本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤结合物及其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)为嘌呤类代谢抑制剂，能以脱氧戊糖核苷形式存在于细胞DNA中，以戊糖核苷形式存在于RNA中。它与6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)有交叉耐药性，但对阿糖胞苷抗药的肿瘤仍有效。动物实验证明，6-硫鸟嘌呤和阿糖胞苷合用，毒性低而疗效更佳。对阿糖胞苷耐药的情况下，6-硫鸟嘌呤和阿糖胞苷合用也有利，因当阿糖胞苷抑制正常细胞后，在一定时间内，骨髓已无能力渗入6-TG，而耐药性的肿瘤细胞DNA合成速度不降，仍可渗入6-TG，结果正常骨髓不受6-TG影响，而肿瘤细胞大量死亡。6-TG和6-MP一样，其对细胞有丝分裂的影响可被辅酶A所抵消。一般认为6-TG为一细胞周期S相的特异性药物(CCSA)。6-TG在体内很快变成2-氨基-6-甲基-巯基嘌呤，以6-硫代尿酸形式由尿液排出。
聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步发生加成聚合而得到的一类水溶性聚醚。分子中既有醚链，又有羟基,故具有独特的溶解性能,能与水、醇混溶，微溶于醚。PEG在修饰小分子药物时，可以将它的许多优良特性随之赋予所形成的新的化合物，如提高被修饰药物的水溶性、增加生物相容性、盖上组织分布、降低毒性作用、延长半衰期和增强疗效等，特别是一些药物由于在体内代谢快，半衰期短，多次给药或为了增加给药浓度而增加给药剂量，造成毒副作用增加，使得患者耐受较差，给患者带来身体不适，此外一些药物如抗肿瘤、抗血压药物的治疗需要持续很长时间，反复给药使不良反应更加严重，并易产生抗药性；而PEG修饰小分子药物可以解决这一难题，这使得许多疗效显著但由于其疏水性和毒性大等缺点而限制临床引用的小分子药物有了新的发展前景。
本发明通过对硫鸟嘌呤的PEG修饰，以增加其水溶性，延长其药物的体内循环半衰期，降低药物的毒副作用，提出一种聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤结合物及其制备方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤结合物及其制备方法及其在抗肿瘤药物方面的应用，该聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤结合物在体内循环半衰期长，且经过修饰的硫鸟嘌呤毒副作用低。
本发明涉及一种聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤结合物，其结构式为：
其中PEG为聚乙二醇，分子量为1000-10000，其可以具有直链、支链、星型或者树型结构，i为1-3的整数；D为硫鸟嘌呤的残基，其结构为：
进一步地，所述PEG具有以下结构：其中，R为甲基，乙基，异丙基，环己烷，苄基，环氧乙烷，烷氧基、环烷氧基、芳烷基，氨基，羟基或羧基中的一种。
进一步地，所述i为整数3，PEG分子量为2000，R为环氧乙烷。
进一步地，所述聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤结合物具有以下结构：
进一步地，所述聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤结合物的合成路线为：
所述步骤1)的化合物1与化合物2反应得到化合物3；
所述步骤2)的化合物3与化合物4缩合得到化合物5；
所述步骤3)化合物5与化合物6加成得到化合物7。
进一步地，所述步骤1)是以1M碳酸氢钠溶液为溶剂的条件下于0-20℃的反应温度，2-6h的反应时间下进行的。
进一步地，所述步骤2)是以二氯甲烷为溶剂，HATU为缩合剂，DMAP为催化剂的条件下，于0-35℃的反应温度，12-24h的反应时间下进行的。
进一步地，所述步骤3)是以PH＝8的磷酸盐缓冲溶液为溶剂的条件下于0-10℃的反应温度，12-24h的反应时间下进行的。
进一步地，所述聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤结合物用于制备抗肿瘤药物的应用。
本发明具有以下有益效果：
1.PEG修饰后的硫鸟嘌呤衍生物，其水溶性增强，药物半循环周期延长，并同时增加了药物活性；
2.PEG上同时负载多个硫鸟嘌呤，可减少其用药次数，减少其多次用药带来的副作用易减轻患者痛苦；
3.聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤衍生物具有良好的缓释效果。
具体实施方式
下面结合实施例描述本发明的结合物及其制备方法，它不限制本发明，本发明的范围由权利要求限定。
化合物3的制备
将0.1mol化合物1加入到100ml1M的碳酸氢钠溶液中，然后在冰浴下分批缓慢加入0.2mol化合物2，然后室温搅拌3h。反应完毕，二氯甲烷萃取，旋干，层析柱纯化，得到0.093mol化合物3，收率：93％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：6.923(s，4H)；4.461(t，J＝4.4Hz，1H)；3.482(t，J＝4.8Hz，2H)；1.781(t，J＝4.0Hz，2H)；1.556(t，J＝4.0Hz，2H)；1.294(t，J＝4.0Hz，2H)。
实施例1：化合物7a(PEG1000)的制备
化合物5a(PEG1000)的制备
将0.33mol化合物3溶于300ml二氯甲烷中，加入0.33mol的DCC，0.1molDMAP，并25℃搅拌1h。然后加入0.1mol化合物4a，搅拌12h。反应完毕，抽滤反应液，旋干滤液，二氯甲烷溶解，再次抽滤，旋干，得到粗品。粗品用二氯甲烷和甲基叔丁基醚重结晶，得到0.095mol化合物5a。收率：95％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：6.923(s，12H)；4.461(t，J＝4.4Hz，3H)；4.250(t，J＝4.4Hz，6H)；3.895(m，3H)；3.651～3.543(m，70H)；3.482(t，J＝4.8Hz，6H)；3.297(t，J＝4.0Hz，6H)；2.704～2.679(m，12H)；1.901(t，J＝4.0Hz，6H)；1.556(t，J＝4.0Hz，6H)；1.294(t，J＝4.0Hz，6H)；0.541(m，6H)。
化合物7a(PEG1000)的制备
将0.1mol化合物5a溶解于200ml0.2M的磷酸盐缓冲溶液(PH＝8.0)中，加入0.66mol的硫鸟嘌呤。5℃搅拌18h。反应完毕，二氯甲烷萃取3次，旋干，得到粗品。粗品用重结晶纯化，得到0.097mol化合物7a。收率：97％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：8.683(s，6H)；4.461(t，J＝4.4Hz，3H)；4.250(t，J＝4.4Hz，6H)；3.895(m，3H)；3.772(m，6H)；3.651～3.543(m，70H)；3.482(t，J＝4.8Hz，6H)；3.297(t，J＝4.0Hz，6H)；3.097(t，J＝4.4Hz，12H)；2.704～2.679(m，12H)；1.901(t，J＝4.0Hz，6H)；1.556(t，J＝4.0Hz，6H)；1.294(t，J＝4.0Hz，6H)；0.541(m，6H)。
实施例2：化合物7b(PEG2000)的制备
化合物5b(PEG2000)的制备
将0.33mol化合物3溶于300ml二氯甲烷中，加入0.33mol的DCC，0.1molDMAP，并25℃搅拌1h。然后加入0.1mol化合物4b，搅拌12h。反应完毕，抽滤反应液，旋干滤液，得到粗品。粗品用层析柱纯化，得到0.097mol化合物5b。收率：97％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：6.923(s，12H)；4.461(t，J＝4.4Hz，3H)；4.250(t，J＝4.4Hz，6H)；3.895(m，3H)；3.651～3.543(m，160H)；3.482(t，J＝4.8Hz，6H)；3.297(t，J＝4.0Hz，6H)；2.704～2.679(m，12H)；1.901(t，J＝4.0Hz，6H)；1.556(t，J＝4.0Hz，6H)；1.294(t，J＝4.0Hz，6H)；0.541(m，6H)。化合物7b(PEG2000)的制备将0.1mol化合物5b溶解于200ml0.2M的磷酸盐缓冲溶液(PH＝8.0)中，加入0.66mol的硫鸟嘌呤。5℃搅拌18h。反应完毕，二氯甲烷萃取3次，旋干，得到粗品。粗品用层析柱纯化，得到0.097mol化合物7b。收率：97％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：8.683(s，6H)；4.461(t，J＝4.4Hz，3H)；4.250(t，J＝4.4Hz，6H)；3.895(m，3H)；3.772(m，6H)；3.651～3.543(m，160H)；3.482(t，J＝4.8Hz，6H)；3.297(t，J＝4.0Hz，6H)；3.097(t，J＝4.4Hz，12H)；2.704～2.679(m，12H)；1.901(t，J＝4.0Hz，6H)；1.556(t，J＝4.0Hz，6H)；1.294(t，J＝4.0Hz，6H)；0.541(m，6H)。
实施例3：化合物7c(PEG5000)的制备
化合物5c(PEG5000)的制备
将0.33mol化合物3溶于300ml二氯甲烷中，加入0.33mol的DCC，0.1molDMAP，并25℃搅拌1h。然后加入0.1mol化合物4c，搅拌12h。反应完毕，抽滤反应液，旋干滤液，得到粗品。粗品用层析柱纯化，得到0.097mol化合物5c。收率：97％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：6.923(s，12H)；4.461(t，J＝4.4Hz，3H)；4.250(t，J＝4.4Hz，6H)；3.895(m，3H)；3.651～3.543(m，430H)；3.482(t，J＝4.8Hz，6H)；3.297(t，J＝4.0Hz，6H)；2.704～2.679(m，12H)；1.901(t，J＝4.0Hz，6H)；1.556(t，J＝4.0Hz，6H)；1.294(t，J＝4.0Hz，6H)；0.541(m，6H)。
化合物7c(PEG5000)的制备
将0.1mol化合物5c溶解于200ml0.2M的磷酸盐缓冲溶液(PH＝8.0)中，加入0.66mol的硫鸟嘌呤。5℃搅拌18h。反应完毕，二氯甲烷萃取3次，旋干，得到粗品。粗品用层析柱纯化，得到0.098mol化合物7c。收率：98％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：8.683(s，6H)；4.461(t，J＝4.4Hz，3H)；4.250(t，J＝4.4Hz，6H)；3.895(m，3H)；3.772(m，6H)；3.651～3.543(m，430H)；3.482(t，J＝4.8Hz，6H)；3.297(t，J＝4.0Hz，6H)；3.097(t，J＝4.4Hz，12H)；2.704～2.679(m，12H)；1.901(t，J＝4.0Hz，6H)；1.556(t，J＝4.0Hz，6H)；1.294(t，J＝4.0Hz，6H)；0.541(m，6H)。
实施例4：化合物7d(PEG10000)的制备
化合物5d(PEG10000)的制备
将0.33mol化合物3溶于300ml二氯甲烷中，加入0.33mol的DCC，0.1molDMAP，并25℃搅拌1h。然后加入0.1mol化合物4d，搅拌12h。反应完毕，抽滤反应液，旋干滤液，得到粗品。粗品用层析柱纯化，得到0.098mol化合物5d。收率：98％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：6.923(s，12H)；4.461(t，J＝4.4Hz，3H)；4.250(t，J＝4.4Hz，6H)；3.895(m，3H)；3.651～3.543(m，880H)；3.482(t，J＝4.8Hz，6H)；3.297(t，J＝4.0Hz，6H)；2.704～2.679(m，12H)；1.901(t，J＝4.0Hz，6H)；1.556(t，J＝4.0Hz，6H)；1.294(t，J＝4.0Hz，6H)；0.541(m，6H)。
化合物7d(PEG10000)的制备
将0.1mol化合物5d溶解于200ml0.2M的磷酸盐缓冲溶液(PH＝8.0)中，加入0.66mol的硫鸟嘌呤。5℃搅拌18h。反应完毕，二氯甲烷萃取3次，旋干，得到粗品。粗品用层析柱纯化，得到0.098mol化合物7d。收率：98％。核磁数据如下：1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ：8.683(s，6H)；4.461(t，J＝4.4Hz，3H)；4.250(t，J＝4.4Hz，6H)；3.895(m，3H)；3.772(m，6H)；3.651～3.543(m，880H)；3.482(t，J＝4.8Hz，6H)；3.297(t，J＝4.0Hz，6H)；3.097(t，J＝4.4Hz，12H)；2.704～2.679(m，12H)；1.901(t，J＝4.0Hz，6H)；1.556(t，J＝4.0Hz，6H)；1.294(t，J＝4.0Hz，6H)；0.541(m，6H)。
实施例5：本发明化合物的抗肿瘤活性实验
为了测定抗肿瘤的效果，取对数生长期的人慢性粒细胞白血病细胞株(K562)和人早幼粒细胞白血病细胞株(HL-60)，用完全培养基调整细胞浓度为5x104个/mL的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100uL。于二氧化碳培养箱中贴壁细胞培养24小时，弃去原有培养液，按每3个孔为一个检测浓度加入含有待测试药物的培养液100uL，继续培养72小时，每孔加5mg/mL的MTT溶液20uL，置培养箱内4h后。实验中另设培养液空白对照及未加药处理的细胞对照。室温低速震荡后在酶标仪测定各孔在57Onm波长处的吸光度(OD)值。计算各孔(OD)值的平均数，并计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)。
表1：
通过以上实验数据可知，对比硫鸟嘌呤，在其他条件都相同的条件下，其注射聚乙二醇赖氨酸马来酰亚胺硫鸟嘌呤衍生物对人慢性粒细胞白血病细胞株(K562)和人早幼粒细胞白血病细胞株(HL-60)都有明显的抑制增殖作用，且比硫鸟嘌呤的抑制增殖作用强。其中实施例3对人慢性粒细胞白血病细胞株(K562)和人早幼粒细胞白血病细胞株(HL-60)都具有最好的抑制作用。