本发明涉及脲酶抑制剂技术领域，尤其是一种酰腙铜(ii)配合物及其制备方法及其在抑制脲酶活性中的应用。
背景技术：
酰腙是一类特殊的席夫碱化合物，含有–ch=n–nh–c(o)–官能团，它是由酰肼和醛或酮发生缩合反应而形成的产物。酰腙化合物具有多种优良的生物活性，有报道表明其在抑制脲酶活性中也有良好的性能。
一些金属盐具有很强的抑制脲酶的活性，尤其是铜盐、银盐等，但是其作为重金属离子，还具有较强的毒副作用，难以推广应用。
酰腙具有o、n等给体原子，易于与各种过渡金属离子形成配合物。酰腙与铜也很容易形成配合物。在形成配合物后，铜离子的毒副作用可以得到明显降低。由于配合物是有机配体和金属离子的复合物，而且具有适当的稳定性，可以缓慢解离出相应的具有抑制脲酶活性的配体和金属离子，起到缓释的作用。同时配合物本身也具有良好的抑制脲酶的活性。
考虑到脲酶活性中心的结构特点，以及酰腙本身给体原子较少等因素，在合成铜配合物的过程中，还引入硫氰酸根配体。基于此,本发明制备了一个酰腙铜(ii)配合物，具有良好的抑制脲酶活性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有抑制脲酶活性效果好、产率高的酰腙铜(ii)配合物及其制备方法以及酰腙铜(ii)配合物在脲酶抑制剂领域中的应用。
本发明的酰腙铜(ii)配合物，具有下式x所示的结构：
本发明的酰腙铜(ii)配合物的制备方法，所述的酰腙铜(ii)配合物具有下式x所示的结构：
酰腙铜(ii)配合物合成过程如下：
酰腙铜(ii)配合物合成步骤为：
1)、将吡啶-2-甲醛和4-溴苯甲酰肼分别溶于无水甲醇中，然后混合搅拌，在反应容器中制得结构如式1所示的化合物，其中搅拌时温度为20±10˚c；吡啶-2-甲醛与4-溴苯甲酰肼的用量比为0.1mol︰0.1mol；吡啶-2-甲醛与无水甲醇的用量比为0.1mol︰100ml；4-溴苯甲酰肼与无水甲醇的用量比为0.1mol︰100ml；
2）、向所述反应器中加入含高氯酸铜的甲醇溶液和含硫氰酸铵的甲醇溶液，其中高氯酸铜与吡啶-2-甲醛的用量比为0.1mol︰0.1mol；硫氰酸铵与吡啶-2-甲醛的用量比为0.1mol︰0.1mol；提取得到结构如式2所示的化合物，即制得酰腙铜(ii)配合物；
所述步骤1）进一步为：在20±10˚c搅拌作用下，将0.1mol的吡啶-2-甲醛和0.1mol的4-溴苯甲酰肼分别溶于圆底烧瓶内的100ml无水甲醇中，然后在20±10˚c下在反应器中混合搅拌,tlc跟踪反应，反应1h后，减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体粗产物用冷的甲醇洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于甲醇重结晶得到结构如式1所示的化合物。
所述步骤2）进一步为：在20±10˚c搅拌作用下，向反应器中加入0.1mol的高氯酸铜和0.1mol的硫氰酸铵的甲醇溶液100ml，反应1h后，减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体用冷的甲醇洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于甲醇重结晶得到结构如式2所示的化合物。
一种酰腙铜(ii)配合物在抑制脲酶活性中的应用，所述的酰腙铜(ii)配合物的结构式为下式x所示：
本发明的有益效果如下：
本制备方法有效整合了具有抑制脲酶活性的酰腙和铜盐，实验可重复性强，稳定性好，实验反应所需条件简单，且实验环境温和，产率高，可在较小投入情况下进行大量生产。本发明的酰腙铜(ii)配合物对脲酶活性有较高的抑制能力，在浓度为50μg·ml-1时抑制率为95.1%，其ic50值为0.18±0.02μg·ml-1。
附图说明
图1是酰腙铜(ii)配合物对脲酶的抑制作用图（时间-吸光度曲线）；
图2是酰腙铜(ii)配合物对脲酶的抑制作用图（浓度-抑制率曲线）。
具体实施方式
本发明的酰腙铜(ii)配合物，其具有式x所示的结构，
酰腙铜(ii)配合物的合成过程：
上述的酰腙铜(ii)配合物的合成包括下列步骤：
步骤1：在20±10˚c搅拌作用下，将10.7g（0.1mol）的吡啶-2-甲醛和21.5g（0.1mol）的4-溴苯甲酰肼分别溶于圆底烧瓶内的100ml无水甲醇中，然后在20±10˚c下混合搅拌,tlc跟踪反应，反应1h后，减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体粗产物用冷的甲醇洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于甲醇重结晶得到结构如上式1所示的化合物；各物质的摩尔比为吡啶-2-甲醛:4-溴苯甲酰肼=1:1，反应时间为1h；进一步优选的温度分别为10˚c、30˚c，优选的反应时间30min。
步骤2：在20±10˚c搅拌作用下，向圆底烧瓶中加入37.1g（0.1mol）的高氯酸铜和7.6g（0.1mol）的硫氰酸铵的甲醇溶液100ml，反应1h后，减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体用冷的甲醇洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于甲醇重结晶得到结构如上式2所示的化合物；各物质的摩尔比为1：高氯酸铜：硫氰酸铵=1:1:1，反应时间1h；进一步优选的温度为20˚c，优选的反应时间为30min。
步骤3：在20±10˚c下，将如式2所示的化合物0.1g溶于50ml甲醇，通过缓慢挥发溶剂的方法制得其单晶，时间是5天，单晶结构如下式4所示：具体说是在20±10˚c下，将该酰腙铜(ii)配合物0.1g溶于50ml甲醇中，通过缓慢挥发溶剂的方法得到深蓝色单晶。将单晶过滤出来，干燥，经单晶x-射线衍射分析得到如式3所示的结构。
本发明的一个详细实施方式如下：
步骤1：在20±10˚c搅拌作用下，将10.7g（0.1mol）的吡啶-2-甲醛和21.5g（0.1mol）的4-溴苯甲酰肼分别溶于圆底烧瓶内的100ml无水甲醇中，然后在20±10˚c下混合搅拌,tlc跟踪反应，反应1h后，减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体粗产物用冷的甲醇洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于甲醇重结晶得到结构如式1所示的无色晶体状化合物。产率95%。1hnmr(dmso-d6,500mhz)δ(ppm):8.62(d,1h,pyh),8.48(m,1h,pyh),7.95(d,2h,arh),7.83(m,3h,pyhandarh),7.65(t,1h,pyh),7.43(s,1h,ch=n),4.06(s,1h,nh).13cnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm):164.22,153.18,150.54,148.35,136.88,132.00,131.57,129.79,128.32,125.72,119.94.irdata(kbr,cm-1):3230,1654,1589,1545,1466,1432,1323,1305,1279,1145,1072,1059,1007,917,846,777,741,668,650,619.
步骤2：在20±10˚c搅拌作用下，向圆底烧瓶中加入37.1g（0.1mol）的高氯酸铜和7.6g（0.1mol）的硫氰酸铵的甲醇溶液100ml，反应1h后，减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体用冷的甲醇洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于甲醇重结晶得到结构如式2所示的深蓝色晶体状化合物。产率56%。irdata(kbr,cm-1):3450,2043,1653,1447,1372,1161,1070,952,860,535.uvdata(nm):270,370。
步骤3：将如式2所示的深蓝色晶体状化合物0.1g溶于50ml甲醇，通过缓慢挥发溶剂，得到深蓝色块状单晶。
分子式：c15h13brcun4o2s；分子量：456.8；单斜晶系，p21/n空间群；晶胞参数：a=7.3009(5)å，b=17.3938(13)å，c=13.7578(10)å，β=96.6290(10)°，v=1735.4(2)å3，z=4，r1=0.0382，ωr2=0.0924。
步骤4：酰腙铜(ii)配合物抑制脲酶活性的研究
(1)缓冲溶液的配置：
称取31.2g磷酸二氢钠和71.6g磷酸氢二钠，都先配制成1000ml的溶液，然后利用体积比来配置不同ph值的磷酸盐缓冲液。
配置ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的体积比为255:245。
配置ph=7.7的磷酸盐缓冲溶液，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的体积比为502.5:449.75。
(2)脲酶溶液和底物的配置：
称取24mg的脲酶放入经过高锰酸钾洗过的棕色瓶子中，加入6mlph=6.8的磷酸盐缓冲溶液，振荡使脲酶充分溶解，备用。
量取100mlph=6.8的缓冲溶液，加入0.002％(2mg)的苯酚红和500mmol尿素配制ph=6.8的底物溶液。
同样量取100mlph=7.7的缓冲溶液，加入0.002％(2mg)的苯酚红配制成ph=7.7的底物溶液。
(3)配置1mg·ml-1的待测物溶液：
称量1mg样品,加入1mldmso，配制成浓度为1mg·ml-1待测溶液。
(4)设计96孔板：
空白：用100μl微量移液管量取25μl脲酶，加入用10μl移液管量取的2.5μldmso，继续加入22.5μlph=6.8的磷酸盐缓冲溶液，预孵育3小时。
样品：用100μl微量移液管量取25μl脲酶，加入用10μl移液管量取的2.5μl样品，继续加入22.5μlph=6.8的磷酸盐缓冲溶液，预孵育3小时。
标准：用100μl微量移液管量取50μlph=7.7磷酸盐缓冲溶液。
其中样品和标准曲线分别做3次，空白曲线做6次，以减小实验误差。
(5)测量脲酶抑制活性：
孵育3小时后，向96孔板的空白和样品孔中加入200μlph=6.8的底物溶液，向标准孔中加入200μlph=7.7的底物溶液，立即放入酶标仪中，设置温度37℃，时间为40min，570nm波长吸收光，测试吸光度值。
(6)ic50测试：
ic50是指酶催化反应被抑制一半时抑制剂的浓度，可以用来衡量样品的抑制活性，ic50值越低,反应这个化合物的抑制活性越好。
将酰腙铜(ii)配合物溶液分为5个梯度浓度(μg·ml-1):0.001，0.01，0.1，1，10。按照上一步同样的实验方法测试它们的吸光度值。
(7)配合物的抑制脲酶活性：
以时间（min）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线（图1）。脲酶与尿素反应产生氨，使底物溶液的ph值升高，含有苯酚红的底物溶液颜色从黄色变为红色。酰腙铜配合物通过抑制脲酶的活性，使其催化尿素水解产生氨的速率减慢。用酰腙铜配合物曲线斜率比上空白曲线斜率，比值越小说明吸光值变化越小，其抑制活性越好。
根据图1，计算浓度为50μg·ml-1酰腙铜配合物对脲酶的抑制活性。其计算公式为：
抑制率（%）=（1–k样品/k空白）×100%=95.1%。
本发明还测试了酰腙铜配合物抑制脲酶活性的ic50值。通过绘制不同浓度下抑制脲酶活性曲线。以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制曲线（图2）。其ic50值为0.18±0.02μg·ml-1。
因此，本发明的酰腙铜(ii)配合物可以应用于有效抑制脲酶的活性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。