本发明属于国槐的检测领域，具体涉及一种聊红槐ssr标记指纹图谱的构建方法与应用。
背景技术：
国槐sophorajaponical.在分类上属于蝶形花科槐属，又叫槐树、中国槐、豆槐、家槐、守宫槐、槐米树等，是我国优良的材用、药用、食用、观赏树种。国槐性耐寒，喜阳光，不耐阴湿而抗旱，在低洼积水处生长不良，较耐瘠薄，石灰及轻度盐碱地(含盐量0.15％左右)上也能正常生长。耐烟尘，能适应城市街道环境，对二氧化硫、氯气、氯化氢均有较强的抗性，是城乡造林绿化的“主角”。目前，在北京、南京、西安、天津、济南、石家庄等许多城市都把国槐列为主要绿化树种，其中北京，西安，大连，泰安等地还将国槐列为市树，可见人们对国槐这一中国乡土树种的偏爱。随着国槐的广泛种植，出现了许多新的国槐品种，如五色槐、蝴蝶槐、聊红槐、金叶国槐、金枝槐、双季米槐、平安槐、抱印槐、“曹州1号”、“曹州2号”、“曹州3号”，山东省梁山县的“荣国槐”等。随着国槐品种的增多，表型差异越来越小，区分难度越来越大，同时一些性状也不能在早期显现出来(如花色)，这就需要找到一种不受表型性状影响的方法将不同的品种进行区分。dna指纹图谱是以dna分子标记为基础，鉴别生物个体间差异的图谱，具有丰富的多态性、高度的个体差异性以及简单稳定的遗传性的特点。dna指纹图谱是由英国莱斯特大学的jeffreys及其同事于1985年在人体基因组试验研究中发现的。首先将其应用与亲子鉴定、移民审查及凶手侦破，随着科学技术的发展，dna指纹图谱技术得到不断完善，目前已被广泛应用于生物个体及品种的鉴定研究中。目前用于绘制植物dna指纹图谱的标记
技术主要有rapd、rflp、aflp、ssr等，由于ssr分子标记具有高度多态性、共显性遗传、重复性好、特异性强、遗传稳定和广泛分布在整个基因组等优点，逐步成为品种鉴别的主要手段，在品种及基因型鉴定等方面发挥着重要的作用。
聊红槐是聊城大学邱艳昌副教授培育出的国槐新品种，花朵旗瓣为浅粉色，翼瓣和龙骨瓣则为淡堇紫色。聊红槐花期一般为7月上旬到8月中旬，比一般国槐的花期能够长14天左右。每到夏季，花期一到，满树的红花，景观甚是新奇，美丽非常。但处于苗期的聊红槐很难通过表型特征来进行鉴定，因此，亟待提供一种方法为聊红槐品种的鉴定提供技术支持。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种聊红槐ssr标记指纹图谱的构建方法与应用，为聊红槐品种的鉴定提供依据，该指纹图谱具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
本发明的聊红槐ssr标记指纹图谱的构建方法，包括6对筛选出的ssr标记引物，是基于聊红槐基因组简单重复序列片段开发的ssr引物，扩增带型好、重复性高的ssr引物。6对ssr标记引物序列详细信息如表1.
表1筛选出的6对ssr引物序列
利用已建立好的国槐ssr反应体系和聚丙烯酰胺凝胶电泳，从100对引物中进行三次筛选，第一次将扩增出条带的引物保留，不能扩增出条带的引物在调整扩增体系仍不能扩增出条带时丢弃，第二次将扩增条带清晰的引物保留，通过调整体系仍扩增不出清晰条带的引物丢弃，第三次扩增将多样性好的引物保留，根据此程序筛选出6对条带清晰，稳定性强，多态性好的引物，并对这6对引物用不同荧光进行标记。根据对300分国槐样品扩增结果来看2128、2844、3049、1970、1060、1302的观察等位基因数及有效等位基因数都较高，且有特异扩增条带，因此选择这6对引物。
本发明的聊红槐ssr标记指纹图谱的构建方法，具体如下步骤：
(1)基因组dna提取：采用改良的ctab法进行提取；
(2)ssr标记的pcr扩增：用6对筛选出的ssr引物对上述提取的dna进行pcr扩增；
(3)毛细管电泳检测：
所述毛细管电泳具体为：用6对筛选出的已标记不同荧光的引物进行pcr扩增，在96孔上样板的每个孔中分别加pcr产物、甲酰胺和gs-500liz分子量内标混匀，离心，变性，4℃冷却后离心，dna测序仪abi3730xldnaanalyzer(appliedbiosystems,fostercity,usa)进行自动荧光检测。利用gene-marker2.2.0软件(softgeneticsllc,usa)读取结果，并记录每个位点片段大小。
优选的，所述的步骤(1)中改良的ctab法提取基因组dna，具体步骤如下：
a、65℃预热dna提取缓冲液2×ctab700μl，β-巯基乙醇20μl，10％pvp140μl，充分混匀。
b、称取0.5g幼嫩聊红槐叶片，装入2ml离心管中，加入直径约为2mm的钢珠两粒，放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒，用retsch混合型研磨仪研磨约1.5min，至聊红槐叶片呈细粉末状，向每个离心管中迅速加入预热的ctab700μl，然后放入65℃水浴锅中水浴30min左右，水浴过程中要注意轻微翻转离心管2-3次。
c、水浴后冷却至室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，温和翻转至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
d、吸取上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇，温和翻转至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
e、吸取上清液于新的离心管中，并加入2倍体积-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇，于-20℃静放30min-1h。
f、用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状dna沉淀，用1ml75％的乙醇和无水乙醇洗涤2-3次，置于通风处吹干。
g、加60μlddh2o溶解dna，-20℃保存待用。
所述步骤(a)中dna提取缓冲液2×ctab包括100mmtris-hcl(ph8.0)，1.4mmnacl，50mmedta(ph8.0)，2％ctab；
进一步,优选的，所述的步骤(c)中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25：24：1；
进一步,优选的，所述的步骤(d)中氯仿、异戊醇体积比为24:1,v/v；
优选的，所述的步骤(2)中ssr-pcr反应体系见表2：
表2ssr-pcr聊红槐反应体系的组成
优选的，所述的步骤(2)中ssr-pcr反应程序采用采用touch-down程序，具体如表3：
表3pcr扩增反应程序
本方法采用touch-down程序是为了有效避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。touch-downpcr程序每循环降低0.5℃都会造成每个循环pcr产物量的较大差异，相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。
优选的，所述的步骤(3)中纯化的pcr产物、甲酰胺和gs-500liz分子量内标的用量比为0.3μl：9.5μl：0.5μl。
优选的，所述的步骤(3)中变性条件为95℃变性5min。
本发明的聊红槐ssr标记指纹图谱构建方法的应用，筛选出6对多态性好、稳定的引物，通过对收集的300份国槐种质的扩增结果分析，确定了6对ssr引物在聊红槐中扩增出的等位片段的数量及大小编码，通过不同ssr等位片段的编码组合可有效识别聊红槐品种(表5)。通过分子量内标gs-500liz(abi4322682)可确定各ssr引物扩增的等位位点的相对分子量，存在于聊红槐特异ssr等位片段组合的品种即是聊红槐，该品种的编号组合为134，114+118，158，72+87，97，128，
表46对ssr引物对300份国槐扩增结果
本发明的有益效果为：
1.本发明建立了聊红槐ssr标记指纹图谱的构建方法与应用，对聊红槐特异性等位变异以及聊红槐相对于其他国槐品种的特异性的鉴定具有重要意义和良好的应用前景。
2.本发明利用毛细管电泳方法进行聊红槐品种鉴定，具有检测时间短，准确性高，操作方便，重复性好的优点，并且鉴定结果不受环境影响。
附图说明
图1是引物2128在聊红槐中的扩增结果；
图2是引物2844在聊红槐中的扩增结果；
图3是引物3049在聊红槐中的扩增结果；
图4是引物1970在聊红槐中的扩增结果；
图5是引物1060在聊红槐中的扩增结果；
图6引物1302在聊红槐中的扩增结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
1)dna提取
通过对收集的300份国槐种质采用改良的ctab法提取供试品种dna提取：
1、65℃预热dna提取缓冲液2×ctab(100mmtris-hcl(ph8.0)，1.4mmnacl，50mmedta(ph8.0)，2％ctab)700μl，β-巯基乙醇20μl(现加现用)，10％pvp140μl，充分混匀。
2、称取0.5g幼嫩聊红槐叶片，装入2ml离心管中，加入直径约为2mm的钢珠两粒，放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒，用retsch混合型研磨仪研磨约1.5min，至聊红槐叶片呈细粉末状，向每个离心管中迅速加入预热的ctab700μl，然后放入65℃水浴锅中水浴30min左右，水浴过程中要注意轻微翻转离心管2-3次。
3、水浴后冷却至室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，v/v/v)，温和翻转至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
4、吸取上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1,v/v)，温和翻转至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
5、吸取上清液于新的离心管中，并加入2倍体积(约1ml)-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇，于-20℃静放30min-1h。
6、用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状dna沉淀，用1ml75％的乙醇和无水乙醇洗涤2-3次，置于通风处吹干。
7、加60μlddh2o溶解dna，-20℃保存待用。
2)6对核心ssr引物筛选
利用已建立好的国槐ssr反应体系(表2-3)和聚丙烯酰胺凝胶电泳，从100对引物中进行三次筛选，第一次将扩增出条带的引物保留，不能扩增出条带的引物在调整扩增体系仍不能扩增出条带时丢弃，第二次将扩增条带清晰的引物保留，通过调整体系仍扩增不出清晰条带的引物丢弃，第三次扩增将多样性好的引物保留，根据此程序筛选出6对条带清晰，稳定性强，多态性好的引物，并对这6对引物用不同荧光进行标记。根据对300份国槐样品扩增结果来看2128、2844、3049、1970、1060、1302的观察等位基因数及有效等位基因数都较高，且有特异扩增条带，因此选择这6对引物。
ssr-pcr反应体系，见表2：
表2ssr-pcr聊红槐反应体系的组成
pcr扩增反应程序，见表3：
表3pcr扩增反应程序
3)筛选出的6对核心ssr引物对供试品种进行pcr扩增：
见表1：
表1筛选出的6对ssr引物序列
4)毛细管电泳检测：
采用毛细管电泳技术对6对荧光标记后的核心引物扩增产物进行检测，检测的效率得到显著提高：在96孔上样板的每个孔中分别加0.3μl纯化的pcr产物，9.5μl甲酰胺和0.5μlgs-500liz分子量内标，离心，95℃变性5min，4℃冷却后离心，利用dna测序仪abi3730xldnaanalyzer(appliedbiosystems,fostercity,usa)进行自动荧光检测。利用gene-marker2.2.0软件(softgeneticsllc,usa)读取结果，并记录每个位点片段大小。
5)结果分析
利用国槐转录组测序结果，从设计的100对ssr引物中筛选出6对多态性好、稳定的引物，通过对收集的300份国槐种质的扩增结果分析，确定了6对ssr引物在聊红槐中扩增出的等位片段的数量及大小编码，通过不同ssr等位片段的编码组合可有效识别聊红槐品种(表5)。通过分子量内标gs-500liz(abi4322682)可确定各ssr引物扩增的等位位点的相对分子量，存在于聊红槐特异ssr等位片段组合的品种即是聊红槐，该品种的编号组合为134，114+118，158，72+87，97，128(如图1、图2、图3、图4、图5、图6)，为保证鉴定的准确性，进行三次重复实验。
表46对ssr引物对300份国槐扩增结果
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
sequencelisting
<110>山东省林业科学研究院
<120>聊红槐ssr标记指纹图谱的构建方法与应用
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