本发明涉及生物提取技术领域，特别涉及从脱脂蛋白乳上清液中提取多肽的方法。
背景技术：
分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的肽，是具有蛋白质的结构与功能的片段，具有数以千万计的生理功能的蛋白质通过肽来实现的。肽具有如此纷繁复杂的结构与功能由构成肽的氨基酸种类、不同的数目与排列顺序所决定。二肽和三肽是由2个或3个氨基酸脱水缩合而成的，四肽、五肽可以此类推。一般说来，寡肽是肽链上有10个以内氨基酸数目的，多肽就是10-50个氨基酸数目的，蛋白质是50个以上氨基酸数目的。小肽或低聚肽也就是寡肽中的二、三肽。多肽是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。两个氨基酸分子脱水缩合可形成二肽，多个氨基酸分子脱水缩合可形成三肽、四肽、五肽等。通常由10～50个氨基酸分子脱水缩合形成的化合物叫多肽，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。
按照不同的来源可以分为机体内存在的天然的内源性多肽和存在于动植物、微生物体内以及蛋白质降解后的外源性多肽。体内一些重要分泌腺分泌的肽类激素主要是内源性多肽。直接或间接来源于动物食物蛋白质的是外源性多肽，如动物乳汁。虽然国内外对植物蛋白活性肽的研究已经达到一定水平，且相关产品已应用于医疗保健，但主要为大豆活性肽产品，对于其他植物的活性肽研究才刚刚起步，相关产品甚少，无法满足食品工业需求。国内酶法多肽成熟工艺所使用的原料是蛋白含量为90%的大豆分离蛋白。大豆分离蛋白在生产过程中会产生严重的环境污染等问题，不符合我国可持续发展战略，将逐步被淘汰。其余酶解多肽大多利用饲料蛋白作为原料，通过碱溶酸沉提取蛋白质后，再利用蛋白酶来酶解制成多肽粉。这种方法有提取过程复杂，废弃物太多，蛋白提取困难等诸多问题。
现有技术如授权公告号为CN103740796B的中国发明专利，公开了一种从脱脂蛋白乳上清液中提取多肽的方法，包括如下步骤：1）将含脂植物热磨制浆、离心，得到轻相液为植物油脂，重相液为脱脂蛋白乳；2）调节其pH=4.0～5.0，再在所述脱脂蛋白乳的等电点下进行沉淀，得到脱脂乳上清液和蛋白浓浆；3）收集所述脱脂乳上清液，并调节其pH=8.2～8.9，加入胰蛋白酶酶解3.5～6h，得到酶解液；4）将所述酶解液灭酶得到无酶液；5）向所述无酶液中加入活性炭，再利用离心机除去活性炭，得到上清液；6）将所述上清液浓缩、喷雾干燥，即得所述多肽粉。该方法减少了蛋白质的提取步骤，工艺流程短、操作简单，加工成本低，适于工业化生产。但是该制备方法用活性炭进行脱苦脱色，能够吸附多肽，降低多肽的得率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的多肽生物活性高、无苦味，提取成本低的从乳制品中提取低分子肽的方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
本发明所用微生物及其购买企业为：徐州赛傅生物科技有限公司。
从脱脂蛋白乳上清液中提取多肽的方法，包括脱脂蛋白乳制备、脱脂乳上清液制备、发酵、分离，其具体步骤为：
脱脂蛋白乳制备：按料液比为1:3-5（g/mL）向含脂植物中加水，在45-55℃下磨制浆至细度为0.2-1μm，然后置于转速为4000-6000r/min的离心机中离心25-35min，得到轻相液为植物油脂，重相液为脱脂蛋白乳，备用，该步骤能有效除去含脂植物中的油脂，避免油脂的氧化引起的部分蛋白质变性，提高蛋白乳中蛋白质的含量；
脱脂乳上清液制备：调节脱脂蛋白乳的pH至4.0-5.0，在脱脂蛋白乳的等电点下进行沉淀，得到脱脂乳上清液和蛋白浓浆，两者分离后将脱脂乳上清液在115-125℃下灭菌20-30min，备用；
发酵：调节脱脂乳上清液的pH至6.5-8.0，按接种量为0.8-1.2%向脱脂乳上清液中接种复合菌种，再加入复合菌种总量0.02-0.5%的阿拉伯糖，然后在25-35℃的条件下发酵培养30-40h得发酵液，备用，上述复合菌种为重量比为1:0.5-0.8的枯草芽孢杆菌和黑曲霉，该步骤利用微生物产生的蛋白酶水解蛋白质制备多肽，所产生的酶中既有内肽酶又有端肽酶，可以同时在肽链的中间和两端进行切割，制备的多肽得率高、性能好，同时发酵过程能够脱去苦的多肽，制备的多肽不需要进行脱苦处理，从而极大地减少了工艺流程、降低了生产成本，而且发酵过程中还会有芳香味物质的产生，能够改善多肽的风味和口感；
分离：调节发酵液的pH至3.5-4.5，按添加量为0.1-0.2mg/mL加入壳寡糖，在30-40℃的条件下搅拌10-20min，然后置于转速为4000-6000r/min的离心机中离心8-15min，取上清液浓缩8-15倍，冷冻干燥即为多肽，由于蛋白质的微生物酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，也有分子量大小不等的多肽和游离的氨基酸，该步骤可以提高多肽的分离效率，得到的多肽生物活性高、安全无毒。
作为优选，发酵步骤中阿拉伯糖含有0.1-1.5%的D-阿拉伯糖，该阿拉伯糖的存在为微生物的生长提供碳源，能够促进微生物的生长代谢，提高微生物产酶量加大，使所产蛋白酶活性处于较高水平，缩短多肽的提取时间、提高多肽的得率，且D-阿拉伯糖的加入能够调节内肽酶和端肽酶的比例，在提高多肽的产率的同时还能修饰氨基酸分子中疏水性基团的作用，改善多肽的风味。
作为优选，分离步骤中壳寡糖的制备方法为：按料液比为1:12-16（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至4.5-5.5，然后按加酶量为5-7%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.4-0.6，在温度为40-50℃的条件下酶解4-6h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥，然后和Fe3O4磁粒子交联得壳寡糖，该制备方法以壳聚糖为原料，采用双酶解法联合过氧化氢法降解壳聚糖制备壳寡糖，能切断GlcN与GlcNAC之间的糖苷键，优先降解较长分子链以及聚合度较高的部分，生产相对分子量低且分布窄的壳寡糖，且该制备方法反应条件温和、易于控制、不污染环境、速度快。
进一步优选，过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前50-70min，过氧化氢溶液的浓度为8-12%，H2O2和酶液的体积比为1:6-10。过氧化氢的辅助降解的效果好，而过早加入高浓度H2O2溶液会影响酶的活力，阻碍还原糖的释放，而该条件可使酶解效果和降解效果达到最佳，同时弱酸溶液中壳聚糖恰好溶解，又不易形成铵盐，氧化位点多，降解速度快，使得产物分子量低，且过氧化氢降解法成本低，操作简单，同时对产物的后续处理影响小。
为了优化技术方法，采取的措施还包括：过氧化氢溶液中含有0.2-0.3mM儿茶酚和0.01-0.1mM鞣花酸，儿茶酚和鞣花酸能够通过化学修饰丰富壳寡糖的功能基团，改善其物化性质，同时能保护壳聚糖中氨基、羟基等活性基团氨基的稳定性，提高壳寡糖的吸附性能，且能避免单糖的产生，提高壳寡糖的得率，最终提高多肽的分离效率、降低提取成本。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明多肽的提取方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的多肽的生物活性高、无苦味，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力；2）本发明利用微生物产生的蛋白酶水解蛋白质制备多肽，多肽得率高、性能好，不需要进行脱苦处理，极大地减少了工艺流程、降低了生产成本，而且发酵过程中有芳香味物质的产生，改善多肽的风味和口感；3）本发明提取方法采用的分离方法使得多肽的分离效率高，得到的多肽生物活性高、安全无毒，可应用于食品、医药、保健品领域。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从脱脂蛋白乳上清液中提取多肽的方法，包括脱脂蛋白乳制备、脱脂乳上清液制备、发酵、分离，其具体步骤为：
1）脱脂蛋白乳制备：按料液比为1:5（g/mL）向含脂植物中加水，在45℃下磨制浆至细度为1μm，然后置于转速为4000r/min的离心机中离心35min，得到轻相液为植物油脂，重相液为脱脂蛋白乳，备用，该步骤能有效除去含脂植物中的油脂，避免油脂的氧化引起的部分蛋白质变性，提高蛋白乳中蛋白质的含量；
2）脱脂乳上清液制备：调节脱脂蛋白乳的pH至4.0，在脱脂蛋白乳的等电点下进行沉淀，得到脱脂乳上清液和蛋白浓浆，两者分离后将脱脂乳上清液在125℃下灭菌20min，备用；
3）发酵：调节脱脂乳上清液的pH至8.0，按接种量为0.8%向脱脂乳上清液中接种复合菌种，再加入复合菌种总量0.5%的阿拉伯糖，然后在25℃的条件下发酵培养40h得发酵液，备用，上述复合菌种为重量比为1:0.5的枯草芽孢杆菌和黑曲霉，该步骤利用微生物产生的蛋白酶水解蛋白质制备多肽，所产生的酶中既有内肽酶又有端肽酶，可以同时在肽链的中间和两端进行切割，制备的多肽得率高、性能好，同时发酵过程能够脱去苦的多肽，制备的多肽不需要进行脱苦处理，从而极大地减少了工艺流程、降低了生产成本，而且发酵过程中还会有芳香味物质的产生，能够改善多肽的风味和口感；
4）分离：调节发酵液的pH至4.5，按添加量为0.1mg/mL加入壳寡糖，在40℃的条件下搅拌10min，然后置于转速为6000r/min的离心机中离心8min，取上清液浓缩15倍，冷冻干燥即为多肽，由于蛋白质的微生物酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，也有分子量大小不等的多肽和游离的氨基酸，该步骤可以提高多肽的分离效率，得到的多肽生物活性高、安全无毒。
上述发酵步骤中阿拉伯糖含有0.1%的D-阿拉伯糖，该阿拉伯糖的存在为微生物的生长提供碳源，能够促进微生物的生长代谢，提高微生物产酶量加大，使所产蛋白酶活性处于较高水平，缩短多肽的提取时间、提高多肽的得率，且D-阿拉伯糖的加入能够调节内肽酶和端肽酶的比例，在提高多肽的产率的同时还能修饰氨基酸分子中疏水性基团的作用，改善多肽的风味。
上述分离步骤中壳寡糖的制备方法为：按料液比为1:16（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至4.5，然后按加酶量为7%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.4，在温度为50℃的条件下酶解4h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥，然后和Fe3O4磁粒子交联得壳寡糖，过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前70min，过氧化氢溶液的浓度为8%，H2O2和酶液的体积比为1:10。过氧化氢的辅助降解的效果好，而过早加入高浓度H2O2溶液会影响酶的活力，阻碍还原糖的释放，而该条件可使酶解效果和降解效果达到最佳，同时弱酸溶液中壳聚糖恰好溶解，又不易形成铵盐，氧化位点多，降解速度快，使得产物分子量低，且过氧化氢降解法成本低，操作简单，同时对产物的后续处理影响小；过氧化氢溶液中含有0.2mM儿茶酚和0.1mM鞣花酸，儿茶酚和鞣花酸能够通过化学修饰丰富壳寡糖的功能基团，改善其物化性质，同时能保护壳聚糖中氨基、羟基等活性基团氨基的稳定性，提高壳寡糖的吸附性能，且能避免单糖的产生，提高壳寡糖的得率，最终提高多肽的分离效率、降低提取成本；该制备方法以壳聚糖为原料，采用双酶解法联合过氧化氢法降解壳聚糖制备壳寡糖，能切断GlcN与GlcNAC之间的糖苷键，优先降解较长分子链以及聚合度较高的部分，生产相对分子量低且分布窄的壳寡糖，且该制备方法反应条件温和、易于控制、不污染环境、速度快。
实施例2：
从脱脂蛋白乳上清液中提取多肽的方法，包括脱脂蛋白乳制备、脱脂乳上清液制备、发酵、分离，其具体步骤为：
1）脱脂蛋白乳制备：按料液比为1:3（g/mL）向含脂植物中加水，在55℃下磨制浆至细度为0.2μm，然后置于转速为6000r/min的离心机中离心25min，得到轻相液为植物油脂，重相液为脱脂蛋白乳，备用；
2）脱脂乳上清液制备：调节脱脂蛋白乳的pH至5.0，在脱脂蛋白乳的等电点下进行沉淀，得到脱脂乳上清液和蛋白浓浆，两者分离后将脱脂乳上清液在115℃下灭菌30min，备用；
3）发酵：调节脱脂乳上清液的pH至6.5，按接种量为1.2%向脱脂乳上清液中接种复合菌种，再加入复合菌种总量0.02%的阿拉伯糖，然后在35℃的条件下发酵培养30h得发酵液，备用，上述复合菌种为重量比为1:0.8的枯草芽孢杆菌和黑曲霉；
4）分离：调节发酵液的pH至3.5，按添加量为0.2mg/mL加入壳寡糖，在30℃的条件下搅拌20min，然后置于转速为4000r/min的离心机中离心15min，取上清液浓缩8倍，冷冻干燥即为多肽。
上述发酵步骤中阿拉伯糖含有1.5%的D-阿拉伯糖。
上述分离步骤中壳寡糖的制备方法为：按料液比为1:12（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至5.5，然后按加酶量为5%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.6，在温度为40℃的条件下酶解6h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥，然后和Fe3O4磁粒子交联得壳寡糖，过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前50min，过氧化氢溶液的浓度为12%，H2O2和酶液的体积比为1:6；过氧化氢溶液中含有0.3mM儿茶酚和0.01mM鞣花酸。
实施例3：
从脱脂蛋白乳上清液中提取多肽的方法，包括脱脂蛋白乳制备、脱脂乳上清液制备、发酵、分离，其具体步骤为：
1）脱脂蛋白乳制备：按料液比为1:4（g/mL）向含脂植物中加水，在50℃下磨制浆至细度为0.6μm，然后置于转速为5000r/min的离心机中离心30min，得到轻相液为植物油脂，重相液为脱脂蛋白乳，备用；
2）脱脂乳上清液制备：调节脱脂蛋白乳的pH至4.5，在脱脂蛋白乳的等电点下进行沉淀，得到脱脂乳上清液和蛋白浓浆，两者分离后将脱脂乳上清液在120℃下灭菌25min，备用；
3）发酵：调节脱脂乳上清液的pH至7.2，按接种量为1.0%向脱脂乳上清液中接种复合菌种，再加入复合菌种总量0.3%的阿拉伯糖，然后在30℃的条件下发酵培养36h得发酵液，备用，上述复合菌种为重量比为1:0.6的枯草芽孢杆菌和黑曲霉；
4）分离：调节发酵液的pH至4.0，按添加量为0.15mg/mL加入壳寡糖，在35℃的条件下搅拌15min，然后置于转速为5000r/min的离心机中离心10min，取上清液浓缩12倍，冷冻干燥即为多肽。
上述发酵步骤中阿拉伯糖含有0.8%的D-阿拉伯糖。
上述分离步骤中壳寡糖的制备方法为：按料液比为1:14（g/L）将壳聚糖加入水中，调节其pH至5.0，然后按加酶量为6%加入复合酶，复合酶中木瓜蛋白酶和纤维素酶的配比为1:0.5，在温度为45℃的条件下酶解5h，酶解过程中辅以过氧化氢降解，随后调节酶解液的pH值至中性，沉淀未降解的壳聚糖，上清液浓缩，真空干燥，然后和Fe3O4磁粒子交联得壳寡糖，过氧化氢溶液加入时间为酶解结束前60min，过氧化氢溶液的浓度为10%，H2O2和酶液的体积比为1:8；过氧化氢溶液中含有0.25mM儿茶酚和0.05mM鞣花酸。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。