本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种原代人乳腺癌细胞分离及培养方法。
背景技术：
乳腺癌是一种通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，是严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一，肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的微环境有着密切关系。肿瘤微环境是一个错综复杂的系统，其中肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associatedfibroblast，cas)是肿瘤微环境最主要的宿主细胞之一。原代培养的人乳腺癌caf是直接从组织分离下来的，其生物学特性及遗传特性未发生明显变化，最接近和反映其体内生长特性，是研究肿瘤微环境caf本身生物学特征、基因表达、体外化疗药物敏感试验快速筛选有效化疗药物。药物疗效体外试验的模型，也是研究乳腺癌微环境caf与乳腺癌细胞之间相互关系的理想模型。但是人乳腺癌中含有大量脂肪组织，使得分离和纯化人乳腺癌caf存在一定难度。本发明提供一种相对完善的人乳腺癌组织成纤维细胞原代培养方法，为研究乳腺肿瘤微环境caf及其与乳腺癌细胞生物相互作用奠定了基础，也为肿瘤的发生发展及综合治疗的研究提供了手段。
技术实现要素：
本发明的目的是建立一种耗时短、高效获得人乳腺癌细胞的方法。
为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得原代人乳腺癌细胞：
本发明提供一种原代人乳腺癌细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)含双抗预冷pbs清洗组织标本；(b)剪碎组织，混合酶液消化；(c)完全混合培养基终止消化；(d)连续筛网过滤，收集滤液离心；(e)重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中；(f)培养数天后更换混合完全培养基继续培养。
可选的组织标本为新鲜的组织标本；
可选的混合酶液为0.05％-0.1％的i型胶原酶、0.05％-0.1％的ii型胶原酶和0.1％-0.15％的透明质酸酶，消化时间为1.5h-2h；
可选的混合完全培养基为含10％fbs的h-dmem和1640(2∶1)；
可选的连续筛网过滤的方法为，消化后的组织液依次经过80目、100目、200目筛网过滤；
可选的差速贴壁的方法为混合完全培养基重悬接种后，培养2-4h后更换新鲜完全培养基。
本发明提供一种混合酶消化法获得原代人乳腺癌细胞的方法，不仅操作步骤简便，耗时短，而且获得的人乳腺癌细胞活性高。
附图说明
图1培养72h细胞图片(100×)
具体实施方式
为了使本发明的目的及优势更清晰地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。
本发明选择新鲜的人乳腺癌组织，分离人乳腺癌细胞。具体操作如下：
1、用含双抗预冷的pbs冲洗组织标本2-3次；
2、充分剪碎组织标本，加入0.05％-0.1％的i型胶原酶、0.05％-0.1％的ii型胶原酶和0.1％-0.15％的透明质酸酶的混合酶液，37℃摇床水浴锅中消化1.5h-2h；
3、用含10％fbs的h-dmem和rpmi1640(2∶1)混合完全培养基终止消化；
4、将消化后的组织依次经80目、100目、200目筛网过滤，收集滤液，1800rpm/min离心5min，弃上清；
5、无菌pbs清洗2次，混合完全培养基重悬细胞沉淀；
6、37℃、5％(m/v)的co2、饱和湿度的培养箱中培养2-3天，弃去不贴壁细胞，加入新鲜混合完全培养基，继续培养，每隔两天换液一次；
以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。