一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒。

背景技术：

B淋巴细胞亦可简称B细胞。来源于骨髓的多能干细胞。禽类是在法氏囊内发育生成，故又称囊依赖淋巴细胞/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。B细胞淋巴瘤是一种最常见的淋巴细胞白血病，有关这种疾病的研究不断涌现。在哺乳类是在类囊结构的骨髓等组织中发育的。又称骨髓依赖淋巴细胞。从骨髓来的干细胞或前B细胞，在迁入法氏囊或类囊器官后，逐步分化为有免疫潜能的B细胞。成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。目前使用的大多数疫苗就是通过刺激这类B淋巴细胞产生抗体的。B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多，在血液和淋巴结中的数量比T细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。B细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。B1细胞为T细胞非依赖性细胞。B2为T细胞依赖性细胞。B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存在，目前对B细胞白血病残留进行检测时通常是使用试剂盒进行检测，但是，现有的试剂盒结构简单，功能单一，仅具有承载功能，不能对试剂进行冷藏处理，更不具有自动开启的功能，很不方便使用，为此，我们提出了一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒来解决上述问题。

技术实现要素：

本实用新型的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒。

为了实现上述目的，本实用新型采用了如下技术方案：

一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒，包括盒体，所述盒体上铰接有盒盖，所述盒体内设有放置腔，所述放置腔内设有冷藏盒，所述放置腔内相对的侧壁上均设有固定板，所述固定板上设有第一连接件，所述第一连接件上铰接有气缸，所述盒盖的一侧设有两个相互平行的第二连接件，所述气缸的活塞杆末端铰接在第二连接件上，所述冷藏盒内设有移动块，所述移动块内设有空腔，所述空腔中设有驱动装置，所述驱动装置的输出轴上设有第一齿轮，所述移动块上贯穿设有转动杆，位于移动块外侧的转动杆的两端均设有滚轮，位于空腔内的转动杆上设有第二齿轮，所述第一齿轮和第二齿轮相互啮合，所述冷藏盒内相对的侧壁上均设有和滚轮相对应的滑槽，且滚轮位于滑槽内，所述移动块的一侧连接有折叠板，所述折叠板远离移动块的一端固定在冷藏盒内的一端侧壁上，所述冷藏盒内设有制冷装置。

优选地，所述盒体的一侧铰接有承载板，所述盒体的侧壁上设有两个相互平行的绕线器，所述绕线器上设有拉绳，所述拉绳远离绕线器的一端固定在承载板上，所述承载板上等间距设有多个第一放置槽，所述第一放置槽的一侧设有两个第二放置槽，所述第二放置槽大于第一放置槽。

优选地，所述放置腔内相对的侧壁上等间距设有多个上垫块，所述上垫块的一侧固定有减震弹簧，所述减震弹簧远离上垫块的一端固定有下垫块，所述下垫块的一端固定在冷藏盒的侧壁上。

优选地，所述盒盖上设有限位槽，所述限位槽内铰接有提手，所述提手上设有防滑纹。

优选地，所述冷藏盒内的侧壁上均设有保温层。

本实用新型中，进行操作时，气缸可通过活塞杆的伸缩将盒盖打开，同时绕线器通过拉绳将承载板放下，驱动装置通过输出轴的转动带动第一齿轮转动，第一齿轮的转动带动第二齿轮转动，从而带动滚轮在滑槽内滑动，进而将折叠板折叠，操作人员从冷藏盒内取出试剂瓶，根据大小放置于对应的放置槽内进行检测，本实用新型通过气缸、驱动装置以及折叠板的结合实现了对试剂盒自动打开的功能，同时放置板以及减震弹簧等的设置不仅方便了操作，还起到减震的作用，保护了里边的试剂瓶，适宜推广。

附图说明

图1为本实用新型提出的一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒的结构示意图；

图2为本实用新型提出的一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒的内部结构示意图；

图3为本实用新型提出的一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒的减震装置结构示意图。

图中：1盒盖、2承载板、3提手、4限位槽、5盒体、6气缸、7 固定板、8绕线器、9拉绳、10冷藏盒、11减震弹簧、12移动块、 13折叠板。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1-3，一种用于B细胞白血病微小残留病检测的试剂盒，以下为本实用新型试剂盒具体使用步骤:

1、一步法RT-PCR步骤；

2、磁珠纯化步骤

1)取出磁珠振荡混匀5min取出45μl/个样本的量放于室温 10min；

2)RT-PCR的产物各取出20μl，剩余5μl justincase，再每个样本加入30μlH₂O，最后按照45μl/个加入磁珠，用枪吸吹约10次混匀，放于室温2min；

3)开盖放于磁力架上1min左右，液体变得澄清即可洗出液体，加入125μl85％的乙醇，1min后洗出弃掉，磁珠放于室温8min(5-10min)晾干。

3、用Nanodrop测定DNA的浓度。如果浓度是20ng/μl，稀释5 倍；如果接近40ng/μl，稀释10倍。

4、末端修复：在1.5ml离心管中混合以下成分(50μl)

1)34μl纯化的病人样本基因组DNA(或补水至34μl)

2)5μl10×末端修复缓冲液

3)5μl2.5mMdNTP混合物

4)5μl10mMATP

5)1μl末端修复酶

室温放置45分钟。用QIAquickPCR纯化柱纯化，用34μl缓冲液洗脱。

5、3’末端加A：在1.5ml离心管中混合以下成分(50μl)：

1)34μl步骤4的末端修复后的DNA

2)5μlKlenow缓冲液＝NEBbuffer2

3)10μl1mMdATP

4)1μlKlenow片段(3’à5’外切酶活性)

(1mMdATP用100mMdATP母液稀释，每管25μl分装，只能冻融一次)

用MinElutePCR纯化柱纯化，12μl缓冲液洗脱。

6、接头连接：在1.5ml离心管中混合以下成分(30ul)

1)11μl步骤5的DNA

2)15μlDNA连接缓冲液

3)1μl1:20稀释的接头寡核苷酸

4)3μlDNA连接酶

如果同时做多个重复，确保每个平行反应加入不同的接头，标记清楚。

7、凝胶筛选除去多余的接头：

将6μl稀释10倍的上样缓冲液加入到30μl第6步的反应液中，上样至两个E-gel胶孔中。另外取20μl稀释10倍的50bpDNAladder 上样。电泳20分钟。

切取大小在150bp到450bp之间的DNA，用QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化，

30μl洗脱缓冲液洗脱。

8、用Illumina引物PCR：

用Gibco水将IlluminaPCR引物1.1和2.1进行1：1稀释在PCR管中混合以下成分(60ul)：

1)30μl步骤4的DNA

2)28μlPhusionPCR预混液

3)1μl稀释的引物1.1

4)1μl稀释的引物2.1

PCR循环:

9、2％琼脂糖凝胶上进行分子量筛选：

将1μl稀释的上样缓冲液加入到上一步的PCR反应液中，上样至三个E-gel胶孔中。另外分别取20μl稀释10倍的50bp和 100bpDNAladder上样。电泳30分钟。切取大小在400bp左右的DNA。用QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化DNA，用30μl洗脱缓冲液洗脱。

10、测定DNA浓度。用NanoDrop测定所得DNA的浓度。

本实用新型中，进行操作时，气缸6可通过活塞杆的伸缩将盒盖 1打开，同时绕线器8通过拉绳9将承载板2放下，驱动装置通过输出轴的转动带动第一齿轮转动，第一齿轮的转动带动第二齿轮转动，从而带动滚轮在滑槽内滑动，进而将折叠板13折叠，操作人员从冷藏盒10内取出试剂瓶，根据大小放置于对应的放置槽内进行检测。

以上所述，仅为本实用新型较佳的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，根据本实用新型的技术方案及其实用新型构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。