技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产氢复合生物制剂。
背景技术：
氢气是一种清洁的可再生能源，传统的化学产氢方法采用电解水或热解石油、天然气，这些方法需要消耗大量的电力或矿物资源，生产成本也普遍较高。因此，新的产氢方法，特别是能利用可再生能源，低成本，能大量生产的产氢方法倍受关注。目前氢气制备主要包括化石原料制氢、电解水制氢和生物制氢等。然而，目前氢气的产生主要依靠热化学和光电化学两种途径，此途径不但生产成本昂贵、需要大量的能量并且环境污染严重，排放大量的温室气体，所以是非环保的，前者需要消耗大量的煤炭、石油、天然气等宝贵的不可再生资源：后者则需消耗大量的电能为代价。
目前生物产氢的研究主要集中在光合细菌和微藻。虽然光合细菌在放氢时不放氧，但不能直接利用太阳能产氢；同时，由于可用于产氢的有机物的产地和数量等因素也决定了其应用范围有限，难以为人类大规模提供氢源。而藻产氢是通过光合作用系统及特有的产氢酶利用太阳能把水分解为氢气和氧气，所以有较好的应用前景。目前研究较多的是藻类制氢。和传统的化石原料制氢、电解水制氢方法相比，藻制氢具有以下几个优点：(1)太阳能转换效率高达10％；(2)利用自然界最丰富的能源太阳光和廉价水来产生氢气；(3)生长周期短，生长速度快，8h繁殖翻倍：(4)生物反应器能量要求较低及初期的投资也较少； (5)产氢的绿藻同时也可作为优良蛋白及健康食品使用；(6)产氢的过程中没有毒也没有污染副产物的出现。从当前的生物技术知识来看，在某些领域，煤燃烧所放出的能量能完全被氢气燃烧所替代。
绿藻放氢的研究最有可能成为将来产氢研究的主体。由于绿藻产氢机理不同，所以，获得更多的高产氢藻种，研究其放氢特性，势在必行。绿藻的氢化酶对氧气极为敏感，很容易受氧气的抑制而失去活性，而氧气又是光合作用的专一性产物，导致藻的产氢效率较低，很大程度上限制了绿藻产氢的发展，因此想提高绿藻的产氢量就要降低其细胞内氧气的含量。目前降低氧气含量的方法主要是通过去除培养基中的硫元素，从而抑制光合系统的放氧活性，降低了光解水产生的氧气含量，但是该方法同时也抑制了光解水产生的电子产量，最终导致产氢效率低。现有技术有一些关于藻类和菌类联合产氢的报道，但是大多存在协同效果不明显，操作步骤相对复杂，配伍比例难以控制等缺陷，研究选择合适的藻类和菌株，进行合理配伍，制备成高效产氢复合制剂是我们需要解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的是解决现有技术藻类产氢效率低等缺陷，提供了一种产氢复合生物制剂。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种产氢复合生物制剂，其包括蛋白核小球藻、屎肠球菌以及沼泽红假单胞菌。
进一步地，
所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：步骤1）制备种子液，步骤2）制备藻液，步骤3）制备复合菌液，步骤4）制备改良TAP培养液，步骤5）制备复合生物制剂。
进一步地，
所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：
步骤1）制备种子液：挑取蛋白核小球藻到盛有1L增殖培养基的培养瓶中，光照度150μmol·m-2·s-1，26℃培养，每天摇动三角瓶2-3次；培养3-4d得到处于对数生长期的种子液；
步骤2）制备藻液：将步骤1）的种子液按照6-8%的接种量接种到TAP培养液中进行培养4d，得到藻液；
步骤3）制备复合菌液：将屎肠球菌和沼泽红假单胞菌分别按照常规培养获得1×108CFU/ml的种子液，然后按照2:3的体积比混合得到混合种子液，再按照8%的接种量转到发酵培养基中，30℃培养12h，得到复合菌液；
步骤4）制备改良TAP培养液：往TAP培养液中添加亚油酸甘油酯，控制亚油酸甘油酯的浓度为1-1.5mg/L，得到改良TAP培养液；
步骤5）制备复合生物制剂：将藻液、复合菌液以及改良TAP培养液按照5-12:0.5-1:100-200的体积比混匀，即得。
优选地，
所述增殖培养基每升含下述组分：葡萄糖3g，酵母粉1g，硝酸钠1g，亚硫酸钠1g，氯化钠0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸亚铁0.1g；
优选地，
所述步骤2）中，培养条件为：光照强度为150μmol·m-2·s-1的，光暗比为12h:12h，温度为26℃, pH为8。
优选地，
所述发酵培养基的配方按质量百分比为：糖蜜3%、玉米浆2.5％、豆粕2％、K2HPO40.1％、KH2PO4 0.1％、CaCO3 0.01％、FeSO4 0.005％、MnSO4 0.005％，余量为水，pH7.0。
本发明的出发点以及取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
蛋白核小球藻能够在生长中释放碳水化合物、氨基酸、脂类等物质到环境中供细菌利用，同时细菌又可以为藻类提供生长促进因子，如无机氮、磷，糖类物质及维生素等，合适的藻和菌之间可能形成共栖关系；选择合适的菌株与藻类进行配伍尤为重要。
屎肠球菌属于厌氧菌，可以发酵产生甲酸盐，乙酸盐，有机酸等有机物，而且发酵过程中只会产生氢气和二氧化碳；而沼泽红假单胞菌属于好氧光合菌，其在厌氧条件下也可以生长，沼泽红假单胞菌可以屎肠球菌发酵产生的物质为底物，产氢效果好；混合菌液在厌氧光照条件下生长迅速，在好氧条件下也能够生长，有效利用了蛋白核小球藻产生的氧气，使得氧气含量降低最低，从而达到较好的产氢能力；两种菌株协同发酵产生的复合菌液，能够有效促进蛋白核小球藻产氢；菌液产生的二氧化碳能够满足藻细胞快速生长所需，提高藻的生物量，进而对产氢总量带来正面效应。
本发明复合生物制剂的产氢量明显优于单独采用藻类发酵的方式，藻的生物量也明显提高，氧浓度保持在合理低水平，有利用保持产氢酶的活性，提高产氢量；化学刺激物可以调整藻类的增殖速度以及理化性能，本发明通过选择多种化学刺激物进行试验，发现亚油酸甘油酯可以调节蛋白核小球藻的生物量以及产氢率；通过多浓度梯度试验发现，1-2mg/L添加量对能够提高藻细胞的产氢量，并且对藻类生物量也提到明显的促进作用；提高添加量反而会对藻类产生抑制作用，从而对产氢产生负面效应。
说明书附图
图1：复合生物制剂产氢性能试验；
图2：菌株对藻生物量的影响；
图3：亚油酸甘油酯对蛋白核小球藻产氢量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种产氢复合生物制剂，其包括蛋白核小球藻、屎肠球菌以及沼泽红假单胞菌。
具体地，所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：
步骤1）制备种子液：挑取蛋白核小球藻到盛有1L增殖培养基的培养瓶中，光照度150μmol·m-2·s-1，26℃培养，每天摇动三角瓶2-3次；培养4d得到处于对数生长期的种子液；所述增殖培养基每升含下述组分：葡萄糖3g，酵母粉1g，硝酸钠1g，亚硫酸钠1g，氯化钠0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸亚铁0.1g；
步骤2）制备藻液：将步骤1）的种子液按照6%的接种量接种到TAP培养液中进行培养，控制光照强度为150μmol·m-2·s-1的，光暗比为12h:12h，温度为26℃, pH为8，培养4d，得到藻液；
步骤3）制备复合菌液：将屎肠球菌和沼泽红假单胞菌分别按照常规培养获得1×108CFU/ml的种子液，然后按照2:3的体积比混合得到混合种子液，再按照8%的接种量转到发酵培养基中，30℃培养12h，得到复合菌液；所述发酵培养基的配方按质量百分比为：糖蜜3%、玉米浆2.5％、豆粕2％、K2HPO4 0.1％、KH2PO4 0.1％、CaCO3 0.01％、FeSO4 0.005％、MnSO4 0.005％，余量为水，pH7.0；
步骤4）制备改良TAP培养液：往TAP培养液中添加亚油酸甘油酯，控制亚油酸甘油酯的浓度为1mg/L，得到改良TAP培养液；
步骤5）制备复合生物制剂：将藻液、复合菌液以及改良TAP培养液按照5:0.5:100的体积比混匀，即得。
利用上述复合生物制剂制备氢气的条件为：往反应器中通入N2保持厌氧环境，然后将复合生物制剂置于反应器中，培养48h，培养条件为：光照强度为150μmol·m-2·s-1，温度为26℃,光暗比为12h:12h。
实施例2
一种产氢复合生物制剂，其包括蛋白核小球藻、屎肠球菌以及沼泽红假单胞菌。
具体地，所述复合生物制剂按照如下步骤制备而得：
步骤1）制备种子液：挑取蛋白核小球藻到盛有1L增殖培养基的培养瓶中，光照度150μmol·m-2·s-1，26℃培养，每天摇动三角瓶2-3次；培养3d得到处于对数生长期的种子液；所述增殖培养基每升含下述组分：葡萄糖3g，酵母粉1g，硝酸钠1g，亚硫酸钠1g，氯化钠0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸亚铁0.1g；
步骤2）制备藻液：将步骤1）的种子液按照8%的接种量接种到TAP培养液中进行培养，控制光照强度为150μmol·m-2·s-1的，光暗比为12h:12h，温度为26℃, pH为8，培养4d，得到藻液；
步骤3）制备复合菌液：将屎肠球菌和沼泽红假单胞菌分别按照常规培养获得1×108CFU/ml的种子液，然后按照2:3的体积比混合得到混合种子液，再按照8%的接种量转到发酵培养基中，30℃培养12h，得到复合菌液；所述发酵培养基的配方按质量百分比为：糖蜜3%、玉米浆2.5％、豆粕2％、K2HPO4 0.1％、KH2PO4 0.1％、CaCO3 0.01％、FeSO4 0.005％、MnSO4 0.005％，余量为水，pH7.0；
步骤4）制备改良TAP培养液：往TAP培养液中添加亚油酸甘油酯，控制亚油酸甘油酯的浓度为1.5mg/L，得到改良TAP培养液；
步骤5）制备复合生物制剂：将藻液、复合菌液以及改良TAP培养液按照12:1:200的体积比混匀，即得。
利用上述复合生物制剂制备氢气的条件为：往反应器中通入N2保持厌氧环境，然后将复合生物制剂置于反应器中，培养48h，培养条件为：光照强度为150μmol·m-2·s-1，温度为26℃,光暗比为12h:12h。
实施例3
本发明复合生物制剂产氢性能测试：
设定反应器总体积为10L，其中，液体体积为8L，液体上方空间为2L，反应过程中产生的气体量由气体组成乘以气体的体积得到，对反应器内部的气相产物进行气相色谱法测定；
以实施例1为例，同时设置对照组，其中，对照组1：仅采用屎肠球菌，不添加沼泽红假单胞菌，其余同实施例1；对照组2：仅采用沼泽红假单胞菌，不添加屎肠球菌，其余同实施例1；对照组3：不添加复合菌液，其余同实施例1；
分别检测了实施例1、对比例1-2的产氢量、氢气含量；还通过分光光度法检测了培养液中藻细胞的浓度。
如图1所示所示，实施例1、对照组1-2的产氢量明显高于不添加复合菌液的对照组3，实施例1的产氢量高于采用单一菌株的对照组1和对照组2；实施例1的氧气产量维持在适当的低水平，有利于保持产氢酶活性。如图2所示，实施例1、对照组1-2的藻生物量明显高于不添加复合菌液的对照组3，实施例1的藻生物量高于采用单一菌株的对照组1和对照组2。因为屎肠球菌属于厌氧菌，可以发酵产生甲酸盐，乙酸盐，有机酸等有机物，而且发酵过程中只会产生氢气和二氧化碳；而沼泽红假单胞菌可以以上述物质为底物，产氢效果好；混合菌液在厌氧光照条件下生长迅速，在好氧条件下也能够生长，有效利用了藻类产生的氧气，使得氧气含量降低最低，从而达到较好的产氢能力；屎肠球菌和沼泽红假单胞菌两种菌株协同发酵产生的复合菌液，能够有效促进藻类产氢；菌液产生的二氧化碳能够满足藻细胞快速生长所需，进而提高藻的生物量。
实施例4
亚油酸甘油酯对蛋白核小球藻产氢量的影响：
以实施例2的技术方案为研究例，分别设置浓度为0mg/L，0.5 mg/L，1mg/L，1.5mg/L，2 mg/L，2.5 mg/L。如图3所示，亚油酸甘油酯可以调节蛋白核小球藻的产氢量；通过多浓度梯度试验发现，1-1.5mg/L的添加量对能够明显提高藻细胞的产氢量，提高添加量反而会对产氢产生负面效应，因此将甘油酸甘油酯控制在合理浓度尤为重要。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。