本发明属于疫苗制备
技术领域：
，具体涉及一种鸭病毒性肝炎病毒及其应用。
背景技术：
：鸭病毒性肝炎(duckviralhepatitis,dvh)是由鸭病毒性肝炎病毒(duckhepatitisvirus,dhv)引起雏鸭的一种以肝脏肿胀和出血为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，以肝脏肿胀和出血为特征性病变。1～3周龄的雏鸭易感，发病严重，传播迅速，雏鸭通常在出现症状后的1小时内死亡，10日龄雏鸭感染后死亡率90～95％，已经成为严重危害养鸭业的主要疾病之一。鸭肝炎病毒(dhv)血清型dhv有4个独立的血清型，1型、2型、3型和新型(未定型)。范书才等(范书才,李虹,袁率珍等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定.中国预防兽医学报,2009,10)通过试验证明目前在我国同时存在1型和新型dhv流行。血清中和试验表明，1型和新型之间缺乏交叉保护作用。在4个血清型的dhv中，1型与新型dhv流行最广泛，毒力最强，对3周龄内的雏鸭致死率可在80％以上；2型dhv仅在英国，3型仅在美国有报道；二者均呈散发性流行，致死率低(约20％)。由于市场spf鸭胚来源比较困难，所以目前现有的鸭肝炎新型灭活疫苗均采用鸭胚制造，鸭胚很难保证鸭胚的鸭病毒性肝炎中和抗体阴性及纯净性，因此本发明开展了新型鸭病毒性肝炎在spf鸡胚传代的试验。技术实现要素：本发明的目的是制备新型鸡胚适应毒的鸭病毒性肝炎抗原，制成新型油乳剂灭活疫苗，用此疫苗免疫动物，可预防新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎，此疫苗具有效价高、保护率高、安全性好等优点。本发明首先提供一种鸡胚适应性鸭病毒性肝炎病毒，是将野生的鸭病毒性肝炎病毒在鸡胚上进行传代后获得的能稳定在鸡胚上增殖的病毒；所述的鸡胚适应性鸭病毒性肝炎病毒，其一种为鸭病毒性肝炎病毒ybhxn株，已于2017年11月23日送保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.v201761。本发明的鸡胚适应性鸭病毒性肝炎病毒用于制备疫苗；本发明再一个方面提供一种疫苗，其中使用的抗原为灭活的病毒性肝炎病毒ybhxn株；所述的灭活是采用甲醛溶液进行灭活；本发明所提供的疫苗，包含疫苗佐剂，其中佐剂为兽用白油、硬脂酸铝和司本80；上述佐剂中兽用白油、硬脂酸铝和司本80的质量份数比:47：1：3；本发明从优势流行毒株中筛选出免疫原性良好的鸭病毒性肝炎病毒，经在spf鸡胚传代，传至58代后获得的一株稳定的，免疫原性好的鸡胚适应疫苗制备毒株，接种鸡胚，收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。此疫苗能预防由新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎，具有高效、安全性好、保护率高等优点。附图说明图1：n-dhv引物扩增条带图。具体实施方式在前期1型鸭病毒性肝炎鸡胚适应毒研究的基础上，申请人将新型鸭肝毒肝炎通过在鸡胚上连续传代，研究出了新型的鸡胚适应毒，病毒在鸡胚上能稳定的增殖。用此毒株制备疫苗并进行免疫种鸭，子代能获得很好的保护。研究结果表明，研制的新型鸡胚适应毒灭活疫苗效价高，安全性好，保护率高，克服了鸭胚来源不稳定及鸭胚母源抗体对病毒增殖的影响，并且大大降低的实验和生产的成本，为鸭病毒性肝炎疫苗的推广和使用奠定了坚实的基础。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。实施例1：鸡胚适应性鸭病毒性肝炎病毒的筛选从优势流行毒株中筛选出免疫原性良好的鸭病毒性肝炎病毒，经在spf鸡胚连续传代，传至40代时获得的一株稳定的，免疫原性好的鸡胚适应疫苗制备毒株，后传至58代毒株表现良好的稳定性，eld50在106.50～106.78之间。1、病毒传代将毒种ybhxn株冻融3次，4000r/min离心30min，取上清作100倍稀释，尿囊腔接种9日龄spf鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸡胚，分别置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。将上述组织匀浆后，以同样的方法继续传代，记录鸡胚死亡情况，并测定病毒含量。结果详见表1，病毒在spf胚传至40代时，spf鸡胚8/10～10/10死亡，从40代对该病毒进行了病毒含量的测定，结果表明，eld50在106.50～106.78之间，毒株传代稳定。表1：ybhx株e1～e58代毒种spf鸡胚传代表制苗免疫原用鸭病毒性肝炎病毒新型鸡胚适应毒ybhxn株，由青岛易邦生物公程有限公司分离、鉴定、保管和供应。新型ybhxn株是2008年从山东省某鸭场病死鸭的肝脏中分离后经在鸡胚传至58代后获得的一个毒。以上毒株已于2017年11月23日送交至武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.v201761。2鸭病毒性肝炎病毒新型鸡胚适应毒ybhxn株vp1蛋白基因序列分析2.1引物设计与合成韩国n-dhvap-04114株(dq812093)基因组全序列，选择vp1基因保守区域，使用generunner软件设计2对特异性引物，由上海生物工程有限公司合成。n-dhv:上游:cagatggccgccaatgatca下游:gtctctgacatttcgaaattgg2.2rna提取将传代前的ybhx株病毒及传代第5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55及58代后的ybhxn株病毒分别按照rna提取试剂盒说明书提取总rna。2.3rt-pcr扩增n-dhvvp1pcr反应条件50℃30min；94℃预变性2min；94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min；4℃结束反应。pcr产物由上海生物工程有限公司测序。2.4序列分析应用dnaman和mega4.0软件将获得的测序结果进行分析，将序列与genbank中登录的dhv参考病毒株推导的氨基酸序列进行序列比对。2.5rt-pcr检测结果采用韩国n-dhv株vp1基因的引物进行rt-pcr扩增，结果显示，传代前的ybhx株病毒及传代第5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55及58代后的ybhxn株病毒均扩增出大小约760bp的目的条带(图1)。2.6vp1基因序列分析利用dnaman软件对扩增的不同代次的病毒的vp1基因进行序列分析，比较推导的氨基酸序列的差异。结果显示，该病毒在鸡胚上传至40代以后，氨基酸序列发生的变化，由gdsnqlgddepvcflnfetanvpiqgeshtlvkhlfgrqwlvrtvqhtsevqeldlpvpdqghasllrffayfsgeviltivnngttpcmvahsytmdnltseyavtamggilipansakninipfysvtplrptrpmpasqgggltfgrlyiwtqsgsvsvfmglhkpalffplpaptytthtllnkietmnlhdqsdqpdchlckicrkmkkwfrnhrpfrfclrlktlafelhleie变为gdsnqlgddepvcflnfetanvpiqgeshtlvkhlfgrqwlvrtvqhtsevqeldlpvpdqghasllrffayfsgeviltivnngttpcmvahsytmdnltseyavtamggilipansakninipfysvtplrptrpmpasqgggltfgrlyiwthsgsvsvfmglhkpalffplpaptytthtwlnkietmnlhdqsdqpdchlckicrkmkkwfrnhrpfrfclrlktlafelhleie即156位氨基由q变为h，185位由l变为w；表明本发明筛选的ybhx株已能适应鸡胚传代。实施例2疫苗的制备(一)疫苗(免疫原)制备：1制苗用病毒液的制备将生产用毒种ybhxn株作100倍稀释，分别尿囊腔接种9日龄spf鸡胚100枚和9日龄非免疫鸡胚100枚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸡胚，分别置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。将胚液匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。(参见表2)。表2：毒液的制备毒株名称胚品种接种胚数(枚)胚日龄收获胚液(ml)ybhxn株spf鸡胚10091500ybhxn株非免疫鸡胚100914002灭活分别将spf胚与非免疫鸡胚的新型鸭肝炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10％(体积比)甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)后取出，置2～8℃保存。3疫苗半成品检验(1)无菌检验分别取灭活的spf鸡胚与非免疫鸡胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。(2)病毒含量测定1)新型spf胚病毒液将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别尿囊腔接种9日龄spf鸡胚5枚，每胚0.2ml。同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，eld50，为106.9。2)新型非免疫胚病毒液将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别尿囊腔接种9日龄非免疫胚5枚，每胚0.2ml。同时设生理盐水对照，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，eld50，为106.9。(3)灭活检验分别将spf胚和非免疫胚灭活后的病毒液尿囊腔接种9日龄spf鸡胚和9日龄非免疫鸡胚各10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时，spf鸡胚和非免疫鸡胚均无死亡。4灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计，参见表2、表3)。(1)油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－806份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。(2)水相制备将灭活检验合格的ybhxn株病毒液混合，检测每0.2ml水相中含ybhxn株病毒含量，106.3eld50。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。(3)乳化取油相1.5份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1.5份，以12000r/min，乳化6分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。(4)分装定量分装，加盖密封。表3spf鸡胚疫苗乳化和分装表4非免疫鸡胚疫苗乳化和分装实施例3疫苗成品检验将spf鸡胚和非免疫鸡胚制备的新型鸭病毒性肝炎灭活疫苗分别进行疫苗的成品检验。1性状(1)外观均为乳白色乳剂。(2)剂型均为油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。(3)稳定性分别吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底均无水相析出。(4)黏度分别按现行版《中国兽药典》附录进行，结果为61.6cp、58.3cp。2装量检查分别按现行版《中国兽药典》附录进行,符合标准。3无菌检验分别按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。4安全检验用21～35日龄spf鸡25只，分成3组，第1组10只鸡，每只颈部皮下注射spf鸡胚制备的新型鸭病毒性肝炎灭活疫苗2.0ml，第2组10只鸡，每只颈部皮下注射非免疫鸡胚制备的新型鸭病毒性肝炎灭活疫苗2.0ml，第3组5只鸡不免疫作对照。在相同的条件下饲养，连续观察14日，试验鸡和对照鸡全部健活,且均未出现任何因疫苗引起的局部和全身反应。5甲醛残留量测定分别按现行版《中国兽药典》附录进行测定，甲醛残留量分别为0.09％、0.07％。6效力检验用24日龄spf鸡25只，分成3组，第1组10只鸡，每只颈部皮下注射spf鸡胚制备的新型鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.0ml，第2组10只鸡，每只颈部皮下注射非免疫鸡胚制备的新型鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.0ml，第3组5只鸡不免疫作对照。免后21日，采血分离血清，分别测定新型鸭肝炎中和抗体效价。表5疫苗效力检验结果spf鸡胚制备的新型鸭病毒性肝炎灭活疫苗免疫鸡后中和抗体效价为3/10为1:64，6/10为1:128，1/10为1:256；非免疫鸡胚制备的新型鸭病毒性肝炎灭活疫苗免疫鸡后中和抗体效价为2/10为1:64，5/10为1:128，3/10为1:256，对照组5只鸡均为阴性。(参见表5)。上述结果表明本发明制备的疫苗具有很好的免疫效果。当前第1页12