水凤仙花产碱杆菌及微生物菌剂和它们在畜禽养殖废弃物资源化中的应用的制作方法

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种水凤仙花产碱杆菌及微生物菌剂和它们在畜禽养殖废弃物资源化中的应用。

背景技术：

近年来，我国禽畜养殖业发展迅猛，并逐渐趋于规模化、集约化。在禽畜养殖业中，抗生素作为治疗疾病的药物和动物生长促进剂的使用量越来越大。由于大多数抗生素不能被动物机体有效吸收，会随尿液或粪便排出体外，从而对环境造成污染。

在畜禽养殖废弃物资源化的过程中，抗生素、耐药菌等有害物质的去除情况还鲜有研究关注。针对常规堆肥技术用微生物存在对抗生素降解效率低、对耐药菌削减效果不明显等问题，筛选一种对抗生素和耐药菌均具有较好削减作用的微生物菌剂，可以有效地改善畜禽养殖废弃物资源化产品的品质和安全性能，也有助于自然环境中抗生素和耐药菌的进一步传播和扩散污染。

技术实现要素：

为了克服现有畜禽养殖废弃物资源化中抗生素和耐药菌的削减效率低等缺陷，本发明提供了一种削减效率更高的水凤仙花产碱杆菌。

本发明的发明人分离了一株水凤仙花产碱杆菌，发现其可以高效地去除四环素类(四环素、多西环素、金霉素、土霉素等)；磺胺类(磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑等)；喹诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等)；大环内酯类(红霉素、泰勒霉素、替米考星)等畜禽养殖中常用的抗生素，同时还具有优异的去除耐药菌的效果，可以实现畜禽养殖废弃物高效、安全资源化利用，由此得到了本发明。

本发明提供一种水凤仙花产碱杆菌，该水凤仙花产碱杆菌(alcaligenesaquatilis)的保藏编号为cgmccno.14474。

本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌。

本发明还提供了如上所述的水凤仙花产碱杆菌和如上所述的微生物菌剂在畜禽养殖废弃物资源化中的应用。

本发明的保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌具有优异地降解抗生素的能力，含有该水凤仙花产碱杆菌的微生物菌剂能够高效降解抗生素，将该水凤仙花产碱杆菌及微生物菌剂用于禽畜养殖废弃物的资源化中时，能够有效降低养殖废弃物中抗生素和耐药菌的浓度，从而提高畜禽养殖废弃物资源化的安全性和使用范围。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏

本发明的水凤仙花产碱杆菌是本发明的发明人从杭州余杭区径山镇求是村采集的猪粪堆肥样品中分离的纯培养物，其保藏编号为cgmccno.14474，保藏日期为2017年7月31日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为水凤仙花产碱杆菌(alcaligenesaquatilis)。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明第一方面提供一种水凤仙花产碱杆菌，该水凤仙花产碱杆菌(alcaligenesaquatilis)的保藏编号为cgmccno.14474。

本发明的水凤仙花产碱杆菌可以在常规的细菌培养基中存活并生长繁殖。本发明如上所述的水凤仙花产碱杆菌是一株非常优异的抗生素降解菌，能够非常高效快速地降低禽畜养殖废弃物中的抗生素和耐药菌含量。

本发明第二方面提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌。

其中，微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克微生物菌剂中，保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌的活菌数可以为10⁸-10¹¹cfu，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌的活菌数可以为10⁹-10¹⁰cfu。

根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养水凤仙花产碱杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基、lb培养基等常用培养基作上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(microbiologyculturemediamanual)的记载制备得到。例如，培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有1-5g/l的牛肉膏、5-20g/l的蛋白胨和3-8g/l的氯化钠。

其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。

其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括：将保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌接种于培养基中进行培养。优选情况下，通过培养使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌的活菌数可以为10⁷-10¹¹cfu，更优选为10⁹-10¹⁰cfu。在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如血球板计数法或od值观察法得到活菌的浓度。

培养后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，优选情况下，菌液通过包括无菌过滤、冷冻干燥等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。其中，菌种的培养条件没有特别的限制，可以为水凤仙花产碱杆菌培养过程中常用条件，例如采用摇床震荡培养，培养温度可以为28-37℃，培养时间可以为1-3天。

本发明第三方面提供本发明第一方面的水凤仙花产碱杆菌和本发明第二方面的微生物菌剂在畜禽养殖废弃物资源化中的应用。

根据本发明，水凤仙花产碱杆菌和微生物菌剂在禽畜养殖废弃物资源化过程中的应用方法没有特别的要求，可以包括将禽畜养殖废弃物进行堆肥发酵，具体地例如，可以为将畜禽养殖废弃物与本公开的水凤仙花产碱杆菌和/或微生物菌剂按比例混合均匀，调整水分后将搅拌均匀的垫料堆积发酵。

其中，畜禽养殖废弃物与水凤仙花产碱杆菌的用量可以为10⁶-10¹¹cfu，优选为10⁸-10⁹cfu，微生物菌剂的重量比可以在很大范围内变化，优选情况下，微生物菌剂与畜禽养殖废弃物的重量可以比为1：(1000-1500)，更优选为1:(1200-1400)。

使用时，可以将畜禽养殖废弃物按比例堆积好，再将菌剂均匀地撒在垫料上，充分混合直至完全混匀。

根据本发明，畜禽养殖废弃物可包括常规的禽畜粪便，例如为猪粪便、牛粪便、鸡粪和羊粪便中的一种或几种。用于发酵的畜禽养殖废弃物的c/n比可以为25～40，优选为28～35。进一步地，为了保证用于发酵的禽畜养殖废弃物的c/n比在适宜范围内，可以将秸秆、锯末、稻壳和麸皮中的至少一种与禽畜养殖废弃物混合堆肥发酵。

以下结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围并不限制于以下实施例中。

实施例1

本实施例用于说明本发明的水凤仙花产碱杆菌的培养及微生物菌剂的制备。

将保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌(alcaligenesaquatilis)接种到lb培养基(含10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物和10g/l的nacl)中，在30℃和200转/分振荡下培养。所得的菌液即为本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为10¹⁰cfu。

实施例2

本实施例用于说明本发明的水凤仙花产碱杆菌的培养及微生物菌剂的制备。

将保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌(alcaligenesaquatilis)接种到牛肉膏蛋白胨培养基(含20g/l的蛋白胨、5g/l的牛肉膏和5g/l的nacl)中，在37℃和180转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为10¹⁰cfu。

实施例3

本实施例用于说明本发明的水凤仙花产碱杆菌的培养及微生物菌剂的制备。

将保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌(alcaligenesaquatilis)接种到营养肉汤培养基(含10g/l的蛋白胨、3g/l的牛肉膏粉和5g/l的nacl)中，在35℃和160转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为10¹⁰cfu。

对比例1

将购自atcc的商品号为8750^tm的粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)接种到lb培养基(含10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物和10g/l的nacl)中，在35℃和120转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为5×10⁹cfu。

对比例2

本对比例用于说明与本发明不同的微生物菌剂及其制备方法。(1)在100重量份的营养肉汁培养基(蛋白胨的含量为0.8重量％、nacl的含量为0.4重量％、牛肉膏的含量为0.45重量％、余量为无菌水，ph为7.0)中接种4重量份的枯草芽孢杆菌的菌株(accc19743，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为0.8×10¹⁰个/克；(2)在100重量份的营养肉汁培养基中接种2重量份的假单胞杆菌的菌株(accc10163，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至假单胞杆菌的活菌数为0.8×10¹⁰个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为1重量％、nacl的含量为0.25重量％、牛肉膏的含量为0.45重量％、余量为无菌水，ph为7.0。

对比例3～10

将与本申请的保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌(alcaligenesaquatilis)一起分离的8株水凤仙花产碱杆菌接种到lb培养基(含10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物和10g/l的nacl)中，在30℃和200转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌液分别经无菌过滤，冷冻干燥后记为对比例3～10的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为10¹⁰cfu。

测试实施例1

本测试实施例测定实施例1-3和对比例1-10的微生物菌剂降解抗生素的能力。

分别配制无菌牛肉膏蛋白胨培养基，250ml的锥形瓶中装入100ml培养基，分别加入实施例1-3和对比例1-10的微生物菌剂0.05g，置于37℃培养24h。

配制分别含20mg/l四环素、土霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、环丙沙星、红霉素的溶液，每瓶100ml，接入1ml上述各菌液。培养7天后，检测培养基中各种抗生素的浓度，结果列于表1。抗生素的测定方法为高效液相色谱/质谱联用的方法。

表1

根据表1的数据可见，相对于购自atcc的商品号为8750^tm的粪产碱杆菌(对比例1)及购自accc的商品号为accc19743的枯草芽孢杆菌和商品号为accc10163的假单胞杆菌(对比例2)，本发明的保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌(alcaligenesaquatilis)及其菌剂具有突出的降解抗生素的能力。并且，相对于与该菌一起分离的8株水凤仙花产碱杆菌的菌剂(对比例3-10)，保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌的降解抗生素的能力也更强。

测试实施例2

本测试实施例测定实施例1-3和对比例1-10的微生物菌剂对堆肥过程中抗生素的降解能力和对耐药菌的抑制能力。

分别配制无菌牛肉膏蛋白胨培养基，250ml的锥形瓶中装入100ml培养基，分别加入实施例1-3和对比例1-10的微生物菌剂0.05g，置于37℃培养24h。以猪粪、秸秆等为原料的堆体中(c/n比为30:1，猪粪用量约为10kg)，分别加入抗生素溶液(四环素、土霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、环丙沙星、红霉素)至其在堆体中的终浓度为5mg/kg，之后加入实施例1-3和对比例1-2的对应菌剂。测试堆肥过程中的堆体温度，结果列于表2中；测试堆肥第21天堆体中抗生素浓度及降解率，结果列于表3中；测试堆肥第21天堆体中耐药细菌数量及削减率，结果列于表4中。温度的测定方法为在料堆距离地面1米高处，从斜坡表面向料堆中心垂直插入温度计，在深度为30cm、60cm和90cm处用长柄金属温度计测定温度，取平均值；耐药细菌数量的测定方法为稀释涂布平板法。

表2

根据表2的数据可以看出，本发明的含有保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌的菌剂添加到发堆料中后，发酵升温速度快，发酵第三天即可进入高温期，这说明该菌剂有助于加快废弃物资源化堆肥的发酵进程，能够提高发酵效率。

表3

根据表3的数据可以看出，本发明的含有保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌的菌剂添加到堆肥料体中，对四环素、土霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、环丙沙星和红霉素等抗生素的去除效果均较好，有利于实现养殖废弃物的安全、高效的资源化利用。

表4

根据表4的数据可见，与对比例1-10相比，使用本公开的实施例1-3所的微生物菌剂进行禽畜废弃物发酵的堆体中耐四环素、土霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、环丙沙星和红霉素的细菌的数量均较少，表明本发明的含有保藏编号为cgmccno.14474的水凤仙花产碱杆菌的菌剂对于抗生素和抗性基因对应的耐药菌均有明显的抑制效果，有利于实现养殖废弃物的安全、高效的资源化利用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。