利用分子梳理监测经修饰的核酸酶诱导的基因编辑事件的方法与流程

发明领域本发明涉及使用分子梳理(molecularcombing)以高分辨率检测和表征由经修饰的核酸酶诱导的大基因组重排的方法。本发明还涉及使用分子梳理定量由经修饰的核酸酶诱导的大基因组重排的频率的方法。包含适用于本发明的装置的相关技术的描述分子梳理分子梳理技术已公开于各种专利和科学出版物中，例如u.s.6,303,296,wo9818959,wo0073503,u.s.2006/257910,u.s.2004/033510,u.s.6,130,044,u.s.6,225,055,u.s.6,054,327,wo2008/028931,wo2010/035140以及(michalet,ekong等1997；herrick,michalet等2000；herrick,stanislawski等2000；gad,aurias等2001；gad,caux-moncoutier等2002；gad,klinger等2002；herrick,jun等2002；pasero,bensimon等2002；lebofskyandbensimon2003；jun,herrick等2004；caburet,conti等2005；herrick,conti等2005；lebofskyandbensimon2005；lebofsky,heilig等2006；patel,arcangioli等2006；rao,conti等2007；schurraandbensimon2009；nguyen,walrafen等2011；cheeseman,rouleau等2012；mahiet,ergani等2012；tessereau,buisson等2013；cheeseman,ropars等2014；tessereau,lesecque等2014；vasale,boyar等2015)中。这些参考文献的技术，特别是那些属于或涉及分子梳理的技术，在此通过引用并入上述出版物。bensimon等的美国专利第6,303,296号公开了dna拉伸方法(dnastretchingprocedure)，lebofsky等的wo2008/028931也公开了分子梳理方法。拉伸从任何来源(从病毒、细菌到人至植物......)提取的核酸，以线性和平行链形式提供固定的核酸，并且优选在适当的表面(例如，经表面处理的载玻片)上用受控的拉伸因子进行。拉伸后，有可能与例如可通过荧光显微镜检查(lebofsky,heilig等，2006)检测的序列特异性探针杂交。因此，可以在单个分子水平上直接显现特定序列。荧光信号的长度和/或其数量以及其在载玻片上的间距提供了探针尺寸和相对间距的直接读取。分子梳理是直接显现单个核酸分子的技术，并且具有许多dna结构的应用，诸如物理作图(michalet,ekong等1997；tessereau,buisson等2013；cheeseman,ropars等2014)和检测重排，包括如参与结节性硬化症的ca2+激活的中性蛋白酶3基因(michalet,ekong等1997)和赋予对遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征的易感性的brca1和brca2基因(gad,aurias等2001；gad,caux-moncoutier等2002；gad,klinger等2002；gad,bieche等2003；cheeseman,rouleau等2012)中的缺失和扩增。wo2014140788a1和wo2014140789a1公开了分别用于检测brca1基因座中序列的扩增和检测重排基因组序列中的断裂点的方法。wo2013064895a1公开了使用分子梳理以高分辨率检测brca1和brca2基因中的基因组重排，以及确定对与这些重排相关的疾病或病症的易感性(包括对卵巢癌或乳腺癌的易感性)。分子梳理还已成功地确定了例如21三体中的基因拷贝数(herrick,michalet等，2000)，阐明了重复区域诸如人核糖体dna(caburet,conti等2005)、d4z4(nguyen,walrafen等人2011)和rnu2阵列(tessereau,buisson等2013；tessereau,lesecque等2014；tessereau,leone等2015)的组织，以及检测外源dna的整合诸如病毒的整合(herrick,conti等2005；conti,herrick等2007)。wo2010/035140a1公开了基于核酸的拉伸和分子梳理分析第4号和第10号人染色体上的d4z4串联重复阵列的方法。分子梳理也用于表征dna复制(herrick,stanislawski等2000；herrick,jun等2002；lebofsky和bensimon2003；lebofsky和bensimon2005；lebofsky,heilig等2006；bailis,luche等2008；daboussi,courbet等2008；dorn,chastain等2009；schurra和bensimon2009)、dna/蛋白质相互作用(herrick和bensimon1999)和转录(gueroui，place等人2002)的功能研究。下面引用的专利描述了各种分子梳理方法和用于配置针对特定目的定制的分子梳理方法的各个步骤。基于本公开，本领域技术人员可以调整这些方法或其各个步骤以检测、定量或以其他方式表征通过crispr-cas9、其他基于crispr的方法或其他基因组或基因编辑方法进行的基因组或基因编辑事件。来自美国专利第6,303,296号的分子梳理的一个实例包括将核酸在支持物的表面s上对齐，其中该方法包括：(a)提供具有表面s的支持物；(b)使表面s与核酸接触；(c)将核酸锚定至表面s；(d)使表面s与第一溶剂a接触；(e)使第一溶剂a与介质b接触以形成a/b界面，其中所述介质b是气体或第二溶剂；(f)形成由第一溶剂a、表面s和介质b之间的接触产生的三线s/a/b(弯液面(meniscus))；(g)移动弯液面以使核酸在表面上对齐。基于美国专利第7,985,542号的公开内容的另一个实例包括检测待测大分子上存在至少一个目标结构域的方法，其包括：a)确定目标结构域上的至少三个靶区域，b)获得至少三个探针的相应标记组，每个探针靶向所述靶区域之一，选择与另外的探针相比的一个探针的位置，所述位置形成至少一组至少两个不同代码之间选择的至少两个代码的序列，所述代码序列特异于所述结构域并且是待测大分子上的所述目标结构域的特定标签特征(specificsignature)；c)铺展大分子并将探针结合至大分子上，其中铺展步骤发生在结合步骤之前或之后，d)读取每个标记探针给出的信号，每个信号与所述一个探针的标记相关联，e)将所述信号转换成从连续探针之间的间隙大小建立的代码序列，f)在所述序列中检测到目标结构域的代码序列表示在待测大分子上存在所述目标结构域，相反地，未检测到目标结构域的代码序列或代码序列的一部分表示在待测大分子上不存在所述结构域或所述目标结构域的一部分。基于美国专利第7,732,143号的公开内容的分子梳理的第三个实例包括鉴定包含基因组的断裂的遗传异常的方法，其中该方法包括：(a)提供已使用分子梳理技术在其上对齐包含多个克隆的基因组dna的表面；(b)使基因组dna与至少一种探针接触，所述探针特异于寻找其遗传异常性的基因组序列；(c)检测至少一种探针与基因组dna之间的杂交信号；(d)直接鉴定基因组中断裂的存在，或通过将通过杂交信号检测的序列长度与通过使用不含断裂的对照基因组和部分(b)的至少一种探针获得的杂交信号检测的序列长度相比较来鉴定基因组中断裂的存在，和(e)测定具有确定的探针长度的克隆的数目，其中将测定的克隆数目和由杂交信号检测的序列长度转换成图表。以上引用的这些专利均未考虑将分子梳理与crispr-cas9(如基因组或基因编辑)组合，或通过该组合获得的有利方面(包括避免偏倚性和由本文公开的单一测定提供的改善的效率)。dna双链断裂的修复dna中的双链断裂(dsb)是真核细胞中的常见事件，其可诱导有害损伤并随后导致基因组不稳定性和/或细胞死亡。这些事件通常通过非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)途径修复(takata,sasaki等1998)。通过nhej的基因组编辑通常导致断裂位点的小缺失和/或插入(插入缺失)。nhej是一种容易出错的机制，其功能是通过直接降解切割端来修复dsb而无需模板。这可产生移码突变，其可通过以下两种机制的组合敲除基因功能：编码蛋白的过早截短和mrna转录物的无义介导的衰变。nhej可在细胞周期的任何阶段发生。在高等真核生物中，nhej而非hr是主要的dsb修复系统(bibikova,golic等2002；puchta2005；lieber2010；lieber和wilson2010)。hr依赖于断裂末端至同源序列中的链入侵和随后以模板依赖性方式进行的断裂修复(szostak,orr-weaver等，1983)。hr可通过四种不同的保守和非保守机制介导：基因转换(gc)。gc基本上由重组-受体位点(recombination-recipientsites)处的dsb形成引发。dsb末端被加工成具有单链dna尾部，其中一个最终侵入未断裂dna的双链体。然后，侵入的单链dna尾部与未断裂的模板链中的同源dna区段形成异源双链体。该异源双链体的游离dna末端引发修复dna合成。在链延伸后，新合成的链解离形成未断裂的模板dna并与原始的断裂dna退火。最后，填充单链dna间隙，然后连接dna切口。在该过程中，未断裂的dna链上的dna序列被转换为断裂的链，从而伴随遗传信息的单向转移(paques和haber1999；allers和lichten2001；allers和lichten2001)。非等位基因同源重组(nahr)。实际上，hr还可以通过nahr机制在高度相似的重复序列或旁系同源基因组区段(区段性重复(segmentalduplication))之间异位发生。nahr可在同一染色体上的正向定向重复序列之间发生，引起染色体缺失，并且如果其以分子间方式发生，其可在另一条染色体上产生互易性重复(reciprocalduplication)。当nahr在以反向定方的重复序列之间发生时，其导致倒位。nahr是一种导致基因组变异和基因组病症的机制。断裂诱导的复制(bir)。当同源性限于一端时，bir途径用于修复dsb。在这种情况下，重组用于建立单向复制叉，其可将供体模板复制到染色体的末端(mceachern和haber2006；llorente,smith等，2008)。bir机制负责在许多人疾病和癌症中看到的一些区段性重复(payen,koszul等，2008)、缺失、非交互性易位和复杂重排(hastings,lupski等，2009)。单链退火(ssa)。ssa限于修复侧翼有可以短至30个核苷酸的正向重复序列的dna断裂(sugawara,ira等2000；villarreal,lee等2012)。切除暴露同源序列的互补链，其发生重组，通过rad1-rad10内切核酸酶复合物(哺乳动物中为xpf-ercc1)去除非同源单链尾部而导致包含单拷贝的重复序列的缺失。因此认为ssa具有高度诱变性。当在dsb两侧具有同源序列的外源dna供体与经修饰的核酸酶一起被引入时，细胞的机制将使用所提供的供体序列作为模板进行修复，从而在dsb位点处或其附近产生精确的核苷酸变化(rouet,smih等1994)。根据供体dna(单链寡核苷酸或质粒)的性质，同源区的长度可在70至数百个碱基对之间变化(yang,guell等2013；hendel,kildebeck等2014)。供体dna可用于引入精确的核苷酸取代或缺失、内源基因标记和靶向的基因添加(mcmahon,rahdar等，2012)。已显示，在靶位点引入dsb可刺激哺乳动物细胞中通过hr进行的基因靶向的效率达数个数量级(rouet,smih等1994；choulika,perrin等1995；smih,rouet等1995)。基因组编辑使用工程化核酸酶进行基因组编辑是允许对任何基因组dna序列进行靶向修饰的技术(baker2012)。该技术依赖于通过如上所述的hr或nhej机制由dnadsb激活内源性细胞修复机器。存在四种主要类型的核酸酶可以在特定位点产生靶向dnadsb：锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、大范围核酸酶和crispr/cas9系统(关于综述，(maeder和gersbach2016；merkert和martin2016)。锌指核酸酶基于锌指核酸酶(zfn)的技术基于以下事实：foki限制性内切核酸酶的dna结合结构域和切割结构域彼此独立地起作用(li,wu等，1992)。因此，通过用锌指结构域替代fokidna结合结构域可产生具有新型结合特异性的嵌合核酸酶(kim和chandrasegaran1994；kim,cha等，1996)。由于zfn诱导的dsb可用于通过nhej或hr修饰基因组(bibikova,carroll等2001；porteus和baltimore2003)，该技术可用于修饰人体细胞和多能干细胞中的基因(关于综述：(jo,kim等2015；vasileva,shuvalov等2015)。talen决定来自植物病原体黄单胞菌属(xanthomonas)的tale蛋白的dna结合特异性的简单的一对一代码的发现再次提出了模块设计新型dna结合蛋白的令人兴奋的可能性(boch,scholze等2009；moscou和bogdanove2009)。dna结合结构域含有重复的高度保守的33-34个氨基酸的序列，其中具有趋异的第12位和第13位氨基酸。这两个位置，称为重复可变双残基(rvd)，是高度可变的，并显示出与特定核苷酸识别的强相关性。氨基酸序列与dna识别之间的这种关系允许选择含有适当rvd的重复区段的组合以靶向特定区域。tale作为可编程dna结合结构域的这一发现很快带来了talen的工程化。与zfn一样，tale与foki内切核酸酶的催化结构域融合，并且经显示其作为二聚体用于切割其预定的dna靶位点(christian,cermak等2010；miller,tan等2011)。同样地与zfn类似，已显示talen在人体细胞和多能干细胞中高效地诱导nhej和hr(关于综述，可参见vasileva,shuvalov等2015；merkert和martin2016)。大范围核酸酶大范围核酸酶技术涉及重新工程化天然存在的归巢内切核酸酶的dna结合特异性，所述归巢内切核酸酶的特征在于大的识别位点(12至40个碱基对的双链dna序列)。目前有六种已知的具有保守结构基序的大范围核酸酶家族：laglidadg(seq.idno:1)、hnh、his-cys盒、gyi-yig、pd-(d/e)xk和vsr样家族(belfort和roberts1997，通过引用并入)。最大类的归巢内切核酸酶是laglidadg(seq.idno:1)家族，其包括充分表征和常用的i-crei和i-scei酶(cohen-tannoudji,robine等1998；chevalier和stoddard2001)。通过合理设计和选择的组合，这些归巢内切核酸酶可被重新工程化以靶向新型序列(arnould,perez等2007；grizot,smith等2009)并且显示出在基因组编辑中使用大范围核酸酶的希望(redondo,prieto等2008；dupuy,valton等2013)。crispr/cas9系统crispr-casrna引导的核酸酶源自适应性免疫系统，其在细菌中进化以抵御入侵的质粒和病毒(barrangou,fremaux等2007)。已经从不同生物体(i-vi型)鉴定了六种主要类型的crispr系统，每种主要类型具有不同的亚型(chylinski,makarova等2014；makarova,wolf等2015)。在ii型crispr系统中，迄今为止已从链球菌属化脓性链球菌(s.pyogenes)、嗜热链球菌(s.thermophilus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)和新型弗朗西斯菌(francisellanovicida)中表征了几种cas9(gasiunas,barrangou等2012；jinek,chylinski等2012；mali,aach等2013；sampson,saroj等2013；zhang,heidrich等2013；ran,cong等2015；hirano,gootenberg等2016)。crispr核酸酶系统需要三种组分来通过核酸之间的watson-crick碱基配对决定dna切割的特异性：crispr相关(cas)9蛋白、成熟crisprrna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)(deltcheva,chylinski等2011)。已显示，通过将crrna和tracrrna融合成单一引导rna(grna)，该系统可以减少为两个组分(jinek,chylinski等2012)。为了搜索dna靶标，cas9核酸酶仅需要与靶dna碱基配对的grna上的20个核苷酸的序列和与互补序列相邻的dna原间隔序列相邻基序(pam)(marraffini和sontheimer2010；jinek,chylinski等2012)。此外，可通过改变grna的短部分的序列来实现cas9/grna复合物重新靶向新位点。虽然大多数cas9具有类似的rna引导的dna结合dna机制，但它们通常具有不同的pam识别基序，扩展了用于基因编辑或基因组操作的可靶向的基因组序列。此外，某些类型的crispr系统可表现出不同的机制。例如，来自激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)的iii-bcrispr系统使用cas复合物进行rna指导的rna切割，其允许靶向和调节细胞中的rna(hale,zhao等2009；hale,majumdar等2012)。最近，已经显示从普氏菌属(prevotella)和弗朗西丝菌属(francisella)分离的蛋白质cpf1(v型)使用短的crrna而没有tracrrna用于rna引导的dna切割，并且cpf1介导的基因组靶向是有效且特异的，与化脓性链球菌cas9相当(zetsche,gootenberg等2015；dong,ren等2016；fonfara,richter等2016；yamano,nishimasu等2016)。最后，来自莎氏纤毛菌(leptotrichiashahii)的vi-a型crispr效应物c2c2是rna指导的rnase，其可被编程以敲低细菌中的特定mrna(abudayyeh,gootenberg等2016)。天然crispr/cas系统的这种多样性可以提供功能多样的编辑工具集。还开发了cas9系统的变体。例如，仅具有切口酶活性的称为cas9d10a的突变体形式，可以仅切割一条链，并且当提供同源的修复模板时随后仅激活hr途径(cong,ran等2013)。cas9d10a甚至可通过使用靶向相邻位点的每条dna链的一对cas9d10a来增强基因编辑的特异性(ran,hsu等2013)。仍然具有结合dna能力的核酸酶缺陷型cas9(dcas9)用于序列特异性地靶向基因组的任何区域而不进行切割。相反，通过与各种效应结构域融合，dcas9可用作基因沉默或激活工具(maeder,linder等2013)或者当与荧光蛋白融合时作为显现工具(chen和huang2014)。与上述znf、talen和大范围核酸酶相反，crispr/cas系统不需要为每个dna靶位点工程化新型蛋白质。只需通过改变决定特异性的grna的短区域，就可以靶向新位点。另外，因为cas9蛋白不与grna直接偶联，所以该系统非常适合通过同时使用多种grna在多个基因座诱导dsb来进行多重化。此后，许多工作表明，主要源自从化脓性链球菌分离的ii型crispr系统的crispr/cas9系统可被工程化以用于哺乳动物细胞中的高效遗传修饰(cho,kim等2013；cong,ran等2013；mali,yang等2013)并且产生从蠕虫到猴子的转基因或敲除动物模型。下面提及的两个专利描述了crispr-cas9或类似的基因组或基因编辑方法以及在这些程序中有用的各个步骤。基于本公开，本领域技术人员可以调整这些基因组或基因编辑方法或其各个步骤以修饰或编辑靶多核苷酸。代表性但非限制性的crispr系统包括zhang，美国专利第8,795,965号所公开的系统，其包括改变至少一种基因产物的表达的方法，所述方法包括将工程化的非天然存在的规律成簇间隔短回文重复序列(crispr)--crisp相关(cas)系统引入含有并表达具有靶序列并且编码基因产物的dna分子的真核细胞，所述crispr相关(cas)系统包含一种或多种载体，所述载体包含：a)可在真核细胞中操作的第一调控元件，其与至少一种编码与靶序列杂交的crispr-cas系统引导rna的核苷酸序列可操作地连接，和b)可在真核细胞中操作的第二调控元件，其与编码ii型cas9蛋白的核苷酸序列可操作地连接，其中组分(a)和(b)位于系统的同一或不同载体上，其中引导rna由嵌合rna组成并包括引导序列以及反式激活cr(tracr)序列，其中引导rna靶向靶序列并且cas9蛋白切割dna分子，由此改变所述至少一种基因产物的表达；并且，其中cas9蛋白和引导rna不是天然地一起存在的。frendewey等的美国专利第9,288,208号描述了另一种代表性但非限制性的系统，其包括用于修饰小鼠es细胞中的目标基因组基因座的基因组的体外方法，其包括：使小鼠es细胞与cas9蛋白、与目标基因组基因座上的crispr靶序列杂交的crisprrna、tracrrna和大小为至少10kb并且包含插入核酸的大的靶向载体(ltvec)接触，所述插入核酸的两侧存在：(i)与目标基因组基因座处的5'靶序列同源的5'同源臂；和(ii)与目标基因组基因座处的3'靶序列同源的3'同源臂，其中在ltvec存在的情况下使小鼠es细胞与cas9蛋白、crisprrna和tracrrna接触后，小鼠es细胞的基因组被修饰以包含靶向的遗传修饰，其包含目标基因组基因座的区域的缺失(其中所述缺失至少为30kb)和/或插入核酸在目标基因组基因座处的插入(其中插入至少为30kb)。其他代表性但非限制性的系统由wo2014/089541描述，其通过引用并入并且包含用于治疗或修复与血友病a相关的基因的方法。本发明的方法(其鉴定或定量、校正或修复基因)，当与下文描述的基因组或基因编辑方法结合使用时是特别有用的，因为分子梳理容易检测由这些方法提供/产生的遗传校正和修复的基因。位于x染色体上的f8基因编码参与凝血级联的凝血因子(因子viii)，其导致凝血。因子viii主要由肝脏中的细胞产生，并以无活性形式在血流中循环，与vonwillebrand因子结合。受伤后，fviii被激活。活化的蛋白质(fviiia)与凝血因子ix相互作用，导致凝血。f8基因的突变导致血友病a(ha)。已经鉴定了该基因中的2,100多个突变，包括点突变、缺失和插入。最常见的突变之一包括内含子22的倒位，其导致严重类型的ha。f8中的突变可导致产生异常功能的fviii蛋白或循环fviii蛋白的量减少或不存在，导致响应于损伤的凝血能力降低或丧失。在一个方面，本发明涉及使用本文所述的方法在患有血友病a的受试者中靶向和修复f8基因突变。发现约98％的诊断为血友病a的患者在f8基因中具有突变(即，内含子1和22的倒位，点突变、插入和缺失)。这种方法可包括向受试者的细胞中引入一种或多种编码核酸酶的分离的核酸，所述核酸酶靶向含有导致血友病a的突变的f8基因的一部分，其中所述核酸酶在f8基因中产生双链断裂；和包含供体序列的分离的核酸，所述供体序列包含(i)编码截短的fviii多肽的核酸或(ii)与编码截短的fviii多肽的核酸可操作地连接的天然f83'剪接受体位点，其中包含(i)编码截短的fviii多肽的核酸或(ii)与编码截短的fviii多肽的核酸可操作地连接的天然f83'剪接受体位点的核酸侧翼连接有与dna中双链断裂的上游和下游的核酸序列同源的核酸序列，并且其中所得的修复基因在表达后赋予受试者的编码的fviii蛋白与未修复的f8基因相比改善的凝血功能。这种方法还可以包括在患有fviii缺乏并且将被施予、正在施予或已施予(r)fviii产品的受试者中诱导对fviii替代产品((r)fviii)的免疫耐受，包括向受试者的细胞中引入一种或多种编码核酸酶的核酸，所述核酸酶靶向f8基因中含有导致血友病a的突变的一部分，其中所述核酸酶在f8基因中产生双链断裂；和包含供体序列的分离的核酸，所述供体序列包含(i)编码截短的fviii多肽的核酸或(ii)与编码截短的fviii多肽的核酸可操作地连接的天然f83'剪接受体位点，其中包含(i)编码截短的fviii多肽的核酸或(ii)与编码截短的fviii多肽的核酸可操作地连接的天然f83'剪接受体位点的核酸侧翼连接有与dna中双链断裂的上游和下游的核酸序列同源的核酸序列，并且其中修复的基因在表达后诱导对施用的替代fviii蛋白产物的免疫耐受。这些方法中的任一种都可使用核酸酶，其为锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)或crispr(规律成簇间隔短回文重复序列)-相关(cas)核酸酶。这两种方法都可使用靶向f8基因的内含子22、靶向f8基因的内含子1、靶向外显子22/内含子22连接处或靶向外显子1/内含子1连接处的核酸酶。这些方法中的任一种都可以靶向包含为内含子22倒位的突变的f8突变。用本发明的分子梳理步骤有利地实施的另一种代表性方法是通过引用并入wo2015089465描述的方法，其涉及包含持久性病毒诸如乙型肝炎病毒的基因的多核苷酸的基因组编辑或基因编辑。此类病毒由于病毒整合到宿主基因组中和/或通过附加型的维持(例如乙型肝炎病毒hbv，其通过长寿的附加型双链dna形式(称为共价闭合环状dna，或cccdna)在人肝细胞核中维持格外的持久性)而持续存在。已经表明，可以直接切割病毒的该附加型形式(cccdna：hbv增殖期间在细胞核中产生的并可在受感染的受试者保持永久存在的dsdna结构)，从而降低其丰度。该方法涉及通过操纵目标基因组基因座中的靶乙型肝炎病毒(hbv)序列来修饰生物体或非人生物体，包括递送非天然存在或工程化的组合物，其包含：a)-i.crispr-cas系统rna多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列包含：(a)能够与真核细胞中的靶hbv序列杂交的引导序列，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，和ii.编码crispr酶的多核苷酸序列，其任选地包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5'至3'取向排列，其中当转录时，所述tracr配对序列与tracr序列杂交并且引导序列指导crispr复合物与靶hbv序列的序列特异性结合，并且其中crispr复合物包含与以下序列复合的crispr酶：(1)与靶hbv序列杂交或可与其杂交的引导序列，和(2)与tracr序列杂交或可与其杂交的tracr配对序列，并且编码crispr酶的多核苷酸序列是dna或rna，或(b)i.包含以下序列的多核苷酸：(a)能够与真核细胞中的靶hbv序列杂交的引导序列，和(b)至少一个或多个tracr配对序列，ii.编码crispr酶的多核苷酸序列，和iii.包含tracr序列的多核苷酸序列，其中当转录时，tracr配对序列与tracr序列杂交，并且引导序列指导crispr复合物与靶hbv序列的序列特异性结合，并且其中crispr复合物包含与以下序列复合的crispr酶：(1)与靶hbv序列杂交或可与其杂交的引导序列，和(2)与tracr序列杂交或可与其杂交的tracr配对序列，并且编码crispr酶的多核苷酸序列是dna或rna。本发明的分子梳理步骤可以与wo2014/165825(其通过引用并入)描述的治疗性基因组编辑或基因编辑技术结合使用。这些技术包括用于改变细胞中靶多核苷酸序列的方法，其包括使多核苷酸序列与规律成簇间隔短回文重复序列相关(cas)蛋白和一至两种核糖核酸接触，其中核糖核酸将cas蛋白导向靶多核苷酸序列的靶基序并且与其杂交，其中靶多核苷酸序列被切割，并且其中表达cas蛋白的细胞的改变效率为约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、79％、80％、90％至约100％。该方法可用于治疗或预防与受试者中一种或多种多核苷酸序列的表达相关的病症，并且可涉及(a)通过使多核苷酸序列与规律成簇间隔短回文重复序列相关(cas)蛋白和一至两种核糖核酸接触而在细胞中离体改变靶多核苷酸，其中所述核糖核酸将cas蛋白导向靶多核苷酸的靶基序并且与其杂交，其中靶多核苷酸序列被切割，并且其中表达cas蛋白的细胞的改变效率为约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、79％、80％、90％至约100％，以及(b)将细胞引入受试者，从而治疗或预防与所述多核苷酸序列的表达相关的病症。可使用人多能细胞、原代人细胞或未转化的人细胞来实施此类方法。还可将本发明与us20150056705a1描述的基因组编辑或基因编辑技术组合实施。这些可包括修饰细胞中内源基因表达的方法，该方法包括以下步骤：向细胞施用第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子包含识别内源基因中的靶位点的单一引导rna，所述第二核酸分子编码功能结构域，其中所述功能结构域与靶位点上的所述单一引导rna缔合，从而改变内源基因的表达；任选地，其中功能结构域选自转录激活结构域、转录抑制结构域和核酸酶结构域，或者其中功能结构域是typeiis限制酶核酸酶结构域或cas蛋白。这些专利或专利申请都没有考虑将crispr-cas9样、znf或talen介导的基因组编辑或基因编辑与分子梳理相结合，也没有认识到通过这种组合所获得的有利方面，诸如避免偏倚性和由本文公开的单一测定提供的提高的效率。核酸酶诱导的基因编辑事件基于经修饰的核酸酶产生位点特异性dsb的能力，可以利用细胞的内源机制，以位点特异性方式工程化多种基因组改变。这些基因组改变包括基因敲除/突变、基因校正、基因缺失和基因插入。将这些方法与分子梳理有效地结合使用。基因敲除/突变这种最简单的基因编辑形式利用nhej在靶位点的易错性质。该过程在细胞周期的所有阶段都是活跃的，并且以高频率的诱变修复dna，导致在断裂位点形成插入缺失(chapman,taylor等2012)。当核酸酶靶位点被置于基因的编码区中时，所得插入缺失通常会导致移码，并且在大多数情况下，导致随后的基因敲除。然而，在诸如duchenne肌营养不良症(dmd)的疾病(其中基因缺失导致移码并随后丧失蛋白质功能)中，靶向nhej诱导的插入缺失可用于恢复基因的正确阅读框架(ousterout,perez-pinera等2013)。此外，基因破坏可用于纠正显性功能获得性突变，从而用于治疗性治疗，正如其在亨廷顿氏病(aronin和difiglia2014)或显性营养不良型大疱性表皮松解症(shinkuma,guo等2016)所示的那样。相反，还可实现治疗效果以消除正常功能。该方法通常用于靶向宿主病毒受体以预防病毒感染，如同治疗hiv的情况一样，其中ccr5(主要hiv共受体)的敲除阻止病毒感染经修饰的t细胞(gu2015)。最后，不是直接靶向人基因组，而是在入侵细菌或基于dna的病毒中敲除关键基因可以作为有效的抗微生物处理(beisel,gomaa等2014；white,hu等2015)。基因校正由于靶向dsb可通过用外源提供的供体模板刺激hr来诱导精确的基因编辑，因此可以将供体模板中存在的任何序列差异整合到内源基因座中以纠正引起疾病的突变，如已在许多研究中，尤其是在原发性免疫缺陷病症的治疗中所显示的那样(cicalese和aiuti2015)。基因缺失通过同时引入两种靶向修饰的核酸酶，通过用两个dsb侧接靶序列，也可以删除大的dna区段。所得基因组缺失的大小可达到数兆碱基(sollu,pars等2010；canver,bauer等2014)。这种方法对于可能需要去除整个基因组元件(诸如在利伯先天性黑矇的情况下的cep290基因中的内含子序列，其含有产生破坏编码序列的异常剪接位点的频繁突变(maeder和gersbach2016))的治疗策略是有用的。基因插入dna供体模板(其中所需遗传插入物侧翼连接有与核酸酶切割位点相同的同源序列)的使用使得能够通过dsb诱导的hr插入位点特异性dna插入(moehle,rock等2007)。靶向转基因插入的一种替代种机制是使用核酸酶诱导的dsb以在供体dna和内源位点上产生相容的悬突，从而导致nhej介导的插入dna序列直接连接到靶基因座中(maresca,lin等2013)。在将基因的野生型拷贝插入内源突变基因座的情况下，主要有利方面是表达受天然调节元件控制，并且将降低与随机转基因插入相关的风险，因为在利用逆转录病毒载体的早期临床试验中观察到该现象(综述(baum,modlich等2011)。经修饰的核酸酶的功效(中靶(on-target))的评估为了在治疗后立即以及在随访时检测和定量由经修饰的核酸酶介导的基因编辑在体内对基因编辑的细胞(例如，使用来自临床研究中的患者的血液样品)的功效，已经开发了许多技术：表型选择、限制性位点选择、基于page的基因分型方法、基于酶促错配切割的分析、受影响的基因组基因座的亚克隆、高分辨率熔解曲线(hrm)分析、下一基因测序(ngs)和微滴数字pcr(ddpcr)，参见(shendure和ji2008)(hindson,chevillet等2013)，所述文献通过引用并入。表型选择表型选择基于以下事实：物质(分子、肽......)或处理(rnai、基因编辑......)以期望的方式改变细胞或生物体的表型。该方法已成功用于表征zfn对斑马鱼的作用(doyon,mccammon等2008)。表型选择的主要限制依赖于许多基因在处理后未表现出明显表型的事实。限制性位点选择限制性位点选择需要检测区域内的特定限制性位点。在核酸酶介导的修饰后，基因或其片段可能失去或获得限制酶的识别位点，导致限制模式发生变化，如其在talen靶向的斑马鱼中所显示的(huang,xiao等2011)。该方法的使用局限于可被位点限制性酶靶向的已知突变。基于page的基因分型方法在该方法中，跨越诱变位点的pcr扩增的基因组区域经历短暂的变性和退火循环。然后，来自经遗传修饰的个体的pcr片段(其含有插入缺失突变和野生型等位基因的混合物)将形成异源双链和同源双链dna。由于插入缺失突变引起的匹配与错配dna链之间存在开放角(openangle)，因此异源双链dna通常在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)中以比同源双链dna显著更慢的速率迁移，因此使其成为筛选携带突变的起始者的有用工具(zhu,xu等2014)。然而，这不是高通量方法，其耗时并且不能提供关于突变的任何确切信息，尽管其在可行性和成本方面是可承受的。基于酶促错配切割的测定为了鉴定未知突变，广泛使用在对突变型和野生型等位基因进行解链和杂交后形成的异源双链dna的鉴定。异源双链dna的鉴定可用化学物质(bhattacharyya和lilley1989)、酶(mashal,koontz等1995；taylor和deeble1999)或结合错配的蛋白质(wagner,debbie等1995)来进行。酶促错配切割(emc)方法利用能够在由单个或多个核苷酸形成的错配处切割异源双链dna的酶。用于emc的第一酶是噬菌体解离酶诸如t4e7和t7e1(mashal,koontz等1995)。然而，这种方法效果适中，因为与单碱基突变相比，缺失可被更高效地切割(mashal,koontz等1995)。s1核酸酶家族的第二代单链特异性内切核酸酶诸如cel(celii核酸酶以商品名商购获得)(qiu,shandilya等2004)和endo(triques,piednoir等2008)最近已被用于突变检测。基于surveyor的emc测定通常用于扫描由工程化核酸酶诱导的突变(qiu,shandilya等2004；guschin,waite等2010)。emc测定是经济有效的方法，可使用简单的实验室设置进行，但其灵敏度有限(>1％)，并且定量相对不精确(vouillot,thelie等2015)。靶向区域的亚克隆该策略由通过pcr亚克隆受影响的基因组基因座，然后进行sanger测序并随后计数经修饰的等位基因组成(perez,wang等2008)。该方法可在没有特殊设备的情况下进行，但是非常费力、耗时且昂贵。此外，灵敏度和准确度直接取决于测序的克隆数量(必须分析约300个克隆的测序以达到1％的灵敏度)并且可因扩增步骤的使用而产生偏差。高分辨率熔解曲线(hrm)分析高分辨率熔解分析(hrm)是一种pcr后方法。首先在饱和嵌入染料存在的情况下使用pcr扩增dna序列内的目标区域，所述嵌入染料仅在双链dna存在的情况下发荧光。随着pcr循环期间反应管中扩增子浓度的增加，双链扩增产物显示的荧光也增加。pcr后，将扩增子dna从约50℃逐渐加热至约95℃。当达到扩增子的熔解温度时，双链dna熔解分开并且荧光逐渐减弱。绘制显示荧光水平相对温度的该观察结果，产生熔解曲线。即使样品dna序列中的单碱基变化也会导致hrm曲线的差异。由于不同基因序列以略微不同的速率熔解，因此可使用这些曲线观察、比较和检测它们。该方法已用于评估基因编辑效率(thomas,percival等2014；d'agostino,locascio等2016)。然而，由于nhej修复机制可能导致各种插入缺失模式，因此将产生多种pcr产物，这排除了限定的第二熔解曲线的划分，从而阻止精确定量。下一代基因测序存在许多使用不同测序技术的不同ngs平台，所述ngs允许并行地对数百万个小dna片段进行大规模测序。该技术是评估基因编辑效率的最广泛使用的方法，例如bell,magor等2014；guell,yang等2014；hendel,kildebeck等2014；schmid-burgk,schmidt等。这种方法的主要优点是可以同时分析中靶和潜在的脱靶位点。然而，ngs灵敏度取决于四个变量(取决于测序技术)。首先，其取决于用于扩增靶基因座的基因组dna(gdna)的量(100nggdna将赋予0.02％的灵敏度)。其次，ngs灵敏度取决于文库大小和读数计数的数量(0.02％的灵敏度理论上需要15000个读数)。第三，其还取决于可干扰分析的ngs错误的固有率(intrinsicrate)。第四，某些平台的阅读长度限制不允许分析驱动更高效hr的同源长臂，特别是在基因插入的情况下。微滴数字pcr微滴数字pcr(ddpcr)是灵敏的方法，其能够准确定量靶核酸序列(vogelstein和kinzler1999；pinheiro,coleman等2012)。在该方法中，来自样品的各个dna分子被捕获在油包水微滴隔区中(pinheiro,coleman等2012)。使用两种彩色荧光taqman探针区分含有突变型或野生型等位基因的微滴，并在pcr的终点计数靶dna的拷贝数(vogelstein和kinzler1999)。已对ddpcr进行了一些特定的修饰以评估结合了高灵敏度(<0.2％)和优异的准确性的基因编辑频率(mock,hauber等2016)。ddpcr的局限性与经典pcr相同：取决于序列信息、有限的扩增大小、扩增期间的评定的误差、对抑制剂的敏感性、对指数扩增和假象的限制以及对污染的敏感性。脱靶事件的检测和定量基因编辑工具的一个潜在复杂因素是经修饰的核酸酶将产生其他不想要的基因组变化。经修饰的核酸酶的这种“脱靶”活性从根本上发生，因为它们能够与除指定的dna靶标外的序列结合。脱靶活动的最常见表现形式是因nhej而导致的小的插入缺失。然而，总体染色体重排是最令人关注的非活动效应(off-activityeffect)类型，因为它们与恶性转化最明显相关。文献中报道的基因组改变包括将外源提供的dna(诸如供体dna模板或质粒产生后剩余的污染性细菌dna)整合到基因组中(hendel,kildebeck等2014)、删除大区域的染色体序列(cradick,fine等2013；mussolino,alzubi等2014)、重复和倒位(lee,kweon等2012)、染色体易位(torres,martin等2014)以及来自基因组中的备选位置的序列插入(hendel,kildebeck等2014)。功能测定有几种测定可以测量经修饰的核酸酶表达的功能毒性，而不必预测潜在的脱靶位点。这些测定包括诱导细胞凋亡(mussolino,alzubi等2014)、与不表达经修饰的核酸酶的细胞相比修改复制参数(pruett-miller,connelly等2008；maeder,linder等2013)、软琼脂转化和克隆扩增测定(porter,baker等2014)。脱靶位点的检测存在几种检测最可能的脱靶位点的体外和细胞测定。例如，可使用经修饰的核酸酶与寡核苷酸的体外结合来鉴定待在体外切割的序列，然后可在基因组中搜索这些序列以与那些序列的精确匹配(pattanayak,ramirez等2011；pattanayak,lin等2013)。另一种方法由以下步骤组成：下拉经修饰的核酸酶活性的染色质免疫沉淀，然后对核酸酶所结合的dna片段进行测序，以及将这些片段定位到基因组中(kuscu,arslan等2014；wu,scott等2014)。。已开发出无偏倚性的测定。它们依赖于捕获整合缺陷型慢病毒或腺病毒(idlv捕获法)(gabriel,lombardo等2011；wang,wang等2015；osborn,webber等2016)或通过lam-pcr(idlv-捕获)或标签特异性扩增(guide-seq)和高通量测序鉴定dsb位点处的小修饰双链寡核苷酸(dsodn；guide-seq法)(tsai,zheng等2015)和基因组定位。然而，所有这些方法在技术上都具有挑战性。例如，guide-seq技术需要对靶细胞具有高水平的转染效率，这限制了该方法在一些细胞类型中的使用。此外，诸如免疫沉淀等一些技术可能导致非常高的假阳性检出率(kuscu,arslanetal.2014；wu,scottetal.2014)。这些方法检测低水平脱靶事件的灵敏度也可能较低(gabriel,lombardo等2011)。替代方法由在基因编辑之前和之后对全基因组进行测序组成。这样，与原始群体相比，可以通过对在预期基因座之外产生的新突变的简单分析来确定脱靶位点(smith,gore等2014；iyer,shen等2015)。然而，仅检测高频率脱靶位点的全基因组测序缺乏检测大量群体中脱靶位点所需的灵敏度(veres,gosis等2014)。脱靶位点位置的预测从理论上讲，整个基因组可被视为潜在的脱靶位点。然而，经修饰的核酸酶诱导的脱靶事件被认为是核酸酶与与预期的靶向位点具有一定水平的同源性的dna序列结合的直接结果。因此，经修饰的核酸酶倾向于在某些热点位置诱导脱靶事件，这些热点位置对于在给定细胞类型或同一物种的不同细胞类型中给定修饰在频率和位置上是一致的(fu,foden等2013)。已经使用由不同研究小组生成的关于crispr-cas9的脱靶切割的数据生成算法，以预测最可能的脱靶位点。这些算法包括cas-offinder(bae,park等2014)、casfinder(aach,mali等2014)、crispr设计工具(hsu,scott等2013)、e-crispr(heigwer,kerr等2014)和breaking-cas(oliveros,franch等2016)和许多其它方法。然而，不同的因素(grna、基因组或表观基因组背景中的错配的位置，......)可能影响切割频率，使得难以开发能够识别所有潜在的脱靶位点的算法。需要更高效和准确的方法来鉴定、筛选和选择含有基因组修饰或编辑的多核苷酸，并且还要选择诱导预期的基因组修饰或基因编辑事件的最合适的基因组编辑系统。上述方法各自具有一个或多个限制，诸如上面描述的那些限制。对现有方法的显著限制包括现有方法是间接的。它们确实需要预分析步骤，诸如基因扩增、文库制备和/或亚克隆。由于需要这些预分析步骤，现有方法经常遭受显著偏倚性，使得难以精确定量基因组修饰或基因编辑事件。大多数现有技术方法效率低下，并且不能在单次测定中检测中靶和脱靶方法。一些现有方法局限于多核苷酸中的已知突变或变异的检测，并且不能检测脱靶事件。许多现有方法具有有限的灵敏度，并且不检测或量化罕见的基因组修饰或基因编辑事件。本发明涉及靶向细胞基因组dna的遗传修饰。所述修饰包括部分或全部基因序列(包括但不限于编码区和调控元件序列等)的缺失、重复、扩增、易位、插入或倒位。标准参照核酸序列对应于野生型核酸序列或对应于选定的目标突变序列，诸如预定的核酸序列。发明简述鉴于上述现有方法的限制和缺点，本发明人努力寻求提高检测基因组修饰和基因编辑事件的效率和准确性的方法。本文公开的基于分子梳理(“mc”)的方法克服了用于精确检测基因组编辑事件的现有方法(诸如用crispr-cas9技术或用其他基因组编辑方法进行的那些方法)的限制。根据本发明的基于分子梳理的方法可以检测和定量在基因组或基因编辑方法期间发生的罕见事件。这些方法不需要预分析步骤，因此避免了可归因于这些预分析步骤的偏倚性的引入。通过计数大量个体基因组或基因编辑事件进行的本发明方法使得对此类事件(包括使用当前方法无法检测的罕见事件)进行非常精确地定量成为可能。gmc(“基因组摩尔斯代码(genomicmorsecode)”)的使用允许检测预期的基因编辑事件以及gmc覆盖的区域中的罕见或意外的编辑事件，如下文实施例和图2d-2g中所示。通过添加涵盖潜在的脱靶事件的gmc，分子梳理允许人们在单个测定中检测中靶和脱靶事件。该测定法直接检测和计数每个分子，而没有现有检测方法所需的预分析步骤引入的偏倚性，从而为基因组和基因编辑事件的检测和定量提供了更有效和准确的方法。附图简述图1a.重组hsv-1(rhsv-1)的基因组结构以及可能在对照和i-scei处理的rhsv-1样品中观察到的不同杂交模式的示意图(生物素标记的-rhsv-1探针以白色盒表示；488标记的lacz探针用灰色框表示)。rhsv-1基因组的总体结构经显示具有独特的长(ul)和短(us)的区域，以及trl/trs和irl/irs重复。将含有巨细胞病毒(cmv)启动子和lacz编码序列的表达盒插入主要潜伏相关(lat)基因中。将i-scei靶位点克隆在cmv启动子与lacz基因之间。在“hsv-1检测信号的分析”部分中定义的最小要求杂交模式也示于完整信号的正上方。图1b.显示完整或i-scei消化/断裂的rhsv-1dna分子的实例的几个代表性线性杂交链(白色：alexa594-荧光：rhsv-1探针；灰色：alexa488-荧光：lacz探针)。图1c.显示对照和i-scei处理的rhsv-1样品中完整(白色条)和i-scei-消化/断裂(灰色条)的rhsv-1dna分子的频率的直方图。图1d.rhsv-1的基因组结构(参见图1a)和用于检测如表a所述的rhsv-1基因组不同区域的引物对。图1e.关于体外i-scei处理的rhsv-1dna和对照rhsv-1dna的半定量pcr结果的实例。使用表a所述的靶特异性引物扩增通过pcr扩增用作对照(-)的未经i-scei处理的rhsv-1和产生i-scei处理的rhsv-1样品(+)。h2o和pcls0126(在病毒lat基因中具有pcmv-lacz基因的病毒载体)分别用作阴性和阳性pcr对照。在该实例中，在阴性对照中未观察到pcr产物，并且无论使用何种引物对和稀释度(除低于检测限的1:1000外)，对于阳性对照和对于未经i-scei处理的rhsv1均检测到特异性扩增产物。相反，对于经i-scei处理的，对于i-scei靶位点重叠的sce1a和sce1b引物对未观察到扩增产物。图2a.用于评估crispr-cas9rna引导的6.5kb缺失的效率的brca1gmcv5.2的示意图。完整的brca1gmcv5.2覆盖了约200kb的区域，由16个荧光探针((b、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n和r))组成，所述探针标记有如“synthesisandlabellingofbrcaprobes”中所述的不同半抗原(氨基dig9标记的探针用黑框表示，fluo-和biot-标记的探针分别用灰色和白色框表示)。编码brca1的区域(81.2kb)由8个探针(a-h)组成，其5'-上游区域由6个探针(i-n)组成，包括brca1假基因ψbrbr1(j-k)。位于brca1gmcv5.2的每个末端的探针b和r用作锚定探针以划分目标区域。在rca1gmcv5.2的示意图上方显示brca1外显子的相对位置。图2b.brca1基因的crispr-cas9靶向。grna序列被设计成结合侧翼连接由brca1gmcv5.2的表观蓝色的b探针覆盖的brca1基因组区域的序列。灰色箭头指示grna(如表b中指定的)的相对位置，所述grna被设计成结合侧翼连接由6.5kb-表观蓝色的b探针覆盖的brca1基因组区域(grch37/hg19序列：chr17：41,205,246-41,211,745)的序列。黑色箭头显示如表c所示的用于检测6.5-kb缺失的pcr引物的相对位置。实线表示如表d中指定的用于每种grna组合的缺失区域，并且指示基因编辑后获得的预期pcr产物的大小。图2c.使用brca-left-pcr-f和brca-right-pcr-r(上图)以及brca-left-pcr-f和brca-left-pcr-r(下图)引物对在转染的hek293细胞(表d中指定的泳道1-9)和同基因对照(泳道10)中产生的crispr-cas9靶向brca1区域(grch37/hg19序列：chr17：41,205,246-41,211,745)的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳(2％)。图2d.从用left-grna7+brca-right-grna4(上图)、left-grna7+brca-right-grna9(中图)和left-grna7+brca-right-grna122(下图)grna对转染的hek293细胞提取的精梳dna上的正常和编辑的brca1荧光阵列的实例。显示了正常brca1荧光阵列的示意图(氨基dig9标记的探针用黑框表示，fluo-和biot-标记的探针分别用灰色和白色框表示)。图2e.同基因hek293细胞(对照)以及用left-grna7+brca-right-grna4、left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中分布正常和编辑的brca1荧光阵列的直方图。如“实施例2”部分所述选择和分析杂交信号。在该实例中，鉴定并分类了每种条件包含238至740个荧光信号的总杂交信号。在同基因hek293对照细胞中未检测到编辑的brca1基因，而在用left-grna7+brca-right-grna4、left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中分别定量了10.5％、11.1％和6.5％的编辑的brca1基因(其中序列b已被删除)。误差条表示95％的置信区间。具有星号的比例在调整水平α＝0.05(*)0.01(**)0,001(***)时显著不同。图2f.由设计的crispr-cas9系统诱导的brca1基因中的其他大的重排的检测。在用left-grna7+brca-right-grna4grna对转染的hek293细胞中检测到的brca1基因中的复制/倒位的实例。显示了对应于brca1基因的潜在重复/倒位的杂交模式的示意图(氨基dig9标记的探针用黑框表示，fluo-和biot-标记的探针分别用灰色和白色框表示)。阴影框表示在这些实例中已删除的brca1gmcv5.2的区域(蓝色b和绿色a探针)。括号内指示的brca1gmcv5.2的区域对应于在荧光阵列中未观察到的区域，这可能是由于在分子梳理过程期间dna分子的随机断裂而导致的。重复/倒位的断点位于表观蓝色的b探针的序列内(由叉形表示)。图2g.同基因hek293细胞(对照)和用left-grna7+brca-right-grna4、left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中重排的brca1荧光阵列的分布直方图。如“实施例2”部分所述选择和分析杂交信号。在该实例中，鉴定并分类了每种条件总共包含238至740个荧光信号的杂交信号。已在同基因hek293对照细胞以及用left-grna7+brca-right-grna4、left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中分别定量了0.9％、3.8％、2.5％和1.6％的重排的brca1基因。误差条表示95％的置信区间。具星形的比例在调整水平α＝0.05(*)0.01(**)0,001(***)时显著不同。图3a.通过ddpcr在用brca-left-grna7+brca-right-grna4、brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中测量的brca1基因中缺失事件分布的直方图。如“实施例2”部分所述，以一式三份或一式四份分析从同基因(对照)或转染的hek293细胞中提取的基因组dna。由于在ddpcr分析期间的阈值选择，在同基因hek293细胞(对照)中检测到少数伪缺失事件。从转染细胞中观察到的缺失计数中减去这些事件的平均值。对于每个样品测量出1592至2656个事件总数(正常等位基因加缺失)。在用brca-left-grna7+brca-right-grna4、brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中分别定量了14.3％、12.0％和7.9％的编辑的brca1基因(6.5kb缺失)。误差条表示标准偏差。图3b.在同基因hek293细胞(对照)和用brca-left-grna7+brca-right-grna4,brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中通过靶向ngs测量的brca1基因中缺失事件的分布的直方图。如“实施例2”部分所述，以一式两份分析从同基因(对照)或转染的hek293细胞中提取的基因组dna。对于每个样品，测量了总共1394至2086个事件(正常等位基因、缺失和重排)。在同基因hek293对照细胞中检测到一个缺失事件，而在用brca-left-grna7+brca-right-grna4、brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对感染的hek293细胞中分别定量了1.3％、1.3％和1.0％的编辑的brca1基因。结果表示为重复实验的平均值。图3c.通过靶向ngs在同基因hek293细胞(对照)和用brca-left-grna7+brca-right-grna4、brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中测量的重排brca1基因的分布的直方图。如“实施例2”部分所述，以一式两份分析从同基因(对照)或转染的hek293细胞中提取的基因组dna。对于每个样品测量1394至2086个事件总数(正常等位基因、缺失和重排)。在同基因hek293对照细胞中未检测到重排的brca1基因，而在用brca-left-grna7+brca-right-grna4,brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中分别定量了2.6％、2％和1.1％的重排brca1基因。结果表示为重复实验的平均值。发明详述如上所述，本发明的基于分子梳理的方法不需要预分析步骤，因此避免引入可归因于这些预分析步骤的偏倚性，并允许检测预期的基因编辑事件以及罕见或意外的基因编辑事件(如下面实施例以及图2d-2g中所示的)。基因或基因组编辑基因组可涉及完整的基因或基因组或者基因或基因组的片段。这些事件可以在单个测定中检测，所述测定直接调查和计数每个分子而无由预分析步骤引入的偏倚性。先前没有认识到将分子梳理与使用crispr的基因组或基因编辑相结合的方法的令人惊讶的有利方面。本发明提供了使用分子梳理，利用经修饰的核酸酶对编辑方法进行质量控制的新方法。该方法包括至少两个，优选至少三个步骤，其特征在于，首先，通过经修饰的核酸酶修饰目标一种或多种多核苷酸，第二通过包含选择的荧光多核苷酸的分子梳理检测、表征和定量所述经修饰的多核苷酸，和任选地，第三，与尚未用经修饰的核酸酶处理的一种或多种对照样品比较，以测定与该经修饰的核酸酶相关的功效和/或特异性。任选地，在分子梳理过程期间检测到的经修饰的多核苷酸允许选择最准确和高效的经修饰的核酸酶用于治疗应用，诸如基因校正和基因修饰。该方法还可任选地包括使用至少一种经修饰的核酸酶或多种经修饰的核酸酶，这取决于目标多核苷酸中的靶区域，诸如基因组或靶基因的一部分。本发明还涉及替代方法，所述替代方法在用所选择的经修饰的核酸酶处理的患者的生物样品中检测由选择的经修饰的核酸酶诱导的遗传修饰，以追踪治疗功效和安全性。在该实施方案中，所述方法包括以下步骤：首先，通过经修饰的核酸酶修饰目标多核苷酸，然后通过分子梳理(包含选择的荧光多核苷酸)检测、表征和定量所述经修饰的多核苷酸。在该实施方案中，可以任选地进行使用所选择的经修饰的核酸酶之前的样品与使用所选择的经修饰的核酸酶之后的样品之间的比较，从而允许更准确地确定治疗功效和安全性。任选地，该方法可包括使用多种经修饰的核酸酶，这取决于待校正或修饰的靶向基因组区域，诸如参与多基因疾病的靶多核苷酸区域。可根据本发明检测、表征或定量的特定遗传疾病或病症的基因组或基因编辑包括但不限于软骨发育不全、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、抗磷脂综合征、自闭症、常染色体显性多囊肾病、乳腺癌症、腓骨肌萎缩(charcot-marie-tooth)、结肠癌、猫叫样哭泣(criduchat)、克罗恩病、囊性纤维化、德卡姆病、唐氏综合征、杜安综合征、杜氏肌营养不良、因子vleiden血栓形成倾向、家族性高胆固醇血症、面-肩-肱型肌营养不良(facio-scapulo-humeraldystrophy)(fshd)、家族性地中海热、脆性x综合征、戈谢病、血色素沉着症、血友病、前脑无裂畸形、亨廷顿病、先天性睾丸发育不全综合征、利伯先天性黑矇、马凡综合征、肌强直性营养不良、神经纤维瘤病、努南综合征、成骨不全症、帕金森病、苯丙酮尿症、波兰异常、卟啉症、早老症、前列腺癌、视网膜色素变性、严重联合免疫缺陷症(scid)、镰状细胞病、皮肤癌、脊髓性肌萎缩症、泰-萨病、地中海贫血症、三甲基氨基尿症、特纳综合征、迪格奥尔格综合征、wagr综合征和wilson病。本发明的方法可用于检测、表征、评估或定量多核苷酸、基因组、外显子、内含子或所选基因中的基因组或基因编辑事件。特定种类的基因包括但不限于原核或真核基因或基因组、酵母或真菌基因组或基因、植物或藻类基因、无脊椎动物或脊椎动物基因、来自鱼类、两栖动物、爬行动物、禽类(包括鸡、火鸡和鸭)的基因、哺乳动物基因(包括家养动物诸如马、牛、母牛、山羊、绵羊、美洲驼、骆驼或猪的基因)。此类基因包括以下任何基因：哺乳动物β珠蛋白基因(hbb)、γ珠蛋白基因(hbg1)、b细胞淋巴瘤/白血病11a(bcl11a)基因、kruppel样因子1(klf1)基因、ccr5基因、cxcr4基因、ppp1r12c(aavs1)基因、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因、白蛋白基因、因子viii基因、因子ix基因、富含亮氨酸的重复激酶2(lrrk2)基因、亨廷顿(htt)基因、视紫质(rho)基因、囊性纤维化跨膜电导调节因子(cftr)基因、表面活性蛋白b基因(sftpb)、t细胞受体α(trac)基因、t细胞受体β(trbc)基因、程序性细胞死亡1(pd1)基因、细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)基因、人白细胞抗原(hla)a基因、hlab基因、hlac基因、hla-dpa基因、hla-dq基因、hla-dra基因、lmp7基因、与抗原加工相关的转运蛋白(tap)1基因、tap2基因、泰帕森基因(tapbp)、ii类主要组织相容性复合物反式激活因子(ciita)基因、肌营养不良蛋白基因(dmd)、糖皮质激素受体基因(gr)、il2rg基因、290kda的中心体蛋白(cep290)、双同源框4(dux4)和rfx5基因。此类基因还包括植物fad2基因、植物fad3基因、植物zp15基因、植物kasii基因、植物mdh基因和植物epsps基因。因此，本发明涉及用于检测、表征、定量或确定基因或基因组编辑方法或事件的效率的方法，其包括作为拉伸核酸的步骤进行的分子梳理的步骤，所述核酸从待评估的任何来源(从病毒、细菌到人直至植物......)提取以提供以线性和平行链(对齐的核酸)存在的固定的核酸。因此，分子梳理优选用在适当的表面(例如，表面经处理的载玻片)上形成的受控拉伸因子(诸如下文公开的弯液面)进行。拉伸后，可以杂交可以例如通过荧光显微镜检查可检测的序列特异性探针(lebofsky,heilig等2006)。因此，可在单个分子水平上直接显现特定核酸序列。荧光信号的长度和/或其数量和/或其在载玻片上的间距提供了探针大小和相对间距的直接读数。因此，分子梳理是一种能够直接显现单个核酸分子的技术代表本发明的目的但非限制性的分子梳理的方法由bensimon等在u.s.6,303,296中进行描述。这些方法包括用于在支持物的表面s上对齐核酸的方法，其中该方法包括(a)提供具有表面s的支持物；(b)使表面s与核酸接触；(c)将核酸锚定于表面s；(d)使表面s与第一溶剂a接触；(e)使第一溶剂a与介质b接触以形成a/b界面，其中所述介质b是气体或第二溶剂；(f)形成由第一溶剂a、表面s和介质b之间的接触产生的三线s/a/b(弯液面)；(g)移动弯液面以使核酸在表面上排列。在根据或基于u.s.6,303,296描述的元件和步骤的该分子梳理方法中，弯液面的移动可以通过蒸发溶剂a来实现，所述溶剂a可以构成水或可含有表面活性剂的另一种含水介质。在该过程中，弯液面的移动可通过a/b界面相对于表面s的移动来实现，其中s、a和b形成构成表面s、溶剂a和介质b(其可以是气体(通常是空气)或另一种溶剂)之间的弯液面的三线s/a/b，一个实例是水/空气弯液面。在该过程中，可以从溶剂a中移开表面s，或者从表面s移开溶剂a，以移动弯液面。该工艺中的表面s可包含有机聚合物、无机聚合物、金属、金属氧化物、硫化物、半导体元素或其组合，例如，其可包括玻璃、表面氧化的硅、金、石墨、硫化钼或云母。在该方法中有用的支持物可包括板、珠、纤维或颗粒。在一些实施方案中，将溶剂a置于表面s的支持物与第二支持物之间。在该过程中核酸的锚定可通过物理化学相互作用发生。在一些实施方案中，支持物的表面s包含对核酸具有亲和力的暴露的反应性基团或具有能够识别核酸的生物活性的分子，在其他实施方案中，表面包含乙烯基、胺、羧基、醛或羟基。支持物的表面s可包含基本上单分子层的有机化合物，其至少具有：(a)对支持物具有亲和力的连接基团；和(b)在附着条件下对支持物和连接基团没有或几乎没有亲和力但对核酸或具有生物活性的分子具有亲和力的暴露基团。将核酸锚定至表面可包括(a)使核酸与暴露的反应基团接触；(b)以预定的ph值或离子含量或通过施加电压将核酸吸附至暴露的反应基团，其中ph条件在导致完全吸附状态的ph与导致吸附不存在的ph之间。暴露的反应性基团可以是烯键式双键或胺基，诸如乙烯基或胺基。在一些实施方案中，核酸的吸附可以发生在核酸的末端，暴露的反应基团可以是乙烯双键，并且ph小于8，优选在5与6之间。在另一个实施方案中，核酸的吸附发生在核酸的末端，表面是聚赖氨酸或硅烷基团，并且暴露的基团是胺基。在另一个实施方案中，核酸的吸附发生在核酸的末端，暴露的反应基团是胺基，并且ph在9与10之间。根据或基于u.s.6,303,296描述的元件和步骤的分子梳理方法可用于检测样品中的核酸。这种核酸检测方法可包括(a)提供具有表面s的支持物；(b)使表面s与核酸接触；(c)将核酸锚定在表面s；(d)使表面s与第一溶剂a接触；(e)使第一溶剂a与介质b接触，形成a/b界面，其中所述介质b是气体或第二溶剂；(f)形成由第一溶剂a、表面s和介质b之间的接触产生的三线s/a/b(弯液面)；(g)移动弯液面以使核酸在表面上对齐；(h)直接或间接检测对齐的核酸。在由u.s.6,303,296描述的或基于其所描述的方法的分子梳理方法的某些实施方案中，核酸具有与样品中第二核酸序列互补的序列；具有生物活性的分子是生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、其衍生物或抗原-抗体系统；表面呈现低荧光，并使用荧光试剂直接或间接检测核酸；使用珠粒进行检测；使用光学或近场显微镜进行检测；或者该方法还可包括将第二分子与附着于表面s的核酸结合，并破坏非特异性结合。u.s.6,303,296公开的方法的其他实施方案包括用于检测样品中核酸的方法，其中该方法包括：(a)提供具有表面s的支持物；(b)将第二核酸锚定在表面s上；(c)使表面s与样品a接触，样品a包含与在第一溶剂中锚定于表面的第二核酸结合的核酸；(d)将样品中的核酸与锚定的核酸结合；(e)使样品a与介质b接触以形成a/b界面，其中所述介质b是气体或第二溶剂；(f)形成由样品a、表面s和介质b之间的接触产生的三线s/a/b(弯液面)；(g)移动弯液面以使表面上的结合核酸对齐；以及(h)直接或间接检测对齐的核酸。在由u.s.6,303,296描述的或基于其描述的方法的分子梳理方法中，检测方法可以是elisa或fish；或者样品中的核酸是酶促扩增的产物。由u.s.6,303,296描述的或基于u.s.6,303,296描述的方法的分子梳理方法可用于绘制已被修饰或修复的基因组或基因，例如通过(a)提供具有表面s的支持物；(b)使表面s与待作图的核酸接触；(c)将核酸锚定于表面s；(d)如上所述将锚定的核酸在表面上对齐；(e)将已知序列的第二核酸与第一核酸杂交；以及(f)检测第一核酸和第二核酸之间的杂交。在此类方法中，第一或第二核酸可包含基因组dna；可以测量与第一核酸结合的第二核酸的位置和/或大小；步骤(d)可包括拉伸锚定的核酸；并且杂交的存在与否提供了病理诊断或已经进行遗传修饰或进行遗传修正的指示。其他代表性但非限制性的分子梳理方法由lebofsky等在wo2008028931(其通过引用并入本文)中进行了描述。这些方法包括检测待测大分子上至少一个目标结构域的存在的方法，其中所述方法包括以下步骤：a)预先确定目标结构域上的至少两个靶区域，设计并获得每个靶区域的相应标记探针(称为目标结构域的探针组)，将选择的这些探针之一与另外的探针的位置进行比较，并在待测大分子上形成所述目标结构域的特定标签特征；b)在其上结合了步骤a)中获得的探针的待测大分子铺展后，检测线性化大分子上结合的探针之一与另外的探针相比较的位置，检测到所述目标结构域的标签特征表明待测大分子上存在所述目标结构域，相反地未检测到目标结构域的标签特征或部分标签特征表明待测大分子上不存在所述目标结构域或所述目标结构域的部分。上述方法可用于确定至少两个目标结构域的存在，并且在步骤a)中还包括预先确定每个目标结构域上的至少三个目标区域。在该方法中，目标结构域的标签特征可由连续探针之间的间隔的连续性产生；目标结构域的位置可用作定位化学或生化反应的参照；目标结构域的位置可用于在包含靶区域的大分子中建立物理图谱；目标结构域可由一系列不同的标记探针组成；或者靶区域的一些探针也可以是位于大分子附近的至少一个其目标区域的标签特征的一部分。在该方法中，所有探针可用相同的标记物标记；探针可以用至少两种不同的标记物标记；目标结构域的标签特征可以是标签特征连续性的结果。在该方法中，大分子可以是核酸，特别是dna，更特别地是双链dna；使用的探针可以是至少1kb的寡核苷酸，大分子的铺展可以通过线性化进行，所述线性化可以在探针在大分子上的结合之前或之后发生。大分子的线性化可以通过分子梳理或fiberfish进行。在一些实施方案中，至少3个对应于目标结构域的探针在大分子上的结合形成在至少两个不同间距(例如“短”和“大”)的组之间选择的至少两个间距的顺序，对于每个目标结构域来说是相同的所述组可以发生；探针组可以另外包含两个探针(探针1或探针2)，每个探针能够结合在目标结构域的不同末端上，所述探针1或探针2之一的信号的读取与目标结构域中其连续探针(命名为允许获得读数起始或结束的信息的“起始或结束的末端探针对”)相关。在一些实施方案中，读取起始的信息是起始的末端探针对的两个连续探针之间的间隔的读取结果；读取结束的信息是结束的读取末端探针对的两个连续探针之间的间隔的读取结果；或者读取起始的信息是起始的末端探针对的两个连续探针之间的间隔的读数结果并且读取结束的信息是结束的末端探针对的两个连续探针之间的间隔的读取结果，为了区分起始和结束的信息，对于起始的末端探针对和结束的末端探针对所述间隔是不同的。在该方法的其他实施方案中，探针用荧光标记物或放射性标记物标记。在一些实施例中，标签特征包含一组探针中的第一探针与第二探针之间的间距，该间距与标签特征中的所有其他间距不同，并且所述间距可用于获得关于标签特征起始的信息；或者标签特征包含一组探针中倒数第二个探针与最后一个探针之间的间距，所述间距与标签特征中的所有其他间距不同，并且该间距可用于获得关于标签特征结束的信息。本发明的具体但非限制性的实施方案包括：实施方案1.用于检测、表征、定量或确定基因或基因组编辑操作或事件的效率的方法，其包括对靶核酸进行基因组或基因编辑方法并使用分子梳理检测遗传修饰诸如缺失、重复、扩增、易位、插入或倒位或使用分子梳理定量基因组或者基因编辑方法的效率。本文描述的方法还可用于检测、表征、定量或确定对其它多核苷酸(例如对在编码序列或遗传序列外部的基因组的区段)进行修饰或编辑的效率。实施方案2.实施方案1的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括非同源末端连接(nhej)。实施方案3.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括同源重组，所述同源重组包括等位基因同源重组、基因转换、非等位基因同源重组(nahr)、断裂诱导的复制(bir)、单链退火(ssa)或其他同源重组方法中的至少。实施方案4.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括激活内源性细胞修复机制和一种靶核酸与锌指核酸酶的接触。实施方案5.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与至少一种talen(转录激活因子样效应核酸酶)接触。。实施方案6.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括激活内源细胞修复机制以及使靶核酸与至少一种大范围核酸酶接触。实施方案7.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与laglidadg(seq.idno:1)家族的至少一种大范围核酸酶接触。laglidadg(seq.idno:1)：每种多肽具有1或2个laglidadg(seq.idno:1)基序。序列laglidadg(seq.idno:1)是保守的氨基酸序列，其中每个字母是确定特定残基的代码。该序列直接参与dna切割过程。仅具有一个基序的酶作为同型二聚体起作用，产生与每个dna半位点的大沟相互作用的鞍状物(saddle)。laglidadg(seq.idno:1)基序为蛋白质结构域或亚基之间的蛋白质-蛋白质界面以及酶的活性位点贡献氨基酸残基。在单个蛋白质链中具有两个基序的酶作为单体起作用，以类似的方式产生鞍状物；参见juricams,monnatrj,stoddardbl(october1998)."dnarecognitionandcleavagebythelaglidadg(seq.idno:1)homingendonucleasei-crei",mol.cell.2(4):469–76(其通过引用并入)。实施方案8.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与选自hnh、his-cys盒、giy-yig、pd-(d/e)xk和vsr-样家族的至少一种大范围核酸酶接触。由belfortm,robertsrj(1995年9月)."homingendonucleases:keepingthehouseinorder".nucleicacidsres.25(17):3379–88(其通过引用并入)描述了由上述实施方案描述的大范围核酸酶，所述文献描述了几种结构基序。此类核酸酶可用于基因组、基因和多核苷酸编辑步骤。giy-yig：它们在n-末端区域仅具有一个与切割位点中的dna相互作用的giy-yig基序。该家族的原型酶是i-tevi，其作为单体起作用。已经报道了i-tevi的dna结合和催化结构域的单独的结构研究，前者在与其dna靶标结合的情形下，后者在没有dna的情形下，参见vanroey,p.；fox,km；等(july2001)."intertwinedstructureofthedna-bindingdomainofintronendonucleasei-teviwithitssubstrate".emboj.20(14):3631–3637以及vanroey,p.；kowalski,josephc.；等(2002年7月)."catalyticdomainstructureandhypothesisforfunctionofgiy-yigintronendonucleasei-tevi".naturestructuralbiology.9(11):806–811，所述文献通过引用并入。his-cys盒：这些酶具有30个氨基酸的区域，其包括5个保守残基：两个组氨酸和三个半胱氨酸。它们与催化所需的金属阳离子协同作用。i-ppoi是该家族中被最佳表征的酶，作为同二聚体起作用。1998年报道了其结构，参见k.；等(july1998)."dnabindingandcleavagebythenuclearintron-encodedhomingendonucleasei-ppoi".nature.394(6688):96–101，其通过引用并入。h-n-h：这些具有约30个氨基酸的共有序列。其包括两对保守的组氨酸和一个天冬酰胺，产生锌指结构域。i-hmui是该家族中被最佳表征的酶，其作为单体起作用。2004年报道了其结构，参见b.w.；等(2004年9月)."dnabindingandcleavagebythehnhhomingendonucleasei-hmui".j.mol.biol.342(1):43–56，其通过引用并入。pd-(d/e)xk：这些酶含有通常存在于ii型限制性内切核酸酶中的经典核酸酶催化结构域。该家族中最佳表征的酶i-ssp6803i作为四聚体起作用。其结构于2007年报道，参见zhao,l.等(may2007)."therestrictionfoldturnstothedarkside:abacterialhomingendonucleasewithapd-(d/e)-xkmotif".embojournal.26(9):2432–2442，其通过引用并入。vsr-样：这些酶是在全球海洋采样宏基因组数据库中发现的，并于2009年首次描述。术语“vsr样”指的是展示出与细菌极短补丁修复(vsr)内切核酸酶的可识别的同源性的c末端核酸酶结构域的存在，参见dassa,b.；等(march2009)."fracturedgenes:anovelgenomicarrangementinvolvingnewsplitinteinsandanewhomingendonucleasefamily".nucleicacidsresearch.37(8):2560–2573，其通过引用并入。实施方案9.实施方案1的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与至少一种i-crei或i-scei大范围核酸酶接触。实施方案10.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与crispr/cas9系统或crispr/cas9变体系统接触。。实施方案11.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与i型crispr/cas9系统接触。实施方案12.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑方法包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与ii型crispr/cas9系统接触。实施方案13.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作包括激活内源细胞修复机制以及使靶核酸与iii型crispr/cas9系统的接触。实施方案14.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与iv型crispr/cas9系统接触。实施方案15.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与v型crispr/cas9系统接触。实施方案16.实施方案1或前述实施方案中任何一个或多个的方法，其中所述基因或基因组编辑操作包括激活内源性细胞修复机制以及使靶核酸与vi型crispr/cas9系统接触。实施方案17.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含基因敲除的核酸重排。实施方案18.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含除单核苷酸变异外的突变的核酸重排。实施方案19.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含校正的核酸重排。这种校正可包括对编码序列的校正、编码区外的遗传序列的校正或基因区外的校正。实施方案20.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含缺失的核酸重排。这种缺失可包括对编码序列的缺失、编码区外的遗传序列的缺失或基因区外的缺失。实施方案21.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含插入的核酸重排。这种插入可包括至编码序列中的插入、至编码区外的遗传序列中的插入或至基因区外的插入。实施方案22.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含重复的核酸重排。这种重复可包括对编码序列的重复、编码区外的遗传序列的重复或基因区外的重复。实施方案23.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含扩增的核酸重排。这种扩增可包括对编码序列的扩增、编码区外的遗传序列中的扩增或基因区外的扩增。实施方案24.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含易位的核酸重排。这种易位可包括对编码序列的易位、编码区外的遗传序列中的易位或基因区外的易位。实施方案25.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因或基因组编辑操作产生包含倒位的核酸重排。这种倒位可以包括对编码序列的倒位、编码区外的遗传序列中的倒位或基因区外的倒位。实施方案26.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，所述方法以至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的准确度或效率检测或定量核酸重排或核酸重排的缺乏或脱靶事件。实施方案27.前述实施方案中任一项的方法，所述方法以比限制性位点选择、基于page的基因分型方法、基于酶促错配切割的方法测定、亚克隆靶区域、亚克隆被靶向区域、高分辨率熔解曲线(hrm)分析、下一基因测序或液滴数字pcr或任何其他检测或量化重排的常规方法中的至少一种常规方法高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多的准确度或效率检测或定量核酸重排或核酸重排的缺乏或脱靶事件。实施方案28.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因组或基因编辑或事件任选地在用多核苷酸、药物、辐照、免疫剂或其他疗法治疗受试者后在体内或从体内获得的样品中发生。实施方案29.实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法，其还包括检测包含基因组或基因重排、缺失、复制、扩增、易位、插入或倒位的多核苷酸或者选择包含所述多核苷酸的样品。实施方案30.一种通过实施方案1或前述实施方案中任一项或多项的方法选择或以其他方式鉴定或验证的重排或编辑的多核苷酸。实施方案31.实施方案30的重排或编辑的多核苷酸，其为cdna或dna。实施方案32.多核苷酸、药物、辐照、免疫剂或其他治疗剂与由实施方案1或前述实施方案中任一项或多项描述的一种或多种基因组或基因编辑或分子梳理试剂组合用于治疗人或动物体(例如，通过遗传手术或治疗)，和/或用于其诊断的用途。实施方案33.一种用于控制使用至少一种经修饰的核酸酶的多核苷酸、基因组或基因编辑操作的质量的方法，其包括：(i)使用至少一种经修饰的核酸酶编辑一种或多种目标多核苷酸，(ii)通过使一种或多种编辑的多核苷酸与和它们杂交的一种或多种荧光多核苷酸接触并进行分子梳理来检测、表征或定量一种或多种所述编辑的多核苷酸，以及(iii)将与所述目标荧光多核苷酸杂交的编辑的多核苷酸与和一种或多种所述荧光多核苷酸杂交的一种或多种未用经修饰的核酸酶处理的对照多核苷酸进行比较，从而确定使用所述经修饰的核酸酶的多核苷酸编辑方法的效率、准确度或特异性；(iv)任选地，选择基于经修饰的核酸酶的多核苷酸、基因组或基因编辑方法，所述操作对于特定多核苷酸、基因或基因组的校正或修饰或对于治疗性应用是最准确或最高效的。该编辑操作可以用本文所述的任何修饰的核酸酶或两种或更多种此类核酸酶进行，例如，当要修饰多核苷酸、基因或基因组的不同部分时。可使用本领域已知的分子梳理方法或本文所述的那些分子梳理方法进行该操作。实施方案34.根据实施方案1或前述实施方案中的一项或多项的方法，其中所述进行基因组或基因编辑方法包括：将所述经修饰的核酸序列与相应的标记的目标标准参照遗传序列接触的第一步，所述基因组dna中的遗传修饰、缺失或替换已经用工程化核酸酶或大范围核酸酶操作，将所述经修饰的核酸序列与相应的目标标准参照核酸序列进行比较。实施方案35.根据实施方案1或前述实施方案中的一项或多项的方法，其包括定量缺失事件或不想要的遗传事件或意外重排的数量，并且同时鉴定遗传修饰或经修饰的基因组的被靶向区域中的缺失的步骤。实施方案36.根据实施方案1或前述实施方案中的一项或多项的方法，其包括：定量发生的缺失事件或不想要的遗传事件或意外重排的次数的步骤，以及所述步骤之后的第二步骤，其允许鉴定缺失，然后定量经修饰的基因组的靶向区域或序列中的意外重排或不想要的遗传事件，其中所述修饰通过工程化核酸酶或大范围核酸酶来操作，或任选地接着进行第二步骤，其允许鉴定经修饰的基因组的靶向区域或序列中的缺失，然后定量所述靶向区域或序列中的意外重排或不想要的遗传事件，其中所述修饰通过工程化核酸酶或大范围核酸酶来操作。实施方案37.根据实施方案1或前述实施方案中的一项或多项的方法，其中所述经修饰的核酸是基因组dna或在严格条件下与参照或正常野生型dna杂交的重组或合成dna。实施方案38.根据实施方案1或前述实施方案中的一项或多项的方法，其中所述检测或定量dna修饰包括定量brca1基因组dna中缺失事件的数量并鉴定靶向细胞基因组dna中的所述遗传修饰。实施方案39.一种用于检测、表征、定量或确定基因或基因组编辑方法或事件的效率的方法，其包括：编辑基因或基因组中的靶核酸以及使用分子梳理检测或定量编辑的靶核酸中的至少一个遗传修饰、缺失、复制、扩增、易位、插入或倒位。实施方案40.实施方案39的方法，其中所述编辑包括靶核酸中双链断裂中的非同源末端连接(nhej)。实施方案41.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑包括靶核酸中的同源重组，所述同源重组包括等位基因同源重组、基因转换、非等位基因同源重组中、断裂诱导的复制(bir)或单链退火(ssa)中的至少一种。实施方案42.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑方法包括激活内源细胞修复机制以及使靶核酸与锌指核酸酶接触。实施方案43.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与至少一种talen(转录激活因子样效应核酸酶)接触。实施方案44.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与至少一种大范围核酸酶接触。实施方案45.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与laglidadg(seq.idno:1)家族的至少一种大范围核酸酶接触。实施方案46.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与至少一种i-crei或i-scei大范围核酸酶接触。实施方案47.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与crispr/cas9系统或crispr/cas9变体系统接触。实施方案48.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与i型crispr/cas9系统接触；其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与ii型crispr/cas9系统接触；其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与iii型crispr/cas9系统接触；其中编辑包括激活内源性细胞修复机制和靶核酸与iv型crispr/cas9系统接触；其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与v型crispr/cas9系统接触；其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制并使靶核酸与vi型crispr/cas9系统接触。实施方案49.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑产生敲除基因的核酸重排。实施方案50.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑产生使靶核酸突变的核酸重排；其中所述编辑产生包含基因校正的核酸重排；其中所述编辑产生包含缺失的核酸重排；其中所述编辑产生包含插入的核酸重排；其中所述编辑产生包含重复的核酸重排；其中所述编辑产生包含扩增的核酸重排；其中所述编辑产生包含易位的核酸重排；或其中所述编辑产生包含倒位的核酸重排。实施方案51.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，所述方法定量通过编辑靶核酸产生的核酸重排的数目。实施方案52.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，所述方法通过比常规定量方法更快或以更高的准确度定量通过编辑靶核酸产生的核酸重排的数量，所述常规定量方法选自限制性位点选择、基于page的基因分型测定、基于酶促错配切割的测定、亚克隆靶区域、高分辨率熔解曲线(hrm)分析、下一代基因测序和液滴数字pcr。实施方案53.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑任选地在用多核苷酸、药物、辐照、免疫剂或其他疗法治疗受试者之后在体内或离体发生。实施方案54.根据实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述编辑包括：将已用工程化核酸酶或大范围核酸酶编辑的靶核酸与未编辑的对照靶序列接触，以及将所述编辑的靶核酸序列与未编辑的对照靶序列的序列进行比较。实施方案55.根据实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中通过分子梳理定量所述靶核酸中的多个缺失或其他不想要的或意外的遗传事件以及对靶核酸的所需编辑的数目。实施方案56.实施方案54的方法，其中使用工程化核酸酶或大范围核酸酶进行所述编辑实施方案57.根据实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述靶核酸包含brca1基因组dna。实施方案58.实施方案39或前述实施方案中任一项或多项的方法，其中所述基因组或基因编辑操作或事件任选地在通过基因疗法或利用多核苷酸、药物、辐照、免疫剂或其他疗法治疗受试者之后在体内或从体内获得的样品中发生。实施方案59.一种用于确定使用至少一种经修饰的核酸酶的多核苷酸编辑操作的效率、准确度或特异性的方法，所述方法包括：(i)使用至少一种经修饰的核酸酶编辑一种或多种目标多核苷酸，(ii)使所述经编辑的多核苷酸与和它们杂交的一种或多种标记的多核苷酸接触，并进行荧光标记的多核苷酸的分子梳理，以及(iii)将与所述标记的多核苷酸杂交的编辑的多核苷酸与和所述标记的多核苷酸杂交的未用经修饰的核酸酶处理的一种或多种对照多核苷酸进行比较，从而确定使用经修饰的核酸酶的多核苷酸编辑操作的效率、准确度或特异性；以及(iv)任选地，选择基于经修饰的核酸酶的多核苷酸编辑方法，其对于特定目标多核苷酸的校正或修饰是最准确或有效的。实施方案60.根据实施方案1或29或59中任一项的方法，其中所述靶核酸或目标靶多核苷酸包含brca1基因组dna。实施方案61.根据实施方案1至60中任一项的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从包含基因组或遗传物质的评估样品中制备包埋的dna材料，诸如包埋的dna琼脂糖塞；(b)提取从步骤(a)回收的包埋的dna材料以回收dna，并通过拉伸dna并回收固定的线性和平行核酸链对提取的dna进行分子梳理；其中提取步骤任选地包括用蛋白酶消化所述包埋的dna材料的步骤；(c)在精梳dna上，使标记的探针杂交，其中所述探针对于基因或基因组编辑事件的检测是特异性的；(d)检测与探针杂交的精梳dna；(e)通过区分完整的dna分子与编辑的dna分子来检测和/或定量编辑事件，其中在步骤(a)之前和/或步骤(a)与(b)之间，进行用编辑操作，特别是用大范围核酸酶处理评估的样品或所述样品的基因组或遗传物质的步骤，并任选地，其中对照样品用步骤(a)-(e)处理但不经历编辑操作，以用于与评估的样品比较。以下实施例举例说明了本发明的特定非限制性实施方案或方面或其支持。实施例实施例1-由大范围核酸酶诱导的基因组编辑事件的检测从病毒颗粒制备包埋的dna塞用如mahiet等(mahiet,ergani等2012)和wo2011/132078(ep2561104b1)中所述的改进方法制备含有重组hsv-1(rhsv-1)(grosse,huot等2011)的琼脂糖塞。简言之，将rhsv-1颗粒以5·106个病毒颗粒/ml的浓度重悬于1xpbs中，并在50℃下以1:1的比例与在pbs中制备的1.2％w/v的低熔点琼脂糖溶液(nusievegtg,ref.50081,cambrex)充分混合。将90μl的病毒颗粒/琼脂糖混合物倒入塞形成孔(biorad,ref.170-3713)中并在4℃下冷却至少30分钟。将包埋的重组病毒颗粒在0.1％sds-0.5medta(ph8.0)溶液中于50℃下裂解30分钟。在室温下进行3次10分钟的在0.5medta(ph8.0)缓冲液中的洗涤步骤后，通过在50℃下于250μl消化缓冲液(0.5medta(ph8.0))中与2mg/ml蛋白酶k(eurobiocodegexprk01,france)一起孵育过夜来消化塞子。体外i-scei诱导的双链断裂首先，将来自重组病毒颗粒的包埋dna的琼脂糖塞在100μl以10:1于te中稀释的不含醋酸镁的1xtango缓冲液(newenglandbiolabs)中与20ui-scei在冰上孵育2小时。将在未处理的i-scei样品中用h2o取代i-scei用作阴性对照。然后，加入醋酸镁至终浓度为10μm以允许i-scei活性起始，并在37℃下孵育2小时。在室温下进行3次30分钟的在ten10:20:100中的洗涤步骤后，通过在50℃下在250μl消化缓冲液(0.5medta(ph8.0)中与2mg/ml蛋白酶k(eurobiocodegexprk01,france)孵育过夜来再次消化塞子。dna提取和分子梳理如前所述(schurra和bensimon2009)，处理来自未用i-scei处理和经i-scei处理的rhsv-1的包埋的dna的琼脂糖塞以梳理dna。简言之，首先在15mlte中以10:1洗涤塞子3次，每次30分钟，然后在68℃下在mes0.5m(ph5.5)溶液中熔解20分钟，加入1.5单位的β-琼脂糖酶(newenglandbiolabs,ref.m0392s,ma,usa)并在42℃下孵育长达16小时。然后将dna溶液倒入teflon储库中，并使用分子梳理系统(genomicvisions.a.,paris,france)和分子梳理盖玻片(20mmx20mm,genomicvisions.a.,paris,france)进行分子梳理。将精梳表面在60℃下干燥4小时。hsv-1探针的标记41种hsv-1探针和lacz探针(含有i-scei位点)是如mahiet等(mahiet,ergani等2012)和wo2011/132078(ep2561104b1)中所述的。简言之，使用常规随机引发方案进行探针的标记。对于hsv-1探针，除使标记反应进行过夜外，根据制造商的说明将dna试剂盒(invitrogen，代码：18094-011,ca,usa)与生物素-11-dctp一起使用。为了高效标记，将hsv-1探针聚集成3至5个组(每种质粒200ng)。lacz探针(200ng)用alexa488-7-obea-dctp标记。对于该标记，用含有40μm的每种datp、dttp和dgtp、20μm的dctp和20μm的alexafluor488-7-obea-dctp(thermofischerscientific,ref:c21555)替代来自试剂盒的dntp混合物。在琼脂糖凝胶上显现反应产物以验证dna的合成。hsv-1探针在精梳病毒dna上的杂交和检测后续步骤也基本上如先前在schurra和bensimon(schurra和bensimon2009)中所述进行。简言之，将标记探针的混合物(每种探针250ng)与10μg鲱鱼精子dna和2.5μg人cot-1dna(invitrogen,ref.15279-011,ca,usa)一起进行乙醇沉淀，重悬于20μl杂交缓冲液(50％甲酰胺，2xssc,0.5％sds,0.5％sarkosyl,10mmnacl,30％block-aid(invitrogen,ref.b-10710,ca,usa))中。将探针溶液和探针一起在杂交器(dako,ref.s2451)上于90℃下热变性5分钟，并使杂交在37℃下在杂交器上进行过夜。将载玻片在室温下于50％甲酰胺，2xssc中洗涤3次，在2xssc溶液中洗涤3次，每次5分钟。在最后的洗涤步骤后，将杂交的盖玻片在70％、90％和100％乙醇溶液中逐渐脱水并空气干燥。使用两层或三层1:25稀释的抗体检测标记探针。用缀合有alexa594的链霉抗生物素蛋白(invitrogen)作为第一层显现显示生物素-11-dctp标记的探针，然后与生物素化的山羊抗链霉抗生物素蛋白抗体(vectorlaboratories)一起孵育，然后与偶联alexa594的链霉抗生物素蛋白一起孵育。用缀合有488的多克隆兔抗体(invitrogen)，然后用多克隆缀合有488的山羊抗兔抗体(invitrogen)作为最终层连续显现488-7-obea-dctp标记的lacz探针。对于每层，在载玻片上加入20μl抗体溶液并用精梳盖玻片覆盖，将载玻片在潮湿气氛中于37℃孵育20分钟。将载玻片在2xssc，1％tween20溶液中在室温下在每层之间和最后一层之后洗涤3次，每次3分钟。在最后的洗涤步骤之后，将所有玻璃盖玻片在乙醇中脱水并空气干燥。hsv-1检测信号的分析使用配备有40x物镜(imagexpressmicro,moleculardevices,usa)的倒置自动落射荧光显微镜，在没有任何封固介质的情况下扫描来自重组病毒颗粒的杂交精梳dna，并且可目测检测或通过内部软件(gvlab0.4.2)自动检测信号。为了定量消化效率，所有具有完整lacz探针的荧光信号阵列，例如，alexafluor488荧光信号侧翼为594信号，被认为是完整的rhsv-1分子(nd％)，而具有间断的lacz探针的荧光信号阵列，例如仅在其一个末端侧面具有594信号的alexafluor488荧光信号，被认为是具有i-scei诱导的dbs的rhsv-1分子或在实验过程中被随机剪切的分子(d％)。在没有添加i-scei酶的对照条件下评估剪切的dna分子的基础水平。在这些条件下，如下计算总体消化效率：半定量pcr在分子梳理后，将dna溶液转移到透析管中，并在4℃下针对3升te10:1进行透析过夜。按照制造商的说明(rochediagnostics)，使用如表a中所述的不同引物对(每种25μmol)和expandtmhighfidelitypcr系统，使用dna溶液的连续稀释物(1:1至1:1000)作为模板进行半定量pcr。在2％琼脂糖凝胶上显现扩增产物以验证dna的大小。由于sce-1a和sce-1b引物对位于i-scei位点的两侧，因此在i-scei诱导的dbs的情况下未获得扩增产物，而sce-2和sce-3引物对用作阳性对照，因为从完整和i-scei诱导的dbsrhsv-1dna分子获得反应产物。表a：用于通过pcr扩增rhsv-1区域的引物序列。rhsv-1dna分子中i-scei大范围核酸酶诱导的dbs的检测和定量本发明人应用分子梳理均匀地拉伸已经在琼脂糖塞中通过i-scei大范围核酸酶处理的rhsv-1dna，并将所得的精梳rhsv-1dna与标记的相邻和重叠的dna探针(图1a；hsv-1：594-荧光；lacz：488-荧光)杂交以区分完整的rhsv-1dna分子与具有isce-i诱导的dbs区的rhsv-1分子。由一对具有包埋的rhsv-1dna的琼脂糖塞组成的3个独立实验，如“体外i-seci诱导的双链断裂”部分中所述，用i-scei大范围核酸酶处理或不处理所述rhsv-1dna。免疫荧光显微术(图1b)显现出满足评价标准的每种条件(表b)929至1473个多色线性图案(参见“hsv-1检测信号的分析”部分)。完整rhsv-1信号和具有i-scei诱导的dbs的信号之间的信号分类显示i-scei活性几乎是完全的，平均活性高于90％(表b和图1c)。为了证实通过分子梳理观察到的i-scei活性，我们使用如表a中所述和图1d中所示的不同引物对，使用对照dna和i-scei处理的dna作为模板进行半定量pcr分析。设置不同的pcr管，使得它们在dna模板的量上也发生变化(对照rhsv-1dna或处理的rhsv-1dna的1:1至1:1000连续稀释)。这是因为pcr扩增虽然在理论上是对数的，但在低或高数量的扩增循环中并非如此。对数或指数扩增通常仅在中间循环期间发生，这取决于靶模板的浓度。因此，只能在此阶段进行比较。扩增后，将相同体积的反应产物在2％琼脂糖凝胶上电泳。然后获得染色的pcr产物的图像并通过视觉比较进行分析(图1e)。利用sce-1a和sce-1b引物对的pcr产物的缺乏意味着i-scei大范围核酸酶在rhsv-1dna中引入dsb，而利用这些引物对存在pcr产物表明i-scei活性的缺乏或不可检测。sce-2和sce-3引物对用作阳性对照以排除rhsv-1dna的降解，因此无论条件经(i-scei处理的rhsv-1或对照rhsv-1)如何都应观察pcr产物。正如预期的那样，对于阴性对照(h2o)未获得pcr产物，而无论引物对如何，对于阳性对照(pcls0126)，pcr产物得以扩增。对于每对引物，从未用i-scei大范围核酸酶处理的rhsv-1dna扩增pcr产物。对于i-scei处理的样品，在未稀释的dna样品(1:1)中观察到对应于利用引物对sce-1a和1b的pcr产物的条带，但与用sce2和sce3引物对扩增的pcr产物相比具有较弱的强度。在稀释的样品(1:10至1:100)中，具有引物对sce-1a和1b的扩增产物是不可检测的，而对sce2和sce3引物对仍然观察到pcr产物。这些结果证实i-scei大范围核酸酶的活性几乎是完全的，因此证实了通过分子梳理分析获得的数据。这些结果表明，本发明的分子梳理技术是用于在独特分子水平上检测大范围核酸酶诱导的dsb事件并定量其活性效力的强大方法。表b：从3次独立实验获得的数据。实施例2-由crispr-cas9rna引导的核酸酶诱导的基因组编辑事件的检测hek293细胞中的brca基因编辑将hek293细胞系在完全dmem培养基(dmem高葡萄糖+10％fbs+/pen/strep抗生素)中于37℃，5％co2气氛中培养。通过以1:10的比例每4-5天拆分来维持细胞。为了在hek293细胞中的brca基因中产生6.5kb缺失，设计了grna对(参见表c)并将其克隆到pspcas9(bb)-2a-puro(px459)载体(alstem,ca,usa)中。使用6μlnanofect转染试剂，用1μg的每种brca-left-grna和brca-right-grna转染3x105个细胞。用brca-left-grna和brca-right-grna的不同组合进行转染。同基因细胞培养物，例如未用grna载体转染的hek293细胞也用作阴性对照。4天后，收获转染的细胞，用genomicdnaextraction试剂盒(avegene)提取基因组dna。表c：用于brca靶向的grna序列转染的细胞库的pcr表征随后使用high-fidelitydna聚合酶和表d中所述的引物对将基因组dna用于pcr以扩增靶向brca区域。用2％琼脂糖凝胶验证dna的大小。由于brca-left-pcr-f和brca-left-pcr-r引物对用作阳性对照，因此扩增反应不受crispr-cas9诱导的brca缺失影响。对于位于靶向brca位点两侧的brca-left-pcr-f和brca-right-pcr-r引物对，在同基因对照中不能扩增出预期的7224bp扩增产物，因为pcr延伸时间仅为30秒，而在于brca1基因中具有预期的编辑事件的样品中获得较短的pcr产物(在490与651bp之间，取决于grna组合，参见表e)。表d：pcr引物和tm值表e:grna组合及其预期的pcr大小从hek293细胞培养物制备包埋的dna塞如schurra和bensimon(schurra和bensimon2009)中所述制备具有来自同基因或转染的hek293细胞的包埋的dna的琼脂糖塞。简言之，将细胞以107个细胞/ml的浓度(以1:1的比例在50℃下与在1xpbs中制备的1.2％w/v的低熔点琼脂糖(nusievegtg,ref.50081,cambrex)溶液充分混合的)重悬于1xpbs中。将90μl细胞/琼脂糖混合物倒入塞形成孔(biorad,ref.170-3713)中并在4℃下冷却至少30分钟。将琼脂糖塞在50℃下在250μl的0.5medta(ph8)、1％sarkosyl、250μg/ml蛋白酶k(eurobio,code:gexprk01,france)溶液中孵育过夜，然后在室温下在tris10mm,edta1mm溶液中洗涤两次，每次30分钟。dna的最终提取和分子梳理如前所述(schurra和bensimon2009)，处理来自hek293对照和转染的细胞的包埋dna塞以用于梳理dna。简言之，将塞子在68℃下在mes0.5m(ph5.5)溶液中熔化20分钟，并加入1.5单位的β-琼脂糖酶(newenglandbiolabs,ref.m0392s,ma,usa)并在42℃下孵育长达16小时。然后将dna溶液倒入一次性dna储库(genomicvisions.a.,paris,france)中，并使用分子梳理系统(genomicvisions.a.,paris,france)和(20mmx20mm,genomicvisions.a.,paris,france)进行分子梳理。将精梳表面在60℃下干燥4小时。brca探针的合成和标记探针相对于人grch37/hg19序列(chr17:41,176,611-41,372,447)的坐标列于表f中。在该实施例中，探针大小范围为3059至9551bp。表f：brca探针除synt1b、s7b_1、s11_2和s12_2探针外，先前在cheeseman等(cheeseman,rouleau等2012)和wo2014/140788(a1)中描述了所有探针。使用表g中列出的引物以及使用细菌人工染色体(bac)rp11-831f13(invitrogen)作为模板dna，使用lrtaqdna聚合酶(roche，试剂盒代码：11681842001)通过长程pcr产生synt1b、s7b_1、s11_2和s12_2探针。使用xlpcr克隆试剂盒(invitrogen,france，代码k455010)将pcr产物连接到载体中。对每个探针的两个末端进行测序以进行验证。表g：用于brca探针克隆的pcr引物对为了进行标记，根据掺入的半抗原对brca探针进行分组：探针a1+a2(表观b探针)、sex21(表观b探针)、s3big(表观d探针)、s8(表观i探针)、s9(表观j探针)和b2(表观n探针)用3-氨基-3-脱氧地高辛配基-9-dctp(aminodig-9-dctp)共同标记；探针s1(表观a探针)、s5(表观f探针)、s7(表观h探针)，s7b+12_2(表观l探针)和b3(表观m探针)用荧光素-12-dutp(fluo-dutp)共同标记；探针s2(表观c探针)，s4(表观e探针)，s6+synt1(表观g探针)、synt1b+s11_2(表观k探针)和s10(表观r探针)用生物素-11-dctp(biot-dctp)共同标记。除来自试剂盒的dntp混合物被表h中指定的混合物替换并使标记反应进行过夜外，根据制造商的说明，使用dna试剂盒(invitrogen，代码：18094-011,ca,usa)，使用常规随机引发方案标记200ng的每个brca探针组。标记后，根据制造商的说明用pcrpurification试剂盒(thermofischerscientific；codek310001)纯化标记的产物。表h：用于brca探针标记的dntp混合物brca1gmc在精梳基因组dna上的杂交和检测后续步骤也基本上如先前在schurra和bensimon，2009(schurra和bensimon2009)中所述进行。简言之，将标记探针的混合物(每种探针250ng)与10μg鲱鱼精子dna和2.5μg人cot-1dna(invitrogen,ref.15279-011,ca,usa)一起乙醇沉淀，重悬于20μl杂交缓冲液(50％甲酰胺，2xssc，0.5％sds，0.5％sarkosyl，10mmnacl，30％block-aid(invitrogen,ref.b-10710,ca,usa)中。将探针溶液和探针在杂交器(dako,ref.s2451)上在90℃下一起热变性5分钟，并使杂交在37℃下在杂交器上进行过夜。将载玻片在60℃预温热的2xssc溶液中洗涤3次，在室温下每次进行5分钟。在最后的洗涤步骤后，将杂交的盖玻片在70％、90％和100％乙醇溶液中梯度脱水并空气干燥。为了检测，在载玻片上加入20μl在中稀释的抗体溶液，盖上精梳盖玻片，将载玻片在潮湿的气氛中于37℃孵育20分钟。使用1:25稀释的针对aminodig9-dctp-标记的探针的偶联有alexa647的小鼠单克隆抗地高辛(jacksonimmunoresearch，代码200-162-037)抗体、1:25稀释的针对fluo-dutp-标记的探针的偶联有cy3的小鼠单克隆抗荧光素(jacksonimmunoresearch，代码200-602-156)抗体和1:25稀释的针对biot-dctp-标记的探针的偶联有bv480的链霉抗生物素蛋白(bdbiosciences，代码564876)进行brcagmc的检测。然后将载玻片在2xssc，1％tween20溶液中在室温下洗涤3次，每次3分钟，并将所有玻璃盖玻片在乙醇中脱水并空气干燥。brca检测信号的分析使用配备有40x物镜(genomicvisions.a.,paris,france)的倒置自动落射式荧光显微镜在没有任何封固剂的情况下扫描来自同基因和转染的hek293细胞制备物的杂交精梳dna，并通过内部软件(brca,genomicvisions.a.,paris,france)分析信号。为了定量crispr-cas9grna引导的brca1缺失，考虑了由至少3个探针组成并含有表观探针a和探针c的所有荧光阵列信号。在同基因(iso)和转染的(trans)hek293细胞中计数当表观蓝色探针b存在于表观探针a与c(正常等位基因；nd％)之间或不存在(6.5kb缺失；d％)时的荧光信号。在这些条件下，如下计算总体crispr/cas9rna引导系统的效力：与正常brca1gmcv5.2或编辑的brca1(没有表观蓝色b探针的序列)不对应的所有荧光阵列被认为是重排的brca1信号。如下计算重排brca1信号的频率：使用正常逼近法进行比例的双样本测试来进行数据的统计分析，使用benjamini-hochberg调整进行多重测试。由crispr-cas9介导的brca1中的基因编辑事件的检测和定量本发明人已对从hek293细胞提取的dna应用了分子梳理，所述hek293细胞已用如图2b和表c中所示的靶向brca1基因(grch37/hg19sequence:chr17:41,176,611-41,372,447)的3'区的grna对转染，并用brca1gmc(图2a)杂交。为了检测转染的hek细胞库中crispr-cas9诱导的6-5kbbrca1缺失的存在，使用如表d中所述和图2b中显示的不同引物对，使用对照和转染的heh293dna作为模板进行pcr分析。扩增后，将反应产物在2％琼脂糖凝胶上电泳。然后获得染色的pcr产物的图像并通过视觉比较进行分析(图2c)。在所有dna样品中观察到用作阳性对照的具有brca-left-pcr-f和brca-left-pcr-r引物对的扩增产物。对于位于靶brca位点两侧的brca-left-pcr-f和brca-right-pcr-r引物对，预期的7224bp扩增产物在同基因对照中未扩增，因为pcr延伸时间仅为30秒，而在于brca1基因中具有预期的编辑事件的样品中获得较短的pcr产物(490与651bp之间，取决于grna组合，参见表e)。这些结果表明，预期的crispr-cas9介导的基因事件以不确定的细胞比例存在于转染的hek293细胞库中。为了显现和定量cripsr-cas9系统诱导的brca16.5kb缺失，将标记的brca1特异性探针在来自同基因hek293细胞(对照)的精梳dna提取物上杂交和在用left-grna7+brca-right-grna4、left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中杂交。免疫荧光显微术(图2d；aminodig9标记的探针用黑框表示，fluo-和biot-标记的探针分别用灰色和白色框表示)表现出满足评估标准(参见“brca检测信号的分析”部分)的每种条件238至740个多色线性图案(表i)。在同基因hek293对照细胞中未检测到编辑的brca1基因，而在用left-grna7+brca-right-grna4、left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中分别定量了10.5％、11.1％和6.5％的编辑的brca1基因(其中序列b已被删除)(图2e)。统计分析显示，与同基因hek293对照细胞相比，转染的hek293细胞中观察到的基因编辑事件的比例是显著的。还显示left-grna7+brca-right-grna4和left-grna7+brca-right-grna9组合表现出比left-grna7+brca-right-grna12grna对显著更高的效率。本发明人发现本发明的分子梳理技术是用于在独特分子水平上检测crispr-cas9诱导的基因编辑事件并定量其活性效lt的强大方法。crispr-cas9介导的重排brca1基因的检测和定量本发明人检测到荧光阵列(图2f；aminodig9标记的探针由黑框表示，fluo-和biot-标记的探针分别用灰色和白色框表示)，其不对应于正常brca1gmcv5.2或编辑的brca1形式(例如，具有对应于表观蓝色b探针的缺失序列)，其可能源自具有grna对的转染的hek293细胞中crispr-cas9活性诱导的重组。将标记的brca1特异性探针在来自同基因hek293细胞(对照)的精梳dna提取物上杂交和在用left-grna7+brca-right-grna4、left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中杂交，以评估brca1基因中非经典结构的比例。鉴定并分类了每种条件包含238至740个荧光信号的总的杂交信号。已在同基因hk293对照细胞中定量了0.9％的重排brca1基因，而在用eleft-grna7+brca-right-grna4、left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对的转染hek293细胞中分别检测到3.8％、2.5％和1.6％的重排brca1基因(图2g和表i)。在用测试的不同grna对转染的hek293细胞中重排brca1基因的频率增加表明设计的crispr-cas9可诱导比预期的重排大的brca1中的其他大的重排，例如，对应于表观蓝色b探针的序列的缺失。统计分析显示，用left-grna7+brca-right-grna9和left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中观察到的重组brca1基因的比例与同基因hek293对照细胞没有统计学差异，而这一比例对于left-grna7+brca-right-grna4组合显著更高，表明该最后的grna的特异性不如另外两种grna(图2g)。分子梳理使得能够实现crispr-cas9诱导的意外重排brca1基因的显现和定量，并且根据它们无限的条形码组合可能，是分析和定量它们的强大方法。表i：数据概括实施例3-由crispr-cas9rna引导的核酸酶诱导的潜在脱靶位点的检测和定量为了鉴定可能由如实施例2中所述的用于在brca基因中产生6.5kb缺失的grna的不同组合产生的潜在脱靶位点，本发明人使用cas-offinder(可在线获得：http://_www.rgenome.net/cas-offinder/)，其为快速搜索由grna引导的cas9核酸酶的可能脱靶位点的算法。该cripsr识别工具搜索整个基因组的脱靶，并支持多达10个错配和7种不同的pam类型。在该实施例中，由来自酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)的cas9在人grch37/hg19序列中产生的潜在脱靶位点(其中5'-nrg-3'(r＝a或g)序列作为pam类型)被鉴定为具有最多2个错配。结果示于表j中。以类似于实施例2中的crisprcas9系统诱导的brca1基因中的大重排(图2f和2g)的检测的方式，将特异性和独特的gmc专门设计成覆盖已被鉴定的每个潜在的脱靶位点。使用这些专门设计的探针进行分子梳理，以检测用crispr-cas9处理的细胞和用作对照的同基因细胞中的不同荧光阵列。不与设计的gmc对应的荧光阵列对应于大的重排。通过比较对照细胞与处理的细胞，确定与设计的crispr-cas9系统的活性相关的这些基因组事件的频率。转染细胞库的ddpcr表征随后使用来自同基因或转染的hek293细胞的基因组dna，利用qx200微滴数字pcr(ddpcrtm)系统(bio-rad)表征靶向brca区域。使用基于ddpcrevagreen的测定进行转染细胞对比同基因细胞中的缺失事件的绝对定量。仪器控制和数据分析使用quantasofttm软件(1.7版)进行。对于每个实验点，在20μl的最终pcr反应体积中使用10ng基因组dna。循环条件为95℃5分钟，和35个循环(95℃30秒，65℃1分钟)，然后4℃5分钟，以及在98℃下的最后变性步骤5分钟(eppendorfnexusgradient主循环仪)。pcr实验中使用的两对引物(brca-left-pcr-f/brca-left-pcr-r和brca-left-pcr-f/brca-right-pcr-r；终浓度，各150nm)的序列和tm值描述于表d中。用qx200液滴读数器分析pcr。以一式四份分析从用brca-left-grna7+brca-right-grna4和brca-left-grna7+brca-right-grna9grna对转染的hek293细胞制备的基因组dna。以一式三份分析从同基因hek293细胞(对照)和用brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的细胞中提取的dna。对于每个样品，表k中显示了同基因(iso)hek293细胞和转染的(trans)hek293细胞中正常等位基因(n)和编辑的等位基因(6.5kb缺失；d)的拷贝数。由于任意的阈值选择，一些pcr事件被计为同基因对照中的缺失。因此，对于每个grna对，如下计算crispr/cas9rna引导的系统的效力：已在用brca-left-grna7+brca-right-grna4、brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中分别定量了编辑的brca1基因(6.5kb缺失)为14.3±1.8％、12.0±0.5％和7.9±1.1％(图3a)。这些值接近于用分子梳理技术计算的值，但系统地更高并且呈现更低的标准偏差(图2e)。差异可能归因于通过ddpcr分析的事件数量更多(平均每个样本共计2059个事件用ddpcr测量，而466个事件用分子梳理测量)。在另一方面，由于pcr引物位于预期缺失的两侧并且靠近切割位点，因此只有真正的缺失事件才通过ddpcr方法定量。为了被检测和定量，重排事件(诸如重复和倒位)将需要设计特异性引物。在任何情况下并且与分子梳理方法相反，由于以切割位点周围的狭窄区域为中心的分析，ddpcr技术将不能提供对不想要的事件的穷尽表征和定量。表k：数据概括通过靶向下一代测序(ngs)表征转染的细胞库来自同基因或转染的hek293细胞的基因组dna也用于通过ngs对整个brca1基因进行靶向重测序。用covaris聚焦超声发生器(片段中位大小：200bp)将1至3μg的每种基因组dna样品进行机械片段化。用8个碱基的特异性illumina条形码对100ng这种片段化的dna进行末端标记。然后pcr扩增带条形码的dna片段，并使用自制的生物素化探针对750ngpcr文库进行brca1基因的选择性捕获。探针被设计成覆盖含有brca1基因的17号染色体上的207kb区域。根据人参照基因组的grch37/hg19组装体，该区域的界限是chr17:41,172,482-41,379,594。在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠上捕获与生物素化探针互补的带条形码的文库的单链dna分子，随后通过pcr扩增以产生最终的捕获后文库的库。对于从同基因或转染的hek293细胞中提取的每种dna样品，分别产生两个独立的捕获后文库。在hiseq2500测序系统上使用illumina配对末端技术对捕获后文库进行测序。解复用后，使用burrows-wheeler校准器(li,h.(2012)““exploringsingle-samplesnpandindelcallingwithwhole-genomedenovoassembly.”bioinformatics28(14):1838-1844)将fastq序列文件与人参照基因组的grch37/hg19组装体对齐。针对每个样品获得的平均覆盖深度≥2000x，其中≥100％的靶碱基覆盖至少100x。为了定量缺失和不想要的事件，利用sambamba工具仅选择覆盖染色体17:41,205,189位置(对应于由brca-left-grna7rna引导靶向的并且为全部三对grna所共有的断裂位点)并显示>6000bp的模板的读数。从这些新的bam文件中进行了配对末端聚类分析。对于缺失，仅计算fr对(首先以正向读取，其次以反向读取)。ff和rr对以及rf对被考虑来分别用于定量倒位和重复事件。对于每个样品，表l中显示了同基因(iso)和转染的(trans)hek293细胞中正常(n)、缺失(del)、倒位(inv)和重复(dup)等位基因的拷贝数。如下计算crispr/cas9rna引导的系统的效率：如下计算重排brca1等位基因的频率：在用brca-left-grna7+brca-right-grna4、brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中如通过ngs测量的缺失频率分别为1.3％、1.3％和1％(图3b)。这些值低于用分子梳理和ddpcr方法计算的值的约1/10(图3b和图2e)。这种差异可能归因于用寡核苷酸生物素化探针和链霉抗生物素蛋白包被的磁珠靶向捕获brca1基因期间的实验偏差。实际上，brca1序列的特异性捕获的效率是未知的。此外，靶向ngs方案的两个强制性pcr步骤也可能是误差的来源。与对于缺失获得的结果相反，用brca-left-grna7+brca-right-grna4、brca-left-grna7+brca-right-grna9和brca-left-grna7+brca-right-grna12grna对转染的hek293细胞中的重排频率与利用分子梳理技术计算的频率处于相同的量级：分别为2.6％、2％和1.1％对比3.8％、2.5％和1.6％(图3c和图2g)。与两种测试的替代方法(通过ddpcr和靶向的新一代测序进行绝对定量)相比，分子梳理技术的独特之处在于其使得能够可靠、快速地检测和定量brca1基因中由工程化核酸酶诱导的缺失以及不想要的大的重排。该有利方面尤其归因于显现和分析由可编程核酸酶靶向的位点周围的大的基因组区域。另一方面，分子梳理技术的主要有利方面是在操作过程中没有扩增步骤，所述扩增是潜在的统计误差来源。这种无偏倚性的方法通过分析长而独特的dna分子而允许选择和验证呈现预期的编辑事件的工程化细胞和拒绝具有不想要的重排的细胞。表l：数据概括在分子梳理方法中覆盖brca1基因的探针杂交的严格条件。在实施例2段落的“brca1探针的合成和标记”部分中精确描述了用于合成和标记覆盖brca1基因座的探针的方法。下一部分-“brca1gmc在精梳基因组dna上的杂交和检测”-涉及探针的杂交和目标区域的检测。如上所述，杂交条件的高严格性由杂交缓冲液的盐度、离子表面活性剂的存在和甲酰胺(50％甲酰胺，2xssc，0.5％sds，0.5％sarkosyl，10mmnacl，30％block-aid(invitrogen,ref.b-10710,ca,usa)的使用。另外，通过使用鲱鱼精子dna可以增强dna探针的特异性，所述鲱鱼精子dna减少与盖玻片表面的非特异性结合。此外，人cot-1dna限制了通过随机引发合成的探针与散布在基因组中的重复元件的非特异性杂交。最后，在杂交步骤后，将盖玻片在60℃下于2xssc中洗涤3次(每次5分钟)以消除非特异性结合。所有这些实验条件都有助于对精梳dna纤维进行的杂交的高严格性。检测和定量意外或不想要的重排或遗传事件。标记的基因组莫尔斯密码序列(如本发明中的一般技术所定义的)被设计成覆盖由工程化核酸酶或大范围核酸酶编辑的基因组区域和/或基因。在brca1基因工程的情况下，构成gmc的探针的总长度等于132,567个碱基(参见图2a和图2b以及表f)并且远远超过82.1kb的基因。优选地，构成gmc的探针之一覆盖待编辑的区域。特别是在brca1实验中的情况，其中b探针大致对应于由crispr-cas9系统诱导的6.5kb缺失(参见图2a和图2b)。通过比较工程化细胞中gmc的特征谱与同基因(对照)未转染细胞中的参照特征谱来进行缺失(6.5kb)的检测和核酸酶效率的测量。总之，brca1gmc的b探针在对照细胞中是可检测的，并且在由工程化核酸酶正确编辑的细胞中不存在。通过扩展，不对应于在同基因(对照)或编辑的(缺失)细胞中预期的gmc特征谱的任何gmc特征谱是不想要的事件的标签特征。这种重排示于图2f中。这种倒位/复制事件可归因于仅一次切割而不是两次切割(两种sgrna对不同时起作用)和探针b水平上的同源重组。术语。本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不意图限制本发明。本文使用的标题(诸如“背景”和“概述”)和子标题仅旨在用于本发明内的主题的一般组织，并且不旨在限制本发明的公开内容或其任何方面。特别地，“背景”中公开的主题可包括新技术，并且可以不构成现有技术的叙述。“概述”中公开的主题不是对技术的整个范围或其任何实施例的穷尽或完整的公开。为了方便起见，在本说明书的部分内将材料分类或讨论是具有特定效用，并且不应推断当材料在任何给定的组合物中使用时，该材料必须或单独地根据其在本文中的分类起作用。如本文中所使用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”旨在也包括复数形式。将进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”指明所述特征、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、步骤、操作、元件、组件和/或其组的存在或添加。如本文中所用，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何和所有组合，并且可以缩写为“/”。通过删除http：或通过在www之前插入空格或带下划线的空格来禁用链接。在一些情况下，通过“最后访问”日期的链接可获得的文本可以通过引用并入。如本说明书和权利要求书中所使用的，包括如在实施例中所使用的并且除非另有明确说明，否则可读取所有数字，就如同以“基本上”、“约”或“大致”一词开头，即使该术语不是明确地显现。当描述量值和/或位置以指示所描述的值和/或位置在合理预期的值和/或位置范围内时，可使用短语“约”或“大致”。例如，数值可具有为所述值(或值的范围)的+/-0.1％、所述值(或值的范围)的+/-1％、所述规定值(或数值范围)的+/-2％、所述规定值(或数值范围)的+/-5％、所述规定值(或数值范围)的+/-10％、所述规定值(或数值范围)的+/-15％、所述规定值(或数值范围)的+/-20％等的值。本文引述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围或中间值。对特定参数(诸如温度、分子量、重量百分比等)的值和值范围的公开不排除可用于本文的其他值和值范围。可以设想，给定参数的两个或更多个特定示例值可以定义可以为参数声明的值范围的端点。例如，如果参数x在本文中示例为具有值a并且还例示为具有值z，则可以设想参数x可以具有从约a至约z的值的范围。类似地，可以设想用于参数的两个或更多个值范围的公开内容(无论此类范围是嵌套的、重叠的还是不同的)包含可使用所公开范围的端点声明的值的范围的所有可能组合。例如，如果参数x在本文中例示为具有1-10的范围内的值，则其还描述参数x的子范围，包括1-9、1-8、1-7、2-9、2-8、2-7、3-9、3-8、3-7、2-8、3-7、4-6或7-10、8-10or9-10(仅作为实例)。范围包含其端点以及端点内的值，例如，范围0-5包括0、>0、1、2、3、4、<5和5。如本文中所用，词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下提供某些益处的技术实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的引述并不意味着其他实施方案是无用的，并且不旨在将其他实施例排除在本技术的范围之外。如本文中所述，除非另有说明，否则所有组成百分比均以总组合物的重量计。如本文中所用，词语“包括”及其变化形式旨在是非限制性的，使得列表中的物品的引述不排除也可用于本技术的材料、组合、设备和方法的其他类似物品。类似地，术语“能够(can)”和“可(may)”及其变化形式旨在是非限制性的，使得实施方案可以或可包括某些元素或特征的引述不排除不包含那些元素或特征的本发明的其它实施方案。尽管可在本文中使用术语“第一”和“第二”来描述各种特征/元素(包括步骤)，但除非上下文另有说明，否则这些特征/元素不应受这些术语限制。这些术语可能用于将一个特征/元素与另一个特征/元素区分开。因此，下面讨论的第一特征/元素可以被称为第二特征/元素，并且类似地，下面讨论的第二特征/元素可被称为第一特征/元素而不脱离本发明的教导。当特征或元素在本文中被称为在另一特征或元素“上”时，其可以直接在另一特征或元素上，或者也可以存在中间特征和/或元素。相反，当特征或元素被称为“直接在”另一特征或元素上时，不存在中间特征或元素。还应该理解，当一个特征或元素被称为与另一个特征或元素“连接”、“附接”或“偶联”时，其可以与另一个特征或元素直接连接、附接或偶联，或者存在中间特征或元素。相反，当特征或元件被称为与另一个特征或元素“直接连接”、“直接附接”或“直接偶联”时，不存在中间特征或元素。尽管针对一个实施方案进行了描述或显示，但所描述或所显示的特征和元素可应用于其他实施方案。本领域技术人员还将理解，对与另一特征“相邻”排列的结构或特征的引用可具有与相邻特征重叠或位于相邻特征之下的部分。本说明书和具体实例(虽然指示了本技术的实施方案)旨在仅用于说明的目的，并不旨在限制本技术的范围。此外，具有所述特征的多个实施方案的引述并不旨在排除具有另外特征的其他实施方案，或包含所述特征的不同组合的其他实施方案。提供具体实施方案以用于说明如何制备和使用本技术的组合物和方法的目的，并且除非另有明确说明，否则不旨在表示本技术的给定实施方案已经或尚未产生或测试。本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用整体并入本文，其程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入，特别地参考出现在其中通过引用并入出现的本说明书的同一句子、段落、页或部分中的公开内容。本文引用的参考文献并不构成承认这些参考文献是现有技术或与本文公开的技术的可专利性有任何关联。对所引用的参考文献的内容的任何讨论仅旨在提供参考文献的作者所作出的断言的一般概述，并不构成对这些参考文献的内容的准确性的承认。科学出版物aach,j.,p.mali,etal.(2014)."casfinder:flexiblealgorithmforidentifyingspecificcas9targetsingenomes."biorxiv.abudayyeh,o.o.,j.s.gootenberg,etal.(2016)."c2c2isasingle-componentprogrammablerna-guidedrna-targetingcrispreffector."science353(6299):aaf5573.allers,t.andm.lichten(2001)."differentialtimingandcontrolofnoncrossoverandcrossoverrecombinationduringmeiosis."cell106(1):47-57.allers,t.andm.lichten(2001)."intermediatesofyeastmeioticrecombinationcontainheteroduplexdna."molcell8(1):225-231.arnould,s.,c.perez,etal.(2007)."engineeredi-creiderivativescleavingsequencesfromthehumanxpcgenecaninducehighlyefficientgenecorrectioninmammaliancells."jmolbiol371(1):49-65.aronin,n.andm.difiglia(2014)."huntingtin-loweringstrategiesinhuntington'sdisease:antisenseoligonucleotides,smallrnas,andgeneediting."movdisord29(11):1455-1461.bae,s.,j.park,etal.(2014)."cas-offinder:afastandversatilealgorithmthatsearchesforpotentialoff-targetsitesofcas9rna-guidedendonucleases."bioinformatics30(10):1473-1475.bailis,j.m.,d.d.luche,etal.(2008)."minichromosomemaintenanceproteinsinteractwithcheckpointandrecombinationproteinstopromotes-phasegenomestability."molcellbiol28(5):1724-1738.baker,m.(2012)."gene-editingnucleases."natmethods9(1):23-26.barrangou,r.,c.fremaux,etal.(2007)."crisprprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes."science315(5819):1709-1712.baum,c.,u.modlich,etal.(2011)."concisereview:managinggenotoxicityinthetherapeuticmodificationofstemcells."stemcells29(10):1479-1484.beisel,c.l.,a.a.gomaa,etal.(2014)."acrisprdesignfornext-generationantimicrobials."genomebiol15(11):516.belfort,m.andr.j.roberts(1997)."homingendonucleases:keepingthehouseinorder."nucleicacidsres25(17):3379-3388.bell,c.c.,g.w.magor,etal.(2014)."ahigh-throughputscreeningstrategyfordetectingcrispr-cas9inducedmutationsusingnext-generationsequencing."bmcgenomics15:1002.bhattacharyya,a.andd.m.lilley(1989)."singlebasemismatchesindna.long-andshort-rangestructureprobedbyanalysisofaxistrajectoryandlocalchemicalreactivity."jmolbiol209(4):583-597.bibikova,m.,d.carroll,etal.(2001)."stimulationofhomologousrecombinationthroughtargetedcleavagebychimericnucleases."molcellbiol21(1):289-297.bibikova,m.,m.golic,etal.(2002)."targetedchromosomalcleavageandmutagenesisindrosophilausingzinc-fingernucleases."genetics161(3):1169-1175.boch,j.,h.scholze,etal.(2009)."breakingthecodeofdnabindingspecificityoftal-typeiiieffectors."science326(5959):1509-1512.caburet,s.,c.conti,etal.(2005)."humanribosomalrnagenearraysdisplayabroadrangeofpalindromicstructures."genomeres15(8):1079-1085.canver,m.c.,d.e.bauer,etal.(2014)."characterizationofgenomicdeletionefficiencymediatedbyclusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeats(crispr)/cas9nucleasesysteminmammaliancells."jbiolchem289(31):21312-21324.chapman,j.r.,m.r.taylor,etal.(2012)."playingtheendgame:dnadouble-strandbreakrepairpathwaychoice."molcell47(4):497-510.cheeseman,k.,j.ropars,etal.(2014)."multiplerecenthorizontaltransfersofalargegenomicregionincheesemakingfungi."natcommun5:2876.cheeseman,k.,e.rouleau,etal.(2012)."adiagnosticgenetictestforthephysicalmappingofgermlinerearrangementsinthesusceptibilitybreastcancergenesbrca1andbrca2."hummutat33(6):998-1009.chen,b.andb.huang(2014)."imaginggenomicelementsinlivingcellsusingcrispr/cas9."methodsenzymol546:337-354.chevalier,b.s.andb.l.stoddard(2001)."homingendonucleases:structuralandfunctionalinsightintothecatalystsofintron/inteinmobility."nucleicacidsres29(18):3757-3774.cho,s.w.,s.kim,etal.(2013)."targetedgenomeengineeringinhumancellswiththecas9rna-guidedendonuclease."natbiotechnol31(3):230-232.choulika,a.,a.perrin,etal.(1995)."inductionofhomologousrecombinationinmammalianchromosomesbyusingthei-sceisystemofsaccharomycescerevisiae."molcellbiol15(4):1968-1973.christian,m.,t.cermak,etal.(2010)."targetingdnadouble-strandbreakswithtaleffectornucleases."genetics186(2):757-761.chylinski,k.,k.s.makarova,etal.(2014)."classificationandevolutionoftypeiicrispr-cassystems."nucleicacidsres42(10):6091-6105.cicalese,m.p.anda.aiuti(2015)."clinicalapplicationsofgenetherapyforprimaryimmunodeficiencies."humgenether26(4):210-219.cohen-tannoudji,m.,s.robine,etal.(1998)."i-scei-inducedgenereplacementatanaturallocusinembryonicstemcells."molcellbiol18(3):1444-1448.cong,l.,f.a.ran,etal.(2013)."multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems."science339(6121):819-823.conti,c.,j.herrick,etal.(2007)."unsch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