg2细胞的西方墨点法分析结果。

【实施方式】

以下是通过特定的具体实施例来说明本发明所公开有关“化合物、医药组成物及其用途”的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容了解本发明的优点与效果。本发明可通过其他不同的具体实施例加以施行或应用，本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用，在不悖离本发明的构思下进行各种修改与变更。以下的实施方式将进一步详细说明本发明的相关技术内容，但所公开的内容并非用以限制本发明的保护范围。

为了解决上述的技术问题，本发明所采用的其中一技术方案是，提供一种化合物，其具有式(i)结构：

其中，r1为杂芳基；r2、r3、r5和r6各自独立地为h、卤素、oh、cn、nh2、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-10环烷基、c1-6烷基氨基或c3-10环烷基氨基；r4为c1-6烷基、c1-6烷氧基、c3-10环烷基、c1-6烷基氨基、c3-10环烷基氨基或芳基；r7为c1-6烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-10环烷基、c1-10杂环烷基、芳基或杂芳基；每个l1和l2独立地为直接键、o或nh；m是1、2或3；以及n是0、1、2或3；其中，c1-6烷基、c1-6烷氧基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-10环烷基、c1-10杂环烷基、c1-6烷基氨基、c3-10环烷基氨基、芳基和杂芳基是经卤素、oh、cn、nh2、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-10环烷基、c1-10杂环烷基、芳基或杂芳基取代或未经取代。

具体而言，式(i)化合物中r1是五员杂芳基(例如呋喃基或噻吩基)；r2、r3、r5及r6各自独立地为h或c1-6烷氧基；r4是c1-6烷基或芳基；且r7为c1-6烷基、c1-10杂环烷基或杂芳基；其中，l1是o，且l2为直接键或nh；m是1或2，且n是0、1或2。

本发明的一具体实施例提供式(i)化合物包含：r1是呋喃基或噻吩基；r2、r3、r5及r6各自独立为h或c1-6烷氧基；r4是c1-6烷基或芳基；且r7为c1-6烷基，c1-10杂环烷基或杂芳基；l1是o；l2是直接键；m是1或2，且n是0、1或2。

本发明的另一具体实施例提供式(i)化合物包含：r1是呋喃基或噻吩基；r2、r3、r5及r6各自独立为h或c1-6烷氧基；r4是c1-6烷基或芳基；且r7为c1-6烷基，c1-10杂环烷基或杂芳基；l1是o；l2是nh；m是1或2，且n是0、1或2。

本发明式(i)化合物具有调节pcsk9的生理作用，包括其与低密度脂蛋白受体(ldl-r)的相互作用。这些小分子的pcsk9调节剂可用于降低血液中的低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平，并可用于预防及/或治疗胆固醇与脂蛋白代谢紊乱，如冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化以及高胆固醇血症。

本发明进一步包括含有一种或多种上述式(i)化合物的医药组成物，以及医药组成物用于制造用以治疗个体的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)相关疾病的药物。更进一步而言，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)相关疾病如冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化以及高胆固醇血症。

本发明的式(i)化合物可藉由所属技术领域现有的方法制备。制备方法可参阅r.larock发表的comprehensiveorganictransformations(第二版,vchpublishers1999)；p.g.m.wuts及t.w.greene等人发表于organicsynthesis(第四版,johnwileyandsons2007)的greene’sprotectivegroups；l.fieser以及m.fieser的著作fieserandfieser’sreagentsfororganicsynthesis(johnwileyandsons1994)；l.paquette著作encyclopediaofreagentsfororganicsynthesis(第二版,johnwileyandsons2009)；以及g.j.yu等人2008年发表于j.med.chem.第51卷，第6044至6054页的著作。

本文所提及的化合物可以含有非芳香族双键和一个或多个不对称中心，例如：位在连接于核心芳香环的取代基。因此，此等化合物可作为消旋混合物和外消旋混合物、单一对映异构物、单个非对映立体异构物、非对映体混合物，以及顺式或反式异构体形式。所有这些异构体形式都含括在本发明范围之内。

如此制备的式(i)化合物可以使用体外测定，例如本发明实施例2中描述的pcsk9分泌测定。随后可以使用本领域现有的体内测定评估化合物在降低哺乳动物中的ldl-c血浆水平方面的功效。所选择的化合物可进一步测试以验证其在治疗胆固醇和脂蛋白代谢紊乱或治疗与pcsk9相关的疾病(例如冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化或高胆固醇血症)中的功效，举例而言，可将化合物施予患有冠心病的动物(例如小鼠)，然后评估其治疗效果。根据结果，可以确定合适的剂量范围以及给药途径。

在没有更进一步的阐述下，相信由以上之叙述足以呈现本发明。因此，接下来的实施例是纯粹做为解说性之实例，无论如何不受限于其余以任何形式公开的事情。所有在此文中被引用之刊物皆已全部整合于参考文献中。

本发明之实施例将进一步列举以下的实例说明，本发明所属技术领域中具通常知识者可以藉由本案说明书了解该等实例例仅用于说明本发明，各种修改和变化在不偏离本发明的范围下为可行的，因此，下述的实施例仅作为本发明代表性的不同面向及特征，而非用来限制本发明。

下列显示了12种式(i)例示性化合物的结构。制备该等化合物的方法以及化合物的结构鉴定数据均列于实施例1中。在实施例2至6中则进一步描述这些化合物的分析测试程序。

以及

接者，合成式(i)化合物反应步骤流程，即反应流程1及2：

反应流程1

反应流程2

本发明所有的化学品和溶剂皆可由商业供应商购得，并按原样使用。上述合成反应均在干燥的氮气气氛下进行，使用merck60f254硅胶玻璃平板(5×10cm)藉由tlc监测反应；并且在紫外线(254nm)照射下或者通过喷洒磷钼酸试剂(aldrich)，在80℃下加热来目视检测区域。所有管柱层析色谱法是使用merckkieselgel60,9385的astm硅胶(230至400目)作为固定相进行。

质子核磁共振谱(¹h)以varianmercury-300或varianmercury-400核磁共振仪测量，化学位移(chemicalshifts)以相对于溶剂峰的共振的标度(δ)记录为百万分率(ppm)。以下缩写用于描述耦合：s＝单峰；d＝双峰；t＝三重峰；q＝四重峰；quin＝五重峰；br＝宽峰；以及m＝多重峰。液相层析质谱(lcms)数据由agilentmsd-1100esi-ms/ms、agilent1200系列lc/msdvl以及watersacquityuplc-esi-ms/ms系统进行测量。

[实施例1]：式(i)化合物的合成

(a)合成第一支链的步骤：

反应流程3

在25℃下，n-((第三丁基氧基)羰基)亚氨基二乙酸(2.33g，10mmol)在二氯甲烷(dcm)(30ml)溶液中以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edci)(1.98g，10.3mmol)处理。将反应混合物在25℃下搅拌1小时，然后加入胺类(1.26g，12mmol)，并将溶液在25℃下搅拌20小时。将反应混合物倒入10％hcl(aq)(100ml)中，并用dcm(100ml×2)萃取，混合物的有机相用10％hcl(aq)(80ml×2)及饱和食盐水nacl(aq)(100ml×2)洗涤、干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩，得到纯化的n-((第三丁基氧基)-羰基)亚氨基二乙酸单酰胺。

反应流程3a

在25℃下，n-((第三丁基氧基)-羰基)亚氨基二乙酸(2.33g，10mmol)在二氯甲烷(dcm)(30ml)溶液中用碳酰二亚胺(edci)(1.98g，10.3mmol)处理。将混合物在25℃下搅拌1小时，然后加入胺类化合物(1.26g，12mmol)，并将溶液在25℃下搅拌20小时。将反应混合物倒入10％hcl(aq)(100ml)中并用dcm(100ml×2)萃取。有机相用10％hcl(aq)(80ml×2)和饱和食盐水nacl(aq)(100ml×2)洗涤、干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩，得到纯化的n-((第三丁基氧基)羰基)亚氨基二乙酸单酰胺(流程图产物2，产率82％，2.573g)。

¹hnmr(500mhz，cdcl3)：δ1.38(d,j＝41.9hz,9h),3.92(d,j＝22.0hz,2h),4.00(s,2h),4.44(s,2h),6.24(s,1h),6.28(s,1h),7.32(s,1h),7.94(d,j＝326.5hz,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c14h20n2o6-h]^-311.12，实测值311.30[m+h]⁺。

(b)合成第二支链的步骤：

反应流程4

将n-((第三丁基氧基)-羰基)亚氨基二乙酸单酰胺(4.8mmol)溶于dcm(15ml)中。该溶液用胺类化合物(1eq)、edci(1.2eq)、hobt(1.2eq)以及et3n(1.5eq)处理，将该溶液在25℃下搅拌20小时候，将混合物倒入水中并以dcm(40ml×2)萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)(50ml×2)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并真空浓缩。通过mplc(meoh/dcm＝1/19)纯化粗产物以得到纯化的二酰胺。

反应流程4a

以edci(439.3mg，2.30mmol)、hobt(294.4mg，2.30mmol)以及et3n(0.32ml，2.30mmol)处理前述步骤的产物2(478.8mg，1.53mmol)、4-苯氧基苯胺(340.8mg，1.84mmol)的无水dcm(15ml)混合溶液。在室温下搅拌混合物隔夜。将混合物倒入水中并用dcm萃取。有机相用饱和食盐水溶液洗涤、干燥、过滤并真空浓缩。使用mplc(dcm:meoh＝95:5)纯化粗产物，得到预期产物3(流程图产物3，581.3mg，产率80％)。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)：δ10.90以及9.86(twos,total1h),7.70以及7.63(twom,total2h),7.31(m,3h),7.06(t,1h,j＝7.35hz),6.98(m,4h),6.31(m,2h),4.52(d,2h,j＝5hz),4.04-3.89(threes,total4h),1.40以及1.37(twos,total9h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c26h29n3o6+h]⁺480.52，实测值480.42[m+h]⁺。

反应流程4b

将n-((第三丁基氧基)-羰基)亚氨基二乙酸单酰胺(流程图化合物2，1.5g，4.8mmol)溶于dcm(15ml)中。该溶液用胺类化合物(1eq)、edci(1.2eq)、hobt(1.2eq)以及et3n(1.5eq)处理。将该溶液在25℃下搅拌20小时。将混合物倒入水中并用dcm(40ml×2)萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)(50ml×2)洗涤、干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(meoh/dcm＝1/19)纯化粗产物，得到纯化的二酰胺(流程图产物4，产率60％，1.432g)。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)：δ1.40(s,9h),3.96(t,j＝34.6hz,4h),4.52(t,j＝5.1hz,2h),6.24-6.35(m,2h),6.90-7.04(m,6h),7.35(s,1h),7.63(d,j＝8.8hz,1h),7.70(d,j＝8.8hz,1h),9.90(s,1h),10.92(s,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c26h28fn3o6+h]⁺498.20，实测值498.25[m+h]⁺。

合成ppc-014以及ppc-019

反应流程5

反应流程6

制备boc去保护基化合物的一般反应流程：

n'-((第三丁基氧基)羰基)-n,n-二取代的亚氨基二乙酸二酰胺(2.88mmol)溶于tfa:dcm(v/v)＝1：1中，混合物在25℃下持续搅拌1小时。真空除去溶剂。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以得到预期的产物。

ppc-014

无色油状。产率：92％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ2.76(t,j＝7.2hz,2h),3.06(t,j＝7.0hz,2h),3.49(m,4h),3.73(m,4h),3.80(s,3h),3.83(s,3h),6.77(m,1h),6.85(m,3h),6.93(m,1h),7.22(d,j＝5.1hz,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c20h27n3o4s+h]⁺406.1722，hrms(esi)：m/z实测值406.1809[m+h]⁺。

ppc-019

无色油状。产率：95％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ3.05(t,j＝7.0hz,2h),3.51(t,j＝7.0hz,2h),3.88(s,2h),4.00(s,2h),6.87(s,1h),6.9(m,1h),6.9(m,1h),6.93(m,4h),7.08(t,j＝7.3,1h),7.19(d,j＝5.0hz,1h),7.32(t,j＝7.8,2h),7.56(d,j＝8.8,2h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c22h23n3o3s+h]⁺410.1460，hrms(esi)：m/z实测值410.1546[m+h]⁺。

合成ppc-020以及ppc-036

反应流程7

将ppc-014(0.25mmol)、羧酸(0.25mmol)、edci(0.30mol)，hobt(0.3mol)、et3n(0.05ml)、dmf(2ml)的混合溶液在25℃下搅拌20小时。将该混合物倒入10％hcl(aq)中并用etoac萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)洗涤。将有机相干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供预期的加成产物。

ppc-020

无色油状。产率：62％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ1.99(s,9h),2.05(d,j＝42.15hz,2h),2.79(m,2h),3.03(m,2h),3.43(m,2h),3.51(m,2h),3.76(s,3h),3.77(s,3h),3.93(s,2h),4.09(d,j＝9.95hz,2h),6.76(m,1h),6.87(m,4h),7.19(d,j＝5.04,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c26h37n3o5s+h]⁺504.2454，hrms(esi)：m/z实测值504.2545[m+h]⁺。

ppc-036

无色油状。产率：32％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ2.77(d,j＝6.4hz,2h),3.04(m,2h),3.51(m,4h),3.66(s,3h),3.73(s,3h),4.14(m,2h),4.42(m,2h),6.66(m,3h),6.86(m,3h),7.06(t,j＝7.5hz,1h),7.16(s,1h),7.23(t,j＝7.5hz,1h),7.43(d,j＝8.1hz,1h),7.54(s,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c29h32n4o5s+h]⁺549.2093，hrms(esi)：m/z实测值549.2179[m+h]⁺。

合成ppc-038、ppc-039、ppc-045、ppc069以及ppc070

反应流程8

将ppc-019(0.25mmol)、羧酸(0.25mmol)、edci(0.30mol)、hobt(0.3mol)、et3n(0.05ml)以及dmf(2ml)的混合溶液在25℃搅拌20小时。再将该混合物倒入10％hcl(aq)中并用etoac萃取。饱和食盐水nacl(aq)洗涤，并将有机相干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以得到预期的产物。

ppc-038

白色固体。产率：78％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ2.05(m,2h),3.05(m,2h),3.34(m,2h),3.48(m,2h),3.55(m,1h),3.81(m,2h),4.10(d,j＝17.5,2h),4.33(m,2h),6.87(m,2h),6.93(m,4h),7.10(m,1h),7.15(d,j＝5.3,1h),7.29(d,j＝7.6,2h),7.56(d,j＝8.9,1h),7.61(d,j＝8.9,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c27h29n3o5s+h]⁺508.1828，hrms(esi)：m/z实测值508.1896[m+h]⁺。

ppc-039

黄色固体。产率：25％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ3.03(m,2h),3.52(m,2h),4.30(m,2h),4.56(m,2h),6.79(m,3h),6.93(m,4h),7.06(t,j＝7.3,3h),7.21(t,j＝7.3,3h),7.30(t,j＝8.3,2h),7.42(t,j＝8.3,1h),7.57(d,j＝8.0,3h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c31h28n4o4s+h]⁺553.1831，hrms(esi)：m/z实测值553.1904[m+h]⁺。

ppc-045

白色固体。产率：78％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ0.92(dd,j＝2.0,6.6,6h),2.12(m,2h),2.21(m,1h),3.05(dt,j＝6.8,21.4,2h),3.51(dt,j＝6.8,29.6,2h),4.09(d,j＝16.4,2h),4.24(d,j＝43.7,2h),6.87(d,j＝5.0,2h),9.41(m,4h),7.06(m,1h),7.15(m,1h),7.30(t,j＝5.7,2h),7.59(dd,j＝8.9,24.8,2h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c27h31n3o4s+h]⁺494.2035，hrms(esi)：m/z实测值494.2109[m+h]⁺。

ppc-069

白色固体。产率：78％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ3.05(m,2h),3.51(m,2h),4.30(d,j＝24.9,2h),4.49(d,j＝45.7,2h),6.85(m,2h),6.87(m,4h),6.95(m,1h),7.31(d,j＝7.6,1h),7.48(m,1h),7.55(m,4h),8.50(d,j＝12.3,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c26h24n4o5s+h]⁺505.1467，hrms(esi)：m/z实测值505.1533[m+h]⁺。

ppc-070

白色固体。产率：81％。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ0.13(m,2h),0.52(t,j＝6.6,2h),1.30(m,1h),2.19(m,2h),3.06(m,2h),3.52(m,2h),4.11(m,2h),4.22(m,2h),6.88(m,2h),6.95(m,4h),7.07(m,2h),7.31(m,2h),7.80(m,2h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c27h29n3o5s+h]⁺492.1879，hrms(esi)：m/z实测值492.1944[m+h]⁺。

合成ppc-021以及ppc-027

反应流程9

将ppc013(0.25mmol)、羧酸(0.25mmol)、edci(0.30mol)、hobt(0.3mol)、et3n(0.05ml)以及dmf(2ml)的溶液在25℃下搅拌20小时。将该混合物倒入10％hcl(aq)中并用etoac萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)洗涤。将有机相干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供预期的加成产物。

ppc-021

无色油状。产率：80％。

¹hnmr(500mhz,dmso)：δ0.96(m,9h),2.09(s,1h),2.16(s,1h),4.02-4.37(m,6h),6.29(s,1h),6.39(s,1h),6.94-7.10(m,5h),7.35(m,2h),7.57-7.60(m,3h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c27h31n3o5+h]⁺478.2336，hrms(esi)：m/z实测值478.2354[m+h]⁺。

ppc-027

白色固体。产率：40％。

¹hnmr(500mhz,dmso)：

δ4.27-4.41(m,4h),4.51(s,1h),4.60(s,1h),6.29(d,j＝28.02hz,1h),6.90(s,1h),6.69(d,j＝39.94hz,1h),6.95(d,j＝8hz,2h),7.01(m,3h),7.09(t,j＝7.35hz,1h),7.20(t,j＝7.43hz,1h),7.35(t,j＝7.82hz,2h),7.42(m,1h),7.54-7.67(m,4h),11.66(d,j＝9.4hz,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c30h26n4o5-h]-523.1975，hrms(esi)：m/z实测值523.1984[m+h]⁺。

合成ppc-017以及ppc-018

反应流程10

将ppc004(0.25mmol)、羧酸(0.25mmol)、edci(0.30mol)、hobt(0.3mol)、et3n(0.05ml)以及dmf(2ml)的混合溶液在25℃下搅拌20小时。将该混合物倒入10％hcl(aq)中并用etoac萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)洗涤。将有机相干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供预期的产物。

ppc-017

无色油状。产率：40％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)：δ2.80(m,2h),3.58(m,

2h),3.70-3.86(m,6h),4.05(m,2h),4.36(m,2h),4.52(m,2h),6.29(m,2h),6.74(m,4h),7.12(m,1h),7.26-7.31(m,2h),7.39(d,j＝8.28hz,1h)7.63(d,j＝8.04,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c28h30n4o5+h]^-519.2238，hrms(esi)：m/z实测值519.2256[m+h]⁺。

ppc-018

无色油状。产率：62％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)：

δ2.00(m,2h),2.75-2.85(m,2h),3.04-3.09(m,1h),3.52-3.54(m,2h),3.76-3.84(m,2h),3.84-3.88(m,10h),4.03-4.09(m,2h),4.48(m,2h),6.24-6.33(m,2h),6.73-6.82(m,3h),7.35(d,j＝14.5,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c24h31n3o7+h]⁺474.2234，hrms(esi)：m/z实测值474.2251[m+h]⁺。

合成ppc111

反应流程11

将胺类产物(ppc-091，199mg，0.5mmol)、羧酸(0.5mmol)、edci(0.6mmol)、hobt(0.6mmol)、et3n(0.5ml)以及dmf(3ml)的混合溶液在25℃搅拌20小时。将该混合物倒入水中并用etoac萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)洗涤。将有机相干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供预期的加成产物(ppc-111，产率43％，115mg)。

¹hnmr(500mhz,meod)：δ4.34-4.42(m,2h),4.43-4.47(m,2h),4.58-4.67(m,2h),6.20-6.33(m,2h),6.90-6.98(m,4h),7.03-7.09(m,2h),7.28-7.31(m,2h),7.38-7.52(m,3h),7.67-7.70(m,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c30h24fn3o6+h]⁺542.17，实测值542.10[m+h]⁺。

合成ppc-128

将胺类产物(ppc-127,190mg，0.5mmol)、酰氯(0.5mmol)、et3n(2.5ml)、thf(4ml)的混合溶液在25℃下搅拌16小时。将混合物倒入水中，并用etoac萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)洗涤。将有机相干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供期望的加成产物(ppc-128，产率7％，17.7mg)。

¹hnmr(500mhz,dmso)：δ2.26(s,3h),4.26-4.59(m,6h),4.41(s,2h),6.26以及6.32(twos,total1h),6.39(s,1h),6.64以及6.72(twos,total1h),6.87(d,j＝8.0hz,2h),6.96(d,j＝8.0hz,2h),7.04(m,1h),7.15-7.19(m,3h),7.41(m,1h),7.61(m,4h),8.86以及9.13(twos,total1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c31h28n4o5+h]⁺536.21，实测值536.84[m+h]⁺。

合成ppc-146

将胺类产物(ppc-131，199mg，0.5mmol)、酰氯(0.5mmol)、et3n(0.5ml)、dcm(3ml)的混合溶液在25℃下搅拌20小时。将混合物倒入水中并用dcm萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)洗涤。将有机相干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供期望的加成产物ppc-146。

¹hnmr(500mhz,dmso)：δ3.74(s,3h),4.23-4.42(m,6h),6.13-6.41(m,2h),6.63(d,j＝34.3hz,1h),7.08-7.16(m,5h),7.23-7.27(m,1h),7.48-7.66(m,4h),7.69-7.73(m,3h),8.78-8.83(m,1h),10.62(d,j＝25.5hz,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c32h27f3n4o5+h]⁺605.19，实测值605.23[m+h]⁺。

合成ppc157

将n'-((第三丁基氧基)羰基)-n,n-二取代亚氨基二乙酸二酰胺(1.18mmol)溶解于tfa:dcm(v/v)＝1：1中，将该混合物在25℃下搅拌1小时。真空除去溶剂。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供预期的产物(ppc-157，产率99％，529mg)。

¹hnmr(500mhz,dmso)：δ3.27-3.48(m,4h),3.50(s,2h),3.65(s,2h),3.72(s,2h),4.12(s,2h),4.35(d,j＝5.30hz,2h),6.32(s,1h),6.42(s,1h),7.09(d,j＝8.43hz,2h),7.54(d,j＝8.43hz,2h),7.61(s,1h),8.87(s,1h),8.97(s,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c20h23f3n4o3+h]⁺425.17，实测值425.25[m+h]⁺。

合成ppc-163

将胺类产物(ppc-162，199mg，0.5mmol)、酰氯(0.5mmol)、et3n(0.5ml)以及dcm(3ml)的混合溶液在25℃下搅拌20小时。将混合物倒入水中并用dcm萃取。有机相用饱和食盐水nacl(aq)洗涤。将有机相干燥(mgso4)、过滤并真空浓缩。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供预期的加成产物(ppc-163，％，mg)。

¹hnmr(500mhz,dmso)：δ4.34(d,j＝9.75hz,2h),4.52-4.64(m,4h),6.73(s,1h),6.93-7.11(m,6h),7.20(s,1h),7.34-7.38(m,2h),7.42-7.44(m,1h),7.58-7.66(m,3h),8.54-8.60(m,2h),8.69(d,j＝11.65hz,1h),9.22(d,j＝110.70hz,1h),10.72(d,j＝239.20hz,1h),11.68(d,j＝21.95hz,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c30h26n6o4+h]⁺535.20，实测值535.12[m+h]⁺。

合成ppc-168

将胺(ppc-162，199mg，0.5mmol)、异氰酰基环丙烷(0.5mmol)以及dcm(3ml)的溶液在25℃下搅拌20小时。将混合物真空浓缩去除溶剂。通过mplc(dcm/meoh＝19/1)纯化残余物以提供预期的加成产物ppc-168。

¹hnmr(500mhz,dmso)：δ0.33-0.37(m,2h),0.50-0.54(m,2h),4.03(d,j＝6.65hz,4h),4.45-4.50(m,2h),6.70(d,j＝2.60hz,1h),6.92-7.01(m,4h),7.09(t,j＝7.35hz,1h),7.36(t,j＝8.35hz,2h),7.57-7.65(m,2h),8.51-8.64(m,3h),9.02(s,1h),10.58(s,1h)。

lcms(esi)：m/z理论值[c25h26n6o4+h]⁺475.20，实测值475.21[m+h]⁺。

[实施例2]：使用式(i)化合物进行抑制pcsk9分泌试验。

建立抑制pcsk9分泌的细胞筛选试验，藉由暂时性转染系统于293细胞中含有人类基因完整长度pcsk9序列(ncbi参考识别，nm_174936.2)的pcmv-pcsk9-myc-ddk载体(origenetechnologies)来进行。

将293细胞培养于含有10％胎牛血清的dmem中的6孔盘中。第二天早上用genejuice转染试剂(novagene)pcsk9重组构建体转染细胞。24小时后，通过胰蛋白酶处理收集转染的细胞，并重新培养于含有10％fbs的dmem培养基的96孔盘中，以每孔2×10⁴个细胞的密度培养。将化合物以连续稀释液溶于dmso中，然后加入到测定盘中，使终浓度为30或10μm，然后再培养43小时。在pcsk9测定前5小时，将细胞培养基更换为含有相同浓度的化合物或载体的无血清dmem培养基。收集组织培养基，并根据制造商的实验步骤，以alphalisakit(alphakits#al270c，perkinelmer)测定分泌到细胞培养基中的pcsk9的量。使用enspiremultilabel仪器读取数值(每秒计数)。同时建立含有0.5％dmso的培养基作为对照，实验二重复进行。

实验结果如下表1，是藉由dmso对照组的百分比表示，其使用下式计算：

pcsk9分泌量(％)＝stc/sc×100(％)

stc是待测化合物存在下的数值

sc是dmso对照组的数值

表1

[实施例3]：式(i)化合物的细胞毒性试验

为了排除由于细胞毒性的原因造成pcsk9分泌减少而进行细胞毒性试验，将293细胞在测定培养基中以2×10⁴个细胞/孔的密度培养于96孔盘中。每孔加入30或10μm的化合物。培养48小时后，使用mts试剂(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羟基甲氧基苯基)-2-(4-磺酸基苯基)-2h-四唑，promega)评估细胞活性并记录于表2。

表2

[实施例4]：在hepg2细胞中检测ldl的西方墨点法(westernblot)

hepg2细胞裂解物藉由sds-page电泳而分离，并转移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。将膜与人类抗体ldlr培养，然后再与1：2000稀释度的hrp缀合的第二抗体与初级igs进行培养，西方墨点法的分析结果请参阅图1。

[实施例5]：藉由elisa对herceptinab分泌量进行定量

本发明实施例所提供的化合物对pcsk9分泌抑制的选择性抑制作用藉由计数筛选进行测试，用以测试其对另一种稳定细胞系表达的活性和分泌赫赛汀(herceptin)抗体。该测定是使用识别不同赫赛汀抗原表位的两种抗体(a和b)的三明治免疫分析法。简而言之，将等份的稀释的培养基覆盖在用抗-赫赛汀抗体a涂覆的孔上。培养1小时后，洗涤各孔，用hrp缀合的抗-herceptin抗体b溶液覆盖，并培养1小时。将它们再次洗涤，并用四甲基联苯胺溶液覆盖作为hrp的呈色受质。15分钟后，用硫酸铵终止反应，用分光光度法在450nm测定反应混合物的吸光度。上述所有的步骤都是在室温下进行的。

[实施例6]：本发明实施例的化合物对ldl的摄取实验

将hepg2细胞以2×10⁴个细胞/孔的细胞密度及0.1ml10％fbsdmem培养基条件下培养于96黑色底孔盘中，并在37℃培养72小时。用pbs冲洗，用0.1ml含有dmso或10μm、3μm以及1μm浓度的化合物的10％charcoalfreefbsdmem培养基覆盖，再于37℃培养24小时。

为了测定ldl摄取能力，用预热37℃的无血清dmem冲洗细胞，并覆盖0.1ml无血清dmem，在37℃培养1小时。将它们用含有10μg/ml硼-二毗咯亚甲基类化合物-ldl(bodipy-ldl)的0.1ml无血清dmem覆盖，然后在于37℃孵育2.5小时使ldlr-介导的荧光脂蛋白产生内吞作用。使用冰冷的pbs/0.4％fbs终止该过程。使用0.2ml冰冷的pbs/0.4％fbs冲洗4次后，将细胞用0.15ml0.1％sds以及0.1nnah溶液在避光条件振荡10分钟。在spectramaxi3x荧光板阅读器(moleculardevices)中分别在485nm及525nm的激发和发射波长下测量细胞内莹光。藉由将细胞在含有bodipy-ldl(10μg/ml)以及50倍过量的非荧光ldl(500μg/ml)的培养基中培养来测量非特异性荧光，ldl摄取结果如表3所示。

表3

[实施例的有益效果]

本发明的其中一有益效果在于，本发明所提供的化合物、医药组成物及其用途，其能通过“式(i)的化合物”以及“施用有效量的式(i)的化合物”的技术方案，下调pcsk9的表达水平，以治疗个体的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型相关疾病。

进一步而言，本发明式(i)化合物具有调节pcsk9的生理作用，包括其与低密度脂蛋白受体(ldl-r)的相互作用。这些小分子的pcsk9调节剂可用于降低血液中的低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平，并可用于预防及/或治疗胆固醇与脂蛋白代谢紊乱疾病，如冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化以及高胆固醇血症。

以上所公开的内容仅为本发明的优选可行实施例，并非因此侷限本发明的申请专利范围，所以凡是运用本发明说明书及图式内容所做的等效技术变化，均包含于本发明的申请专利范围内。

【符号说明】

无