青虾视蛋白基因及其编码的蛋白和应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种功能基因的克隆及应用，具体为青虾视蛋白基因的克隆，及利用该基因的cdna为模板合成dsrna，并以dsrna来影响青虾卵巢中卵黄蛋白原基因表达。
背景技术：
：青虾，学名日本沼虾(macrobrachiumnipponense)，俗称河虾，隶属十足目(decapoda)、长臂虾科(palaemonidae)、沼虾属(macrobrachium)，广泛分布于淡水和低盐度河口地区的亚洲国家，是我国农业增效、农民增收的重要途径之一。据2016年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾的年产值近200亿元人民币，是目前淡水养殖业中最有发展前途的品种之一。在规模化养殖中发现，雌性青虾在进入繁殖期(4-10月)后，性腺发育成熟的周期大大缩短，并在池塘大量繁殖后代，导致多代同堂、养殖密度过高、饲料消耗大、缺氧风险大，同时影响了原有雌虾的生长，导致普遍小型化，上市规格虾大幅度减少，此现象在秋季时更为严重，俗称“秋繁”。“秋繁”严重影响了青虾的品质和产值，成为青虾养殖业发展的一大瓶颈。因此，开展日本沼虾卵巢成熟调控机制的研究，对解决雌性青虾“秋繁”问题和实现青虾产业的可持续发展意义重大。视蛋白(opsin)属于g蛋白偶联受体家族(gprotein-coupledreceptors,gpcr)，包括一个胞外氨基末端、七个跨膜结构域和一个胞内羧基末端。近年来，在脊椎动物方面的研究表明，一些视蛋白作为深脑感光器，参与下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamuspituitary-gonadaxis,hpga)的调节，从而影响性腺的发育。在甲壳类动物中，其性腺成熟调控形式高度多样化，不仅受到内源神经内分泌的调控，同时受到外源环境因子(如温度、光周期、食物和盐度等)的显著影响。然而，这个网络的路径至今仍不是十分明了，而对一些与外源环境因子有关的关键基因(如视蛋白基因)以及这类基因对甲壳类卵巢发育调控的分子机制的研究相对空白。rnai(rnainterference,rnai)作为一种有价值的研究工具，用于抑制特定基因的表达从而用来研究基因的功能。rnai的干扰作用是由不同来源和长度的双链rna(double-strandedrna,dsrna)前体所诱发的，可以有效地抑制靶基因rna的翻译。近年开始在甲壳动物基因功能研究中使用。目前，甲壳类中关于opsin基因的沉默表达尚未见报道。技术实现要素：解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，为解决青虾性早熟提供理论基础，本发明提供了青虾视蛋白基因及其编码的蛋白和应用。技术方案：青虾视蛋白基因，所述基因的核苷酸序列为seqidno:1。优选的，所述基因编码的氨基酸序列为seqidno:2。所述的青虾视蛋白基因在抑制青虾卵巢卵黄蛋白原(vitellogenin，vg)合成中的应用。优选的，所述应用的步骤为根据seqidno:1核苷酸序列的开放阅读框，设计rnai引物，以青虾总cdna为模板进行pcr扩增得到dsrna，并将dsrna通过围心腔注射进入青虾体内。进一步的，所述dsrna核苷酸序列的上下游引物为seqidno:3～4。进一步的，dsrna注射到青虾围心腔的剂量为4μg/g。有益效果：(1)本发明明晰了外源环境因子有关的关键基因对甲壳类卵巢发育调控的分子机制，为解决青虾性早熟提供理论基础；(2)本发明根据青虾视蛋白基因核苷酸序列合成的dsrna注射入青虾围心腔内，可以有效地减少青虾卵巢中卵黄蛋白原基因表达，从而对青虾卵巢发育具有非常重要的影响。附图说明图1是眼内注射外源性opsindsrna，雌性青虾opsin基因的表达量变化图；图2是卵巢中注射外源性opsindsrna，雌性青虾opsin基因的表达量变化图；图3是卵巢中注射外源性opsindsrna，雌性青虾vg基因的表达量变化图。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1青虾opsin基因全长cdna的获得总rna提取：选取3-4只成熟雌虾，无菌解剖摘取眼组织，在rna保存液(takarabioinc.japan)中将眼柄色素夹破，并进行漂洗预处理后，用takaratrizol试剂盒进行青虾眼柄总rna的提取，具体操作步骤参照试剂盒的使用说明书。用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的完整性，使用biophotometer紫外分光光度计测定所提取rna的浓度和od值，通常a260/a280在1.8～2.0之间，即满足实验要求。第一链cdna合成：参照takaram-mlv反转录试剂盒，将上述总rna合成第一链cdna。青虾opsin基因全长cdna的获得：根据日本沼虾雌虾繁殖期和非繁殖期眼和脑转录组文库筛选出的视蛋白片段，设计引物组(seqidno:5～6)和以上述青虾眼rna反转录的总cdna为模板进行中间片段的克隆验证。进行pcr扩增反应体系和反应程序如下：反应体系：反应组分含量(μl)cdnatemplate110×pcrbuffer2.5mgcl2(25mm)2.5dntpmixture(25mmeach)4taqdnapolymerse0.25ddh2o12.75forwardprimer1reverseprimer1total25反应程序：利用上海生工生物工程有限公司(sangon)的柱式dna胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pmd18-t载体，并转入大肠杆菌dh5α，进行蓝白斑筛选，挑选单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。根据青虾视蛋白opsin基因中间片段序列，按照takara3'-race和takara5'-race试剂盒进行cdna3'和5'快速扩增，操作步骤根据试剂盒说明书进行。设计特异性正向引物为f1(seqidno:7)、f2(seqidno:8)、f3(seqidno:9)和反向引物为r1(seqidno:10)、r2(seqidno:11)。将上述克隆得到的产物进行随后的切胶、回收、转化、克隆及测序最终得到opsin基因的3'和5'端的cdna序列。将中间片段和3'和5'端的测序结果进行比对，拼接得到青虾opsin基因全长cdna序列，如seqidno:1所示。实施例2青虾opsin基因dsrna的合成根据seqidno:1核苷酸序列，用ncbi在线dsrna引物设计软件(http://www.flyrnai.org/cgi-bin/rnai_find_primers.pl)在核苷酸序列开放阅读框内设计制备双链rna的引物(seqidno:3-seqidno:4)，以青虾总cdna为模板，根据transcriptaidtmt7highyieldtranscriptionkit(fermentas,inc.,usa)试剂盒说明书进行体外转录合成dsrna。将制备好的dsrna溶解在depc水中，在1.5％琼脂糖凝胶上检测其纯度并用分光光度计测定其浓度。将处于卵巢发育初期(刚排完卵)的雌性青虾平均分为两组(实验组和对照组)，实验组以4ug/g的剂量注射dsrna溶液，对照组以4ug/g的剂量注射depc水，同时在注射后的第6天进行相同物质、相同剂量的第二次注射。以第一次注射为时间点，注射后的第1、5、9和13天收集样品，每个采样点至少设计3个生物重复，并将采集的眼和卵巢组织保存在rna保存液(takara)中。最后提取各样品的总rna并反转成cdna，采用realtimepcr检测opsin基因实验组相对于对照组的表达量变化，以此来检测opsin基因dsrna的干扰效果。同时在实验组和对照组中卵巢vg基因的表达量变化，被用来衡量opsin基因的表达对卵巢发育机制的影响。结果如下：如图1所示，在眼中，相对于对照组，注射opsindsrna第5天之后，opsin基因的mrna表达量下降了90％以上；其中，1d,5d,9d,13d分别为第一次注射后1，5，9，和13天(n≥3)，对照组注射相同剂量的depc水。如图2所示，在卵巢中，相对于对照组，注射opsindsrna后第5天，opsin基因的mrna表达量下降到最低，在第9天之后下降了70％以上；其中，1d,5d,9d,13d分别为第一次注射后1，5，9，和13天(n≥3)，对照组注射相同剂量的depc水。如图3所示，在卵巢中，相对于对照组，注射opsindsrna第9天之后，vg基因的mrna表达量显著下降了；其中，1d,5d,9d,13d分别为第一次注射后1，5，9，和13天(n≥3)，对照组注射相同剂量的depc水。卵黄蛋白原(vg)是卵黄蛋白的前体，作为一种营养资源，性腺的发育是很重要的。在成熟雌性对虾中，性腺成熟取决于繁殖期卵母细胞中卵黄蛋白的快速合成和积累。这个结果提供的证据表明青虾视蛋白基因对促进卵巢发育中起着重要的作用。这一结果为进一步研究青虾卵巢发育机制提供了新思路，也为解决青虾性早熟这一难题提供了理论基础，对实践生产具有指导意义。序列表<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心<120>青虾视蛋白基因及其编码的蛋白和应用<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1382<212>dna<213>macrobrachiumnipponense<400>1caagaagatatgatgtagttaaagaacagagcaaggcagcatctcgaacagaatagatct60atcgttcgtgcaactgcctatcttgttttttaactacatcatatcttcttgataagatgg120gttactgggatgatccttcaaagatggcaggtaatacactgccatccacgaacccttacg180ggaactacaccgtagtcgacacggtgccccatcatctcctccatttagtggatgttcact240ggtaccagtttcctcctatgaaccctctctggtataatttgattgctgtatggatggttg300ttatgggcctcctcgctgttggcggcaacttcgttgttatctgggtcttcatgaacacca360agtctctcaggactcccgctaacatgtatgttgtgaatttggctttctctgactttggta420tgatgttaaccatgtgcccaccaattttggttaactgctattaccagacttgggctttca480gtgatatggcttgccaaatttatggtctactggggtcaagttttggaactatatctattt540ggacaatgatcttcattactttggatcgttacaatgtcattgtgaagggtctctctgcaa600cacctttgacttctaaagctgctttgttaagaattttctttgtatgggcacaaacattct660tctggggtcttcttcctctgtttggcttctgtagatatgttcctgagggtaacatgaccg720cctgtggcactgactatctcacagaagagctctggagtcatttatacctgtatttttatg780cctttgattgctacatcttccctctcttcttaatcatctattgctatgggtacatcatga840aagctgttgccactcacgagaggcagatgcgtgaacaggccaagaagatgggagtgaagt900ccctgagaaatgacccagagtccaagaagacttcaaacgagtgccgtctcgcaaaggtcg960cccttacaactgtgtccctatggtttattgcatggactccctactttgtcatcaatatgg1020caggtctcttatacaagcctatggttactcctctgttttcaatttggggttctgtcttcg1080ccaaggccaatgctgtgtacaaccctattatctacgctatcagccatcctaaatacagag1140ctgctatggaaaagaagttaccttgcctctcatgtgctactgacagagatgaagatgcca1200gttccactggtgatgcgacaacggttgctgatgaaaaggcttgagcattttgagcctccg1260ccttaagttttgtaagaaccaggaaacccaaaacaatgaaaacaaagacctttaaacttg1320atatttttctttttgatcccctgataaattcattggaccctttaaaattaaaaaaaaaaa1380cc1382<210>2<211>375<212>prt<213>macrobrachiumnipponense<400>2metglytyrtrpaspaspproserlysmetalaglyasnthrleupro151015serthrasnprotyrglyasntyrthrvalvalaspthrvalprohis202530hisleuleuhisleuvalaspvalhistrptyrglnphepropromet354045asnproleutrptyrasnleuilealavaltrpmetvalvalmetgly505560leuleualavalglyglyasnphevalvaliletrpvalphemetasn65707580thrlysserleuargthrproalaasnmettyrvalvalasnleuala859095pheserasppheglymetmetleuthrmetcysproproileleuval100105110asncystyrtyrglnthrtrpalapheseraspmetalacysglnile115120125tyrglyleuleuglyserserpheglythrileseriletrpthrmet130135140ilepheilethrleuaspargtyrasnvalilevallysglyleuser145150155160alathrproleuthrserlysalaalaleuleuargilephepheval165170175trpalaglnthrphephetrpglyleuleuproleupheglyphecys180185190argtyrvalprogluglyasnmetthralacysglythrasptyrleu195200205thrglugluleutrpserhisleutyrleutyrphetyralapheasp210215220cystyrilepheproleupheleuileiletyrcystyrglytyrile225230235240metlysalavalalathrhisgluargglnmetarggluglnalalys245250255lysmetglyvallysserleuargasnaspprogluserlyslysthr260265270serasnglucysargleualalysvalalaleuthrthrvalserleu275280285trppheilealatrpthrprotyrphevalileasnmetalaglyleu290295300leutyrlysprometvalthrproleupheseriletrpglyserval305310315320phealalysalaasnalavaltyrasnproileiletyralaileser325330335hisprolystyrargalaalametglulyslysleuprocysleuser340345350cysalathraspargaspgluaspalaserserthrglyaspalathr355360365thrvalalaaspglulysala370375<210>3<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3taatacgactcactatagggtctctcaggactcccgctaa40<210>4<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4taatacgactcactatagggtcagggacttcactcccatc40<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ggatgatccttcaaagatggcag23<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aacaacgaagttgccgcc18<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ggatgatccttcaaagatggcag23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gtaatacactgccatccacgaac23<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9agtgaagtccctgagaaatgacc23<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gaggcccataacaaccatccata23<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ggcccataacaaccatccataca23当前第1页12