融合蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药领域，特别涉及融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

肝纤维化是肝脏遭受多种损伤后的病理性修复反应，是大多数慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段，其特点是肌成纤维细胞样(MF)细胞在肝组织内异常扩增和细胞外基质蛋白(ECM)过度沉积。肝星状细胞(HSCs)与肝纤维化密切相关。当肝脏受损伤时，静息态的HSC被激活成为快速增殖的MF表型细胞。这些扩增的MF-HSCs合成大量ECM蛋白(尤其是Ⅰ型胶原蛋白)并分泌基质金属蛋白酶抑制蛋白，引起ECM的重构和沉积，最终导致纤维化的发生。因此，MF-HSCs已成为治疗肝纤维化的重要靶标，已经先后有紫杉醇和苦参碱类等化合物用于抑制其增殖和细胞外基质ECM的沉积。

作为一种抗增殖细胞因子，干扰素γ(IFNγ)可显著抑制成纤维细胞的增殖和降低胶原蛋白的产生，表现出良好的抗肝纤维化活性。其灵敏度高、作用效果好，在抑制肝纤维化中的作用受到越来越广泛的关注。然而IFNγ的半衰期段过短、缺乏靶向性作用，在系统性使用时常常产生严重的副作用，极大限制了其在肝纤维化治疗上的临床应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种融合蛋白及其制备方法和应用。该蛋白的ECM(尤其包括胶原蛋白)高亲和性由PlGF-2123-144结构域介导。其N-端连有GST蛋白以便纯化，C-端接有BiPPB(bicyclic PDGFβR-bindingpeptide)肽段用于对活化肝星状细胞表面PDGFβ受体的特异性识别。IFNγ的作用活性微区(mimIFNγ)则位于整个融合蛋白分子的C-端。经原核细胞表达和亲和纯化后，改造的IFNγ融合蛋白在ELISA检测中显示出对Ⅰ型胶原蛋白的高亲和性、显著抑制MF-HSC细胞中MF表型分子标记基因的表达、并明显降低细胞中Ⅰ型胶原蛋白的产生。本发明蛋白特异性强、分子量小、易于制备，特别是具备对纤维化肝脏和活化肝星状细胞的双重靶向性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种融合蛋白，包括短肽和识别肽；

所述短肽为人胎盘生长因子2中第123～144位氨基酸；

所述识别肽为双环β血小板衍生生长因子受体识别肽。

本发明还提供了一种融合蛋白，包括短肽、识别肽和IFNγ胞内信号传导结构域；

所述短肽为人胎盘生长因子2中第123～144位氨基酸；

所述识别肽为双环β血小板衍生生长因子受体识别肽。

在本发明的一些具体实施方案中，所述融合蛋白还包括GST蛋白。

本发明公开了一种可在纤维化肝脏中进行富集、并特异靶向肌成纤维细胞样肝星状细胞(MF-HSCs)的IFNγ(Interferongamma)作用活性的融合蛋白分子。所述蛋白的ECM(尤其包括胶原蛋白)高亲和性由PlGF-2123-144结构域介导。其N-端连有GST蛋白以便纯化，C-端接有BiPPB(bicyclic PDGFβR-binding peptide)肽段用于对活化肝星状细胞表面PDGFβ受体的特异性识别。IFNγ的作用活性微区(mimIFNγ)则位于整个融合蛋白分子的C-端。经原核细胞表达和亲和纯化后，改造的IFNγ融合蛋白在ELISA检测中显示出对Ⅰ型胶原蛋白的高亲和性、显著抑制MF-HSC细胞中MF表型分子标记基因的表达、并明显降低细胞中Ⅰ型胶原蛋白的产生。本发明蛋白特异性强、分子量小、易于制备，特别是具备对纤维化肝脏和活化肝星状细胞的双重靶向性，在包括肝纤维化在内的各类纤维化疾病的治疗中具有良好的应用前景。

在本发明的一些具体实施方案中，所述具有如下所示的氨基酸序列中的任意一项：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

Ⅱ、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；

III、与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述缺失为缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。

所述添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。

本发明还提供了所述的融合蛋白在制备肝星状细胞活化的抑制剂和/或Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制剂中的应用。

本发明还提供了所述的融合蛋白在制备预防和/治疗纤维化疾病的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述纤维化疾病为肝纤维化。

本发明还提供了所述的融合蛋白在制备预防和/治疗肝硬化或肝癌的药物中的应用。

本发明还提供了一种编码所述融合蛋白的DNA分子，包括编码所述短肽的第二区核苷酸、编码所述识别肽的第三区核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述DNA分子还包括编码所述IFNγ胞内信号传导结构域的第四区核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述DNA分子还包括编码GST蛋白的第一区核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述DNA分子在所述第二区核苷酸和所述第三区核苷酸之间还包括6个甘氨酸的连接子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述DNA分子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；

Ⅱ、具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述缺失为缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸。

本发明还提供了一种重组载体，其含有本发明所述的DNA分子。

本发明还提供了一种融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

获得所述的DNA分子；

取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；

取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；

诱导所述转化体表达蛋白，分离纯化。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为原核系统宿主细胞或真核宿主细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述原核系统宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了一种预防和/或治疗纤维化的药物，包括本发明所述融合蛋白和药学上可接受的辅料。

作为优选，本发明提供的药物的剂型可以为凝胶剂、粉针剂、气雾剂、喷剂、擦剂、膜剂、贴剂、膏剂、软膏剂、橡胶膏剂、水剂、汤剂、冲剂、片剂、丸剂、缓释剂、控释剂、粉剂、糊剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、离子透入剂、滴眼剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、栓剂、气雾剂、吸入剂、烟剂、口服液、口服片、注射液、糖浆剂、煎膏剂、酒剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、灌肠剂或栓剂。本领域可接受的剂型均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

本发明提供了一种以高亲和结合ECM蛋白的人胎盘生长因子2中氨基酸123-144短肽(PlGF-2123-144)、双环β血小板衍生生长因子受体识别肽BiPPB和IFNγ胞内信号传导结构域(mimIFNγ)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白。改造后的IFNγ融合蛋白一方面通过PlGF-2123-144肽段和ECM尤其是胶原蛋白的高亲和结合性，提高了自身在纤维化肝脏的滞留并延长了其作用时间；另一方面则经BiPPB对肝星状细胞表面高表达的PDGFβ受体进行特异性识别和结合，使其获得了针对MF-HSCs的靶向性，从而有效改善了IFNγ的治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示质粒构建设计图；

图2示pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB质粒菌落PCR鉴定结果；

图3示pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ质粒(1-33)和pGEX4T1-BiPPB-mimIFNγ质粒(1'-3')菌落PCR鉴定结果；

图4示GST、GST-PlGF-2123-144-BiPPB、GST-BiPPB-mimIFNγ和GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ蛋白在大肠杆菌中诱导表达的SDS-PAGE分析及GST标签的Western Blot分析；图4(A)为GST蛋白诱导条件摸索结果，图4(B)为GST-PlGF-2123-144-BiPPB蛋白诱导条件摸索结果，图4(C)为GST-BiPPB-mimIFNγ蛋白诱导条件摸索结果，图4(D)为GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ蛋白诱导条件摸索结果；

图5示纯化的GST、GST-PlGF-2123-144-BiPPB、GST-BiPPB-mimIFNγ和GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ的SDS-PAGE分析及GST标签的Western Blot分析；其中图5(A)为GST蛋白纯化结果，图5(B)为GST-PlGF-2123-144-BiPPB蛋白纯化结果，图5(C)为GST-BiPPB-mimIFNγ蛋白纯化结果，图5(D)为GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ蛋白纯化结果；

图6示GST-PlGF-2123-144-BiPPB对Ⅰ型胶原蛋白亲和性ELISA分析；图6(A)为操作流程图，图6(B)为ELISA结果；

图7示GST-BiPPB-mimIFNγ处理细胞后的基因水平分析；

图8示GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ处理细胞的结果；图8(A)示Western Blot结果定量分析；图8(B)示Ⅰ型胶原蛋白水平分析。

具体实施方式

本发明公开了一种融合蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种以高亲和结合ECM蛋白的人胎盘生长因子2中氨基酸123-144短肽(PlGF-2123-144)、双环β血小板衍生生长因子受体识别肽BiPPB和IFNγ胞内信号传导结构域(mimIFNγ)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白。改造后的IFNγ融合蛋白一方面通过PlGF-2123-144肽段和ECM尤其是胶原蛋白的高亲和结合性，提高了自身在纤维化肝脏的滞留并延长了其作用时间；另一方面则经BiPPB对肝星状细胞表面高表达的PDGFβ受体进行特异性识别和结合，使其获得了针对MF-HSCs的靶向性，从而有效改善了IFNγ的治疗效果。

本发明的另一目的是提供编码本发明改造IFNγ融合蛋白的DNA序列。包括GST标签蛋白的第一区、PlGF-2123-144第二区、BiPPB第三区和mimIFNγ第四区。其中第二区与第三区中间设计了6个甘氨酸作为连接子，维持融合蛋白各功能部分的生物活性。

在基因工程菌的构建过程中，首先需要获得并扩增表达融合蛋白的基因，本发明采用的是PCR法。在大量获得表达融合蛋白的基因后需使用合适的载体将表达的基因转入所选载体中从而构建重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供携带编码本发明融合蛋白的DNA序列的表达质粒。本发明的重组表达载体为pGEX-4T-1质粒。

本发明的另一个目的是提供表达本发明融合蛋白编码基因的宿主。本发明选用的表达宿主为工程菌BL21。

本发明提供的技术方案是：制备一种带有GST蛋白、高亲性结合ECM的PlGF-2123-144结构域和特异性识别PDGFβ受体的BiPPB短肽及mimIFNγ融合蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在本发明的融合蛋白中，本发明去除了IFNγ的信号肽部分和同IFNγ受体结合的部分。

本发明还提供了编码上述融合蛋白的DNA分子。所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明所述蛋白可用于制备包括肝纤维化在内的各类纤维化疾病的抗纤维化生物药物。

本发明所用的转化方法为热激转化法，通过抗性标志筛选出阳性菌落，然后再通过菌液PCR的方法，鉴定成功转化的阳性菌落。通过测序和序列对比，确定携带氨基酸编码序列正确的融合蛋白表达质粒的阳性细菌，进行表达。

在本发明的融合蛋白中，本发明采用了异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂进行所述蛋白的诱导表达，同时还表达了GST、GST-PlGF-2123-144-BiPPB、GST-BiPPB-mimIFNγ蛋白。在进行蛋白的诱导表达中，本发明对不同条件进行了摸索，找到了每种蛋白在上清中表达量最高的条件并进行了大量表达。

本发明的融合蛋白，带有GST标签蛋白，分离纯化时本发明借助交联有谷胱甘肽配体的琼脂糖，捕捉与配体结合的目的GST融合蛋白；随后加入还原型谷胱甘肽对目的融合蛋白进行洗脱，完成目的蛋白的分离纯化。

本发明首次尝试将介导PlGF-2与ECM(其包括胶原蛋白)高亲和性结合的结构域应用于抗肝纤维化药物的研发。测试显示融合PlGF-2123-144肽段的蛋白保留了对Ⅰ型胶原蛋白的高亲和性；而GST-BiPPB-mimIFNγ融合蛋白则能显著抑制HSCs中包括Ⅰ型胶原蛋白(Col 1a1)、α平滑肌肌动蛋白(α-Sma)、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(Timp 1)、波形蛋白(Vim)的MF表型典型分子标记基因的表达。更进一步，所制备的GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ融合蛋白可显著降低MF-HSCs中Ⅰ型胶原蛋白的产生。因此，改造后的IFNγ融合蛋白兼具同Ⅰ型胶原蛋白高亲和性结合的能力和对活化肝星状细胞的特异靶向性。可有效降低IFNγ用药量，在维持IFNγ抗纤维化活性的同时，避免其毒副作用。

本发明利用分子生物学的方法，将胎盘生长因子-2(PlGF-2)的氨基酸123至144肽段(PlGF-2123-144)、可与PDGF受体结合的多肽(BiPPB)及IFNγ的作用活性微区(mimIFNγ)一起构建成一个新的人工基因，并连接到可表达融合蛋白的原核载体上，在大肠杆菌中诱导表达和纯化出蛋白质分子GST、GST-PlGF-2123-144-BiPPB、GST-BiPPB-mimIFNγ和GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ。通过实验测试，融合蛋白具有对Ⅰ型胶原蛋白高亲和的活性和显著抑制T6细胞中Ⅰ型胶原蛋白及MF表型分子标记基因的表达。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的融合蛋白对细胞外基质(ECM)蛋白有高亲和结合能力，可在纤维化肝脏中进行富集，而提高蛋白的有效浓度；BiPPB可特异性识别活化肝星状细胞表面PDGFβ的受体、介导融合蛋白对活化HSCs的靶向性，降低IFNγ对肝脏的毒副作用。

(2)本发明的融合蛋白特异性强、分子量小、易于制备，特别是具备对纤维化肝脏和活化肝星状细胞的双重靶向性，在包括肝纤维化在内的各类纤维化疾病的治疗中具有良好的前景。

本发明提供的融合蛋白及其制备方法和应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB质粒构建,目的片段插入到表达载体pGEX-4T-1的EcoRI和XhoI两个酶切位点之间。采用T4连接酶进行连接反应

(1)所需PlGF-2123-144-BiPPB片段由生工公司合成，插入pUC57载体中。

(2)设计PCR扩增的引物(见表4)。

(3)含有目的片段的质粒进行PCR，PCR试剂盒(NEB)，片段反应体系：50μl体系，ddH2O 33μl；5×Q5 buffer 10μl；10mMdN TP 1μl；Primer(F+R)5μl(引物编号1和2),Q5酶0.5μl；模板0.5μl。PCR反应参数：98℃ 30s；98℃ 8s；55℃ 18s，35个循环。72℃ 2min。PCR克隆PCR完成后，取2μl PCR产物,进行2％琼脂糖凝胶电泳、检测扩增情形。

(4)电泳确定条带大小正确后，进行沉淀回收，操作如下：50μl产物；+125μl无水乙醇；+10μl(3M pH5.2)乙酸钠。混合均匀后，-80℃过夜。12,000g×15min。弃上清，加入1ml 75％乙醇，震荡混匀，12,000g×10min离心，弃上清，室温晾干，加入60μl ddH2O重新溶解DNA，后用紫外分光光度仪测出DNA浓度。

(5)参照质粒提取说明书(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)制备pGEX-4T-1，使用EcoRI(NEB)和XhoI(NEB)进行酶切制备线性化载体。使用EcoRI和XhoI对以上回收的PCR片段进行酶切制备PlGF-2123-144-BiPPB DNA嵌入片段。

(6)酶切完成后，进行胶回收。质粒酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下回收酶切载体，用试剂盒进行胶回收。PlGF-2123-144-BiPPB片段酶切后进行PAGE电泳，电泳结束后进行EB染色10min，在紫外灯下按片段大小回收目的片段。转移到小管中，加入2倍凝胶体积的溶解溶液(3.85g乙酸铵，0.215g乙酸镁，0.2ml 0.5M EDTA(pH＝8.0)，1.0ml10％SDS，定容至100ml)，37℃孵育3h。12,000g×1min离心，转移上清至新的EP管中。沉淀中加入0.5倍体积的溶液涡旋振荡，12,000g×1min离心。上清合并，向新的EP管中加入2倍体积的乙醇-80℃6h。12,000g×10min，倒掉上清。用200μlTE溶液重新溶解，加入25μl3M乙酸钠溶液，混合均匀。加入两倍体积的乙醇-80℃过夜。12,000g×10min离心，倒掉上清。70％乙醇重新洗一次，12,000g×4min离心，沉淀用20μl ddH2O重新溶解。

(7)酶切产物连接，连接试剂盒(NEB)。连接体系：10×T4buffer 1μl；线性载体2μl；插入片段4μl；T4DNA连接酶0.5μl；ddH2O 2.5μl，4℃过夜。后将连接产物进行转化，取7μl的连接产物与50μl DH5α感受态细菌(北京擎科新业生物技术有限公司)混合，冰上放置30min，42℃水浴70s，冰上放置1min。加入100μlSOC培养基。37℃在摇床上300rpm培养30min。取50μl培养后的菌液滴在Amp+的固体LB培养基上，涂布均匀，37℃恒温培养过夜。

(8)转化结果的鉴定：将转化后长出的菌落用无菌小枪头挑起放入加有一定量Amp⁺培养基中，37℃振摇过夜，取部分进行菌落PCR，PCR体系：10μl体系，ddH2O 4.9μl；5×Q5buffer 2μl；10mM dNTP 1μl；Primer(F+R)1μl(引物编号2和3),Q5酶0.1μl；模板1μl。PCR反应参数：98℃ 30s；98℃ 8s；55℃ 18s，35个循环。72℃ 2min。PCR结束后，2％琼脂糖凝胶检验。取部分阳性菌液送公司进行测序，剩下菌液进行质粒小提制备。测序结果确定正确质粒，构建完成。

图2为pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB质粒菌落PCR鉴定结果。其中M条电泳带代表的是Themo100bp marker，阴性对照是菌落PCR未加菌液对照，1泳带代表阳性结果。

实施例2：pGEX4T1-BiPPB-mimIFNγ

pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ质粒构建，参照图1。

(1)pGEX4T1-mimIFNγ质粒实验室已有。

(2)设计PCR扩增的引物(见表4)。

(3)含有目的片段的质粒进行PCR，分别以pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB、pGEX4T1-mimIFNγ为模版进行目的片段的PCR扩增，PlGF-2123-144-BiPPB片段扩增引物编号为1和6，BiPPB片段扩增引物编号为5和6，pGEX4T1-mimIFNγ引物编号为7和8。片段反应体系：50μl体系，ddH2O 33μl；5×Q5 buffer 10μl；10mM dNTP 1μl；Primer(F+R)5μl,Q5酶0.5μl；模板0.5μl。PCR反应参数：98℃ 30s；98℃ 8s；55℃ 18s，35个循环。72℃ 2min。克隆PCR完成后，取2μlPCR产物，进行2％的琼脂糖凝胶电泳检测、检测扩增情形。

(4)电泳确定条带大小正确后，进行沉淀回收，操作同上。

(5)BiPPB、PlGF-2123-144-BiPPBPCR片段使用EcoRI和NotI(NEB)进行酶切。mimIFNγPCR片段使用NotI和XohI进行酶切。

(6)酶切完成后，进行胶回收，PAGE胶回收步骤同上。

(7)酶切产物连接，连接体系同上，酶切载体使用上述制备载体。转化操作同上。

(8)转化结果的鉴定，具体步骤同上，测序引物(见表4)：引物编号3和4。测序证明成功构建质粒。

图3为pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ和pGEX4T1-BiPPB-mimIFNγ质粒菌落PCR鉴定结果。跑2％的琼脂糖凝胶，其中M条电泳带代表的是Invitrogen 100bp marker；1-3泳带代表pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ阳性结果；1'-3'泳带代表pGEX4T1-BiPPB-mimIFNγ阳性结果。

实施例3：GST、GST-PlGF-2123-144-BiPPB、GST-BiPPB-mimIFNγ和GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ表达质粒在大肠杆菌中诱导表达的SDS-PAGE分析及GST标签的Western Blot分析

所有的融合蛋白均在裂解后的上清中可用，下面主要以GST-PlGF-2123-144-BiPPB表达质粒的诱导表达为例来进行说明。

先将已构建好的pGEX4T1、pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB、pGEX4T1-BiPPB-mimIFNγ和pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ质粒分别转化BL21感受态(北京擎科新业生物技术有限公司)，之后挑取单个菌落摇菌，将含有正确质粒BL21菌种保存，同时进行诱导表达。

1、IPTG诱导浓度的摸索

(1)挑pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ转化克隆，在4ml的LB 37℃，250rpm震摇过夜，将含有正确质粒BL21进行菌种保存。

(2)3支50ml离心管分别加入5ml含有Amp+的2X YT培养基，按1:1000加入振摇过夜的pGEX4T1-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ菌液，摇菌至OD550＝0.8。

(3)菌液中分别加入IPTG分别至终浓度0.1mM、0.5mM、1.0mM，30℃，250rpm，震摇6h。取5ml菌液，12,000g×2min离心，用1ml GST裂解缓冲液(150mM NaCl2，20mM HEPES pH7.5，5mM MgCl2，1％Triton-X 100，10ml工作液使用时加入10μl蛋白酶抑制剂及DTT使其终浓度为1mM)，重悬细菌沉淀，冰上超声裂解20s，间隔10s，共超声10min。

(4)4℃ 12000rmp,离心2min，将上清转入新的EP管中，取25μl加入蛋白上样缓冲液，用GST裂解缓冲液补足至40μl(其余溶液-80℃保存)。

(5)取部分裂解液进行SDS-PAGE蛋白电泳和GST标签蛋白的Western Blot检测。

2、IPTG诱导时间的摸索

具体操作如上，只是在OD550＝0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM，26℃，250rpm。分别于1h、2h和3h取菌液100μl,加25μl GST裂解缓冲液重悬，冰上超声裂解20s，间隔10s，超声3min。其余操作均与IPTG诱导浓度的摸索相同。

GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ蛋白的最适诱导表达条件为IPTG至终浓度0.5mM，26℃，1h。GST和GST-PlGF-2123-144-BiPPB最适诱导表达条件为IPTG至终浓度1mM，30℃，6h。GST-BiPPB-mimIFNγ最适诱导表达条件为IPTG至终浓度0.1mM，26℃，2h。如图4。

实施例4：融合蛋白的纯化

下面主要以GST-PlGF-2123-144-BiPPB的纯化为例来进行说明。纯化条件皆为室温进行。

(1)温和震摇Glutathione Sepharose 4B(GE HealthcareLife Sciences)的瓶子使其混匀，取200μl溶液至干净的EP管中。

(2)500g×5min离心，小心轻轻倒掉上清。

(3)用相当于1mlPBS洗涤沉淀，颠倒混匀，500g×5min离心。此步骤重复2次。

(4)按如上条件诱导表达的20ml菌液，12,000g×10min离心，重悬于1ml PBS中，加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶裂解细菌，12,000g×10min离心，上清转移至新的EP管中。菌裂解液加入到准备好的Glutathione Sepharose 4B中室温孵育30min。

(5)500g×5min离心，小心轻轻倒掉上清，保存上清后进行PAGE-SDS胶及Western Blot检测。

(6)加入1mlPBS洗涤沉淀，500g×5min离心，小心轻轻倒掉上清，保存上清后进行PAGE-SDS胶检测及Western Blot检测。此步骤重复3次。

(7)加入100μl洗脱溶液洗脱蛋白，室温孵育10min。500g×5min离心，将上清转移至新的EP管中，保存上清后进行PAGE-SDS胶检测及Western Blot检测。此步骤重复3次。

GST、GST-PlGF-2123-144-BiPPB、GST-BiPPB-mimIFNγ和GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ的SDS-PAGE分析及GST标签抗性的Western Blot分析如图5所示。

实施例5：GST-PlGF-2123-144-BiPPB对Ⅰ型胶原蛋白亲和性的ELISA检测

ELISA实验流程简图如图6(A)所示，具体步骤如下：

1、Collagen Ⅰ结合液的制备

(1)将储存液0.1％(w/v)用0.1M的乙酸稀释10倍，制成0.01％的蛋白溶液。

(2)在玻璃瓶中小心加入相当于蛋白溶液10％的氯仿，不要摇晃或振动，在4℃冰箱放置过夜，收集上层含有蛋白的溶液。

2、ELISA实验

(1)ELISA板(Thermo)用100μl/孔CollagenⅠ(SIGMA)结合液覆盖，4℃过夜，吸去上清，过夜干燥。

(2)每孔加入200μl2％脱脂牛奶的PBS-T 37℃封闭2h。PBS-T溶液：PBS+0.05％Tween-20。

(3)吸去溶液，每孔用PBS-T漂洗3遍。

(4)在PBS-T+0.1％脱脂牛奶的溶液中分别加入GST和GST-PlGF-2123-144-BiPPB蛋白，使GST蛋白终浓度为0.5μmol、GST-PlGF-2123-144-BiPPB蛋白终浓度为0.5μmol、1μmol、2μmol和4μmol，每孔100μl 37℃孵育2h。

(5)PBS-T漂洗3次,每次200μl。

(6)每孔加入200μl的2％奶粉(PBS-T)于37℃封闭45min。

(7)每孔用PBS-T 200μl漂洗1遍。

(8)加入100μl稀释好的抗GST一抗(Affinity)1:5000(2％奶粉(PBS-T)),4℃孵育过夜。

(9)PBS-T 200μl漂洗3次,每次3min。

(10)加入100μl稀释好的二抗(Thermo Scientific)(1:2000WB，2％(5％)奶粉(PBS-T))，室温1h。

(11)PBS-T 200μl漂洗3次,每次3min。

(12)0.3％的H2O2甲醇溶液100μl封闭15min。

(13)每孔加入底物显色液A，显色液B,各50μL(A和B液先混合再加入孔中)，轻轻混匀，在37℃下温育30分钟。

每孔加入100μl2M H2SO4终止显色，450nm波长处测定各孔溶液的OD值。

实验数据均以平均值±标准差形式表示，每组实验设置2个平行，数据处理采用Graph Prism 5软件处理t检验分析,以P<0.05显示有统计学意义。

图6(B)右侧示ELISA结果，为不同浓度梯度GST蛋白对Ⅰ型胶原蛋白亲和性的ELISA检测，操作方法同上。结果见表1。

表1

ELISA检测结果如图6(B)左侧所示，结果显示GST-PlGF-2123-144-BiPPB对Ⅰ型胶原蛋白表现出高度的亲和性。结果见表2。

表2

实施例6：GST-BiPPB-mimIFNγ处理T6细胞和RNA表达水平分析

(1)取T6细胞1.6×10⁵/孔，接于12孔板，过夜培养，第二天换0.5％FBS的培养基继续培养培养24h。

(2)空白孔加入同体积的含0.5％FBS的培养基，处理组分别加入终浓度为20nmol的GST-BiPPB-mimIFNγ、5ng/ml的TGFβ(PEPROTECH)、终浓度为5ng/ml的TGFβ+终浓度为20nmol的GST-BiPPB-mimIFNγ和终浓度为5ng/ml的TGFβ+终浓度为40nmol的GST-BiPPB-mimIFNγ，继续培养处24h。

(3)Trizol法(Sigma)提取总RNA，用紫外分光光度仪定量RNA。

(4)进行RT，实验步骤参考(Thermo Scientific RT试剂说明书)。

(5)采用SYBR green绿色荧光试剂盒进行qPCR反应，实验步骤参考(Life-ABISYBR green试剂盒说明书)。以S9基因为内对照，采用ΔCt计算方法对各基因mRNA进行定量分析。

实验结果如图7所示，融合蛋白GST-BiPPB-mimIFNγ能显著抑制编码Ⅰ型胶原蛋白(Col 1a1)、α平滑肌肌动蛋白(α-Sma)、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(Timp 1)和波形蛋白(Vim)的基因表达。结果如表3所示。

表3

实施例7：GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ处理T6细胞和Western Blot分析

(1)取T6细胞按照3.5×10⁵/孔，接于6孔板，培养过夜，第二天换0.5％FBS的培养基继续培养24h。

(2)空白孔加入同体积的含0.5％FBS的培养基，处理组分别加入终浓度为10ng/ml的TGFβ、终浓度为10ng/ml的TGFβ+终浓度为10nmol的GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ和终浓度为10ng/ml的TGFβ+终浓度为20nmol的GST-PlGF-2123-144BiPPB-mimIFNγ,继续培养处理48h。

(3)以RIPA溶液裂解细胞，后用研磨铲将细胞刮下来，溶液转移至EP管中，-80℃放置6h，取出放置冰上溶解，超声5s共3次，4℃、12,000g×10min离心,取上清转移至新的EP管中。

(4)BCA定量后，根据蛋白浓度进行SDS-PAGE蛋白电泳和Western Blot分析，检测Ⅰ型胶原蛋白和β-Actin蛋白水平，并通过光密扫描分子对胶原蛋白进行定量分析。

实验结果如附图8所示，图8(A)为Western Blot检测结果，图8(B)为Ⅰ型胶原蛋白的光密度分析。结果显示GST-PlGF-2123-144-BiPPB-mimIFNγ显著抑制Ⅰ型胶原蛋白的产生。

表4

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南华大学

<120> MP1801240

<130> 融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atgcagaatt ccgtcgtcgt 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

acgtactcga ggcagtcgat caggt 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gggctggcaa gccacgtttg gtg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccgggagctg catgtgtcag agg 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

atgcagaatt ctgctctcgt aa 22

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

acgtagcggc cgcgcagtcg atcaggtt 28

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

atgcagcggc cgcagccaag tttgaggtca acaac 35

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

acgtactcga gtcgactcct tttccgcttc ctg 33

<210> 9

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly

35 40 45

Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu

50 55 60

Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met

65 70 75 80

Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly

85 90 95

Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys

100 105 110

Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met

115 120 125

Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly

130 135 140

Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val

145 150 155 160

Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val

165 170 175

Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu

180 185 190

Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr

195 200 205

Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly

210 215 220

Ser Pro Glu Phe Arg Arg Arg Pro Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg

225 230 235 240

Glu Lys Gln Arg Pro Thr Asp Cys His Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala

245 250 255

Cys Ser Arg Asn Leu Ile Asp Cys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Gly Cys

260 265 270

Ser Arg Asn Leu Ile Asp Cys Ala Ala Ala Ala Lys Phe Glu Val Asn

275 280 285

Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val

290 295 300

His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg

305 310 315 320

Leu Glu Arg Pro His Arg Asp

325

<210> 10

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ctggttccgc gtggatcccc ggaattccgt cgtcgtccga aaggtcgtgg taaacgtcgt 720

cgtgaaaaac agcgtccgac cgactgccac ctggctgctg ctgctgctgc ttgctctcgt 780

aacctgatcg actgcaaagg atccggttct ggtggttgct ctcgtaacct gatcgactgc 840

gcggccgcag ccaagtttga ggtcaacaac ccacaggtcc agcgccaagc attcaatgag 900

ctcatccgag tggtccacca gctgttgccg gaatccagcc tcaggaagcg gaaaaggagt 960

cgactcgagc ggccgcatcg tgactga 987