本发明涉及医药，特别是一种从泡桐花中分离异戊烯基黄酮类化合物的方法及应用。
背景技术：
泡桐花为玄参科泡桐属植物白花泡桐[paulowniafortunei(seem.)hemsl]的干燥花，在我国广泛分布，数量庞大，为中国传统用药之一，具有广泛的药理活性。传统用药中，泡桐花多用于治疗慢性支气管炎、肺炎等疾病,随着科技的发展，药物研究领域不断出现新的技术和方法，且植物药与化学药相比具有天然、低毒的优势从而渐渐成为专家和学者的研究的热点。泡桐花的更多药用价值逐渐被挖掘，以期能够广泛的将这药用植物应用于生产或生活。那么如何从泡桐花中提取新的有效成分，并实现对心肌保护药物中的应用，至今未见有公开报道。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从泡桐花中分离异戊烯基黄酮类化合物的方法及应用，可有效解决从泡桐花中提取有效活性成分并实现对心肌保护药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种从泡桐花中分离异戊烯基黄酮类化合物的方法及应用，所述的泡桐花中分离异戊烯基黄酮类化合物为paulownioned、paulownionee、paulownionef、paulownioneg，分子结构式见图1：
其制备方法包括以下步骤：
1、制备组分fr.5-1～fr.5-5，方法是：
将泡桐花碾压粉碎，用体积浓度为50％含水丙酮做提取液提取4次，每次提取液用量为泡桐花重量的10倍，提取液浓缩干燥，得第一次干燥物，第一次干燥物先用水分散溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，石油醚提取5次，石油醚每次用量是泡桐花重量的二分之一，乙酸乙酯提取8次，乙酸乙酯每次用量是泡桐花重量的二分之一，正丁醇提取8次，正丁醇每次用量是泡桐花重量的二分之一，分别浓缩干燥，依次得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和余下的水部位；乙酸乙酯部位采用重量比1:1硅胶拌样，进行梯度洗脱，洗脱液为二氯甲烷：甲醇体积比分别为:100:0、100:1、80:1、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1、0:100，流速10ml/min，每个部位的流动相用量为柱体积的25倍，每500ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，7d洗脱完毕，根据薄层检识得到fr.1-9九个不同组分，其中组分fr.5再次以硅胶柱层析，采用二氯甲烷和甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，二氯甲烷：甲醇的体积比为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1，洗脱流速10ml/min，每个部位的流动相用量为柱体积的10倍，每50ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，3d洗脱完毕，得到组分fr.5-1～fr.5-5；
2、制备化合物paulownioned和paulownionee，方法是：
将步骤1得到的组分fr.5-1用甲醇溶解，通过sephadexlh-20柱色谱，用甲醇洗脱，流速1.0ml/min，流动相用量为组分fr.5-1重量的200倍，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并150～350ml之间的流份，得组分fr.5-1-1，(合并351～450ml之间的流份，标为组分fr.5-1-2)；组分fr.5-1-1用体积浓度70％的甲醇溶解，通过toyopearlhw-40色谱柱，再用体积浓度70％甲醇洗脱，流速1.5ml/min，流动相用量为组分fr.5-1重量的100倍，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并150～400ml之间的流份，浓缩干燥得到fr.5-1-1-1，组分fr.5-1-1-1用半制备hplc分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为乙腈和水，体积比为乙腈：水＝12：88，流速3ml/min，收集保留时间tr＝25.7min的流份和保留时间tr＝28.4min的流份，分别浓缩干燥，得到化合物paulownioned和paulownionee；
3、制备化合物paulownionef和化合物paulownioneg，方法是：
将步骤1制备的组分fr.5-3用体积浓度70％甲醇溶解，通过toyopearlhw-40柱色谱，用体积浓度为70％的甲醇作流动相洗脱，流速1.5ml/min，流动相用量为组分fr.5-3重量的100倍，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并150-350ml之间的流份，得组分fr.5-3-1，合并351-500ml之间的流份，得组分fr.5-3-2，合并501-800ml之间的流份，得组分fr.5-3-3；组分fr.5-3-2用ods柱拌样，组分fr.5-3-2与ods柱重量比为1:1，通过ods柱色谱，依次用水、体积浓度为10％、20％、30％、40％甲醇梯度洗脱，流速3ml/min，以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断洗脱终点，每20ml检识一次，2d洗脱完毕，合并30％甲醇洗脱流分，得组分fr.5-3-2-1；用半制备hplc分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水＝20：80，流速3ml/min，收集保留时间tr＝31.9min的流份，浓缩干燥，得到化合物paulownionef；合并40％甲醇洗脱流分，得组分fr.5-3-2-2，用半制备hplc分离，上规格型号为：250×20mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝37：63，流速3ml/min，收集保留时间tr＝19.8～23.5min的流份，浓缩干燥，得组分fr.5-3-2-2-1；组分fr.5-3-2-2-1通过半制备hplc，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水＝17：83，流速3ml/min，收集保留时间tr＝45.6min的流份，浓缩干燥，得到化合物paulownioneg；
上述所得到的化合物具有对心肌的保护作用，有效用于制备保护心肌的药物。
本发明制备方法新颖独特，采用50％丙酮组织破碎法对其进行提取。从泡桐花50％丙酮提取液中分离制备出四个新的异戊烯基黄酮类成分，即：paulownioned、e、f、g，具有显著性保护脂多糖对h9c2细胞造成的损害，具有心肌细胞保护作用，对心肌细胞具有保护作用，开拓了心肌细胞保护的新药物和泡桐花的药用价值，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明化合物paulownioned、e、f、g分子式结构图；
图2为本发明paulownioned的1h-nmr谱图；
图3为本发明化合物paulownioned的13c-nmr谱；
图4为本发明化合物paulownioned的dept135谱；
图5为本发明化合物paulownioned的1h-1hcosy谱；
图6为本发明化合物paulownioned的hsqc谱；
图7为本发明化合物paulownioned的hmbc谱；
图8为本发明化合物paulownioned的noesy谱；
图9为本发明化合物paulownioned的hresims谱；
图10为本发明化合物paulownioned的红外光谱；
图11为本发明化合物paulownioned的圆二色谱；
图12为本发明化合物paulownionee的1h-nmr谱；
图13为本发明化合物paulownionee的13c-nmr谱；
图14为本发明化合物paulownionee的1h-1hcosy谱；
图15为本发明化合物paulownionee的hsqc谱；
图16为本发明化合物paulownionee的hmbc谱；
图17为本发明化合物paulownionee的noesy谱；
图18为本发明化合物paulownionee的hresims谱；
图19为本发明化合物paulownionee的红外光谱；
图20为本发明化合物paulownionef的1h-nmr谱；
图21为本发明化合物paulownionef的13c-nmr谱；
图22为本发明化合物paulownionef的dept135谱；
图23为本发明化合物paulownionef的1h-1hcosy谱；
图24为本发明化合物paulownionef的hsqc谱；
图25为本发明化合物paulownionef的hmbc谱；
图26为本发明化合物paulownionef的noesy谱；
图27为本发明化合物paulownionef的hresims谱；
图28为本发明化合物paulownionef的红外光谱；
图29为本发明化合物paulownionef的圆二色谱；
图30为本发明化合物paulownioneg的1h-nmr谱；
图31为本发明化合物paulownioneg的13c-nmr谱；
图32为本发明化合物paulownioneg的dept135谱；
图33为本发明化合物paulownioneg的1h-1hcosy谱；
图34为本发明化合物paulownioneg的hsqc谱；
图35为本发明化合物paulownioneg的hmbc谱；
图36为本发明化合物paulownioneg的noesy谱；
图37为本发明化合物paulownioneg的hresims谱；
图38为本发明化合物paulownioneg的红外光谱；
图39为本发明化合物paulownioneg的圆二色谱。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种从泡桐花中分离异戊烯基黄酮类化合物的方法及应用，其方法包括以下步骤：1、制备组分fr.5-1～fr.5-5，方法是：将泡桐花6kg碾压粉碎，用体积浓度50％含水丙酮提取4次，每次提取液用量60kg，合并提取液，提取液浓缩干燥，得第一次干燥物，用水分散溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，石油醚提取5次，每次用量3l，乙酸乙酯提取8次，每次用量3l，正丁醇提取8次，每次用量3l，浓缩干燥，依次得到石油醚部位50g、乙酸乙酯部位220g、正丁醇部位112g和余下的水部位；乙酸乙酯部位采用重量比1:1硅胶(220g)拌样，用二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱液进行梯度洗脱，二氯甲烷：甲醇的体积比为100:0、100:1、80:1、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1、0:100，流速10ml/min，每个部位的流动相用量为柱体积的25倍，每500ml检识一次，每个梯度流动相以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，7d洗脱完毕，根据薄层检视得到fr.1-9九个不同组分，将组分fr.512g再次以硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇的混合液座洗脱液进行梯度洗脱，二氯甲烷：甲醇的体积比为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1，洗脱流速10ml/min，流动相用量为柱体积的10倍，每50ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，3d洗脱完毕，得到fr.5-1～fr.5-5；
2、制备化合物paulownioned和paulownionee，方法是：将组分fr.5-15g用甲醇溶解，通过sephadexlh-20柱色谱，再用甲醇作流动相进行洗脱，流速1.0ml/min，流动相用量为1000ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并150～350ml之间的流分，记为组分fr.5-1-1，合并351～450ml之间的流份，记为组分fr.5-1-2；组分fr.5-1-1用体积浓度为70％甲醇溶解，通过toyopearlhw-40色谱柱，再用体积浓度70％甲醇作流动相进行洗脱，流速1.5ml/min，流动相用量为500ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并150～400ml之间的流份，浓缩干燥得到组份fr.5-1-1-1，组分fr.5-1-1-1用半制备hplc分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水＝12：88，流速3ml/min，分别收集保留时间tr＝25.7min的流份和保留时间tr＝28.4min的流份，浓缩干燥，得到化合物paulownioned和paulownionee；
3、制备化合物paulownionef和化合物paulownioneg，方法是：将组分fr.5-315g用体积浓度70％甲醇溶解，通过toyopearlhw-40柱色谱，再用体积浓度70％甲醇作流动相进行洗脱，流速1.5ml/min，流动相用量为1500ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，收集150-350ml之间的馏分，记为组分fr.5-3-1，收集351-500ml之间的流分，记为组分fr.5-3-2，收集501-800ml的流份，记为组分fr.5-3-3；将组分fr.5-3-2以体积比1:1ods拌样，通过ods柱色谱，依次用水、体积浓度为10％、20％、30％、40％的甲醇梯度洗脱，流速3ml/min，以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断洗脱终点，每20ml检识一次，2d洗脱完毕，合并体积浓度30％甲醇洗脱流分，记为组分fr.5-3-2-1，用半制备hplc分离，上规格型号为：250×10mm，粒径5μm，孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水＝20：80，流速3ml/min，收集保留时间tr＝31.9min的流份，浓缩干燥，得到化合物paulownionef；合并体积浓度40％甲醇洗脱流分，记为组分fr.5-3-2-2，用半制备hplc分离，上规格型号为：250×20mm,粒径5μm,孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝37：63，流速3ml/min，收集保留时间tr＝19.8～23.5min的流份，浓缩干燥，记为组分fr.5-3-2-2-1；组分fr.5-3-2-2-1通过半制备hplc，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm，孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水＝17：83，流速3ml/min，收集保留时间tr＝45.6min的流份，浓缩干燥，得到化合物paulownioneg。
按上述方法还可以对其他不同重量的泡桐花进行提取，均得到了相同和相近似的结果，这里不再一一累述，上述制备的化合物均能显著性改善脂多糖对h9c2细胞造成的细胞活力降低、tnf-α与il-6水平升高，从而具有心肌保护的作用。并经试验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
1、结构鉴定
paulownioned为白色粉末，经高分辨质谱仪测定，hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z:385.1686[m+h]+(calcd.forc22h25o6385.1645),确定其分子式为c22h24o6；
paulownionee为淡黄色粉末,经高分辨质谱仪测定，hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z:477.1525[m+na]+(calcd.forc25h26o8[na]477.1519),确定其分子式为c25h26o8；
paulownionef为白色粉末,经高分辨质谱仪测定，hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z:477.1525[m+na]+(calcd.forc26h32o8[na]477.1519),确定其分子式为c26h32o8；
paulownioneg为白色粉末，经高分辨质谱仪测定，hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z:479.1683[m+na]+(calcd.forc26h32o8na479.1676)，确定其分子式为c26h32o8；
表2化合物paulownioned、paulownionee、paulownionef、paulownioneg的nmr数据(incd3od)
2、活性检测
2.1实验方法
h9c2细胞分为7组：正常、模型(lps20μg·ml-1)、paulownioned[10μm+lps(20μg·ml-1)]、paulownionee[10μm+lps(20μg·ml-1)]、paulownionef[10μm+lps(20μg·ml-1)]、paulownioneg[10μm+lps(20μg·ml-1)]组。细胞密度为2×104个/ml，接种于96孔板培养12h，用含药物的培养基培养24h，mtt法测吸光度，计算细胞活力。同时，elisa法检测细胞上清液il-6和tnf-α的水平，按照elisa试剂盒说明书进行操作。
2.2实验结果
实验结果:与正常组(con)比较，模型组(m)细胞活力显著降低；细胞上清液中tnf-α以及il-6水平显著性升高。paulownioned显著性升高模型组细胞活力(p<0.05)，paulownionee，paulownionef和paulownioneg极显著性升高细胞活力(p<0.01)；paulownioned-g极显著性降低细胞上清液中及il-6的水平(p<0.01)，paulownioned显著性降低tnf-α水平(p<0.05)，paulownionee-g，极显著性降低tnf-α水平(p<0.01)。见下表3。
表3:paulownioned-g对细胞活力，tnf-α和il-6的影响(
注：与正con比较，*p<0.05，**p<0.01；与m比较，#p<0.05，##p<0.01
综上所述，本实验室从泡桐花50％含水丙酮提取液中分离并鉴定了四个新的异戊烯基黄酮类化合物，即：paulownioned、paulownionee、paulownionef、paulownioneg，实验结果显示这4个化合物均能显著性改善脂多糖对h9c2细胞造成的细胞活力降低、tnf-α与il-6水平升高，从而具有心肌保护的作用。
由上述可以看出，本发明采用体积浓度为50％的丙酮对泡桐花采用组织破碎法对其进行提取，从泡桐花提取液中分离出四个新的异戊烯基黄酮类成分，即：paulownioned、paulownionee、paulownionef、paulownioneg，四个异戊烯基黄酮类化合物均能显著性保护脂多糖对h9c2细胞造成的损害，具有心肌细胞保护作用，制备方法新颖独特，效果好，能有效从泡桐花中提取有效的药用活性成分，用于制备保护脂多糖对h9c2细胞造成的损害的药物，开拓了泡桐花药用的新价值和商业价值，有显著的经济和社会效益。