本发明涉及食品安全领域，更具体地说，涉及一种生鲜乳中β-内酰胺酶内外源性分析方法。
背景技术：
目前，牛乳中抗生素残留问题已经引起了国内外的广泛关注。我国农业部2001年颁布了《无公害食品生鲜牛乳》行业标准，该标准规定生鲜乳中抗生素“不得检出”。然而由于β-内酰胺酶可以选择性地分解牛乳中残留的β-内酰胺类抗生素，掩盖抗生素痕迹，并且由于抗生素类药物的滥用，已引起耐药菌株的增加；因此β-内酰胺酶的使用可引起耐药菌株的增加已成为不容置疑的事实，有关数据也表明经β-内酰胺酶分解后的抗生素分解产物可能对人体健康构成潜在威胁。
常用的β-内酰胺酶检测法包括理化检测法、微生物检测法、免疫法检测法、试剂盒检测法以及试剂条检测法。
理化检测法是利用β-内酰胺酶分子中的基因所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法和联用技术等；理化检测法准确性好，敏感性强，重现性好，但通常检测程序较复杂，检测费用较高。经检索，关于理化检测方法现有技术也进行了改进，如中国专利申请号cn200910062852.2，公开日为2010.12.29的申请案公开了一种β-内酰胺酶的快速测定的方法。该方法将待测样品，如奶液中含有的β-内酰胺酶与其底物，如青霉素以两组独立的流动相在一反应器进行混合并进行催化反应，将其生物催化产生的热量转化成温度的变化，并通过测量其温度的相对变化来确定其待测物的成分、浓度或活性等。该β-内酰胺酶测定仪为酶热生物分析仪，能定量分析和定性分析液态样品中的β-内酰胺酶含量和活性。适合于食品分析中尤其是乳制品、饮料等中的β-内酰胺酶的快速检测(5分钟/样品)，并具有检测价格低(约几元人民币/样品)、操作简便、无需对样品进行预处理和很高的灵敏度和精度。
微生物法是在规定条件下选用适当微生物测定某物质含量的方法；微生物法中常用的一种方法为杯碟法，主要采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株(藤黄微球菌)，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作为对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大小，间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。该检测方法成本低廉、准确性好；然而对试验要求比较严格，试验条件也要求严密。
免疫法是依据抗原抗体特异性反应的基本特性而设计的检测方法，操作简单、速度快、特异性强，但操作过程复杂。如中国专利申请号201310001684.2，公开日为2014.11.26的申请案公开了一种检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法，该申请案应用购于上海阿拉丁试剂公司的重组β-内酰胺酶免疫8周龄的balb/c小鼠，经过正常的免疫、细胞融合、筛选后得到15株β-内酰胺酶单克隆抗体。15株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶(hrp)并进行两两配对。以jn2011-03、jn2011-04分别为包被抗体和酶标抗体，以β-内酰胺酶为标准品建立了β-内酰胺酶的夹心elisa分析方法，lod为1.22ng/ml，线性范围为10～100ng/ml。
试剂盒检测法采用间接竞争法，利用β-内酰胺酶可分解β-内酰胺类抗生素的原理，通过配体-受体识别法快速测定与β-内酰胺酶反应后残留的青霉素g抗生素的含量。生鲜牛乳样品中添加已知含量的β-内酰胺类抗生素受体与样品中残留的β-内酰胺酶特异性配体蛋白结合反应，残余的β-内酰胺酶与载体上包被有β-内酰胺类抗生素的结合反应，β-内酰胺类抗生素被分解后显色，与标准溶液色带对照定性。但是单个样品检测价格昂贵，较适用于少量样品的现场操作及快速检测。
试剂条检测法是一种快速检测方法，其原理与试剂盒法相似，同样采用间接竞争法对β-内酰胺酶进行检测分析。
现有技术的方法虽然均能够完成β-内酰胺酶的检测，保证结果的准确度和灵敏度，然而无论哪种检测方法均无法区分β-内酰胺酶的内外源性，由于β-内酰胺酶主要是由细菌产生，如生鲜乳中被污染了含有可产β-内酰胺酶的耐药细菌，β-内酰胺酶同样可以被检出。因此现有技术的检测方法无法区分β-内酰胺酶是由生鲜乳中自带的耐药细菌产生还是商家为了掩盖和消除牛乳中残留β-内酰胺类抗生素痕迹而人为添加的。
经检索，现有技术中已有用于检测产生β-内酰胺酶的细菌的申请案，如中国专利申请号201280063949.5，公开日期为2014.11.19的申请案公开了一种用于检测样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌的方法，该方法包括以下步骤：a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液；b)使一部分步骤a)获得的酶悬液与试剂盒反应，所述试剂盒包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的光谱β-内酰胺酶的底物，ph颜色指示剂，当反应混合物的ph为6.4～8.4时，所述ph颜色指示剂将改变颜色，由此检测出存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌。然而该方法并没有提供生鲜乳样品的预处理方法，如直接用于生鲜乳样品自带的耐药细菌的检测将存在较多的干扰，且无法直接用于β-内酰胺酶的内外源性检测，无法保证结果的准确度。再如中国专利申请号201080015156.7，公开日期为2012.03.21的申请案公开了一种用于检测和鉴定超广谱β-内酰胺酶的方法，该方法提供寡核苷酸、探针以及包含它们的试剂盒，用于检测细菌的ctx-m序列，该方法还提供了用于检测和/或扩增存在于微生物的超广谱β-内酰胺酶基因。该申请案的方法操作复杂、成本较高，同样不适用于生鲜乳样品中β-内酰胺酶的内外源性检测。
基于现有技术的缺陷，亟需开发一种简单方便、针对性强的能够区分生鲜乳中β-内酰胺酶内外源性的检测方法，从而有效打击不法商家，从根本上解决该领域内抗生素滥用的食品安全问题。
技术实现要素：
1.要解决的问题
现有技术可以有效的检测出生鲜乳中是否含有β-内酰胺酶，但是无法区分其是内源自生的还是外源性添加。本发明旨在提供一种简单方便，准确率高，能够有效区分β-内酰胺酶内外源性的检测分析方法，为β-内酰胺酶溯源提供很好的支持。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种生鲜乳中β-内酰胺酶内外源性分析方法，包括以下步骤：
1)检测生鲜乳中β-内酰胺酶，鉴别出阴性样品和阳性样品，筛选出阳性样品；
2)将步骤1)中的阳性样品重新接种于β-内酰胺酶阴性的灭菌乳培养，再次检测β-内酰胺酶，鉴别出阴性样品和阳性样品，将阴性样品判定为β-内酰胺酶外源性样品；阳性样品判定为β-内酰胺酶可疑内源性样品。
作为本发明更进一步的改进，所述方法还包括步骤3)和步骤4)；所述步骤3)中，将步骤2)中的阴性样品继续培养，检测β-内酰胺酶，再次鉴别阴性样品和阳性样品，阴性样品判定为外源性β-内酰胺酶，阳性样品进一步处理；所述步骤4)中，将步骤2)中鉴别出的阳性样品和步骤3)中鉴别的阳性样品分别接种于β-内酰胺酶阴性的灭菌乳培养，检测β-内酰胺酶，鉴别出阴性样品和阳性样品，阴性样品判定为外源性β-内酰胺酶，阳性样品判定为内源性β-内酰胺酶。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤4)中，将步骤2)中鉴别出的阳性样品和步骤3)中鉴别的阳性样品接种于β-内酰胺酶阴性的灭菌乳培养之前，首先接种于培养基中培养，将培养的菌落分离培养、分纯，将分纯的菌株分别接种于β-内酰胺酶阴性的灭菌乳培养。
作为本发明更进一步的改进，所述方法还包括步骤5)，所述步骤5)中，将步骤4)中鉴别的阴性样品继续培养，检测β-内酰胺酶，鉴别出阴性和阳性样品；阴性样品判定为外源性β-内酰胺酶，阳性样品判定为内源性β-内酰胺酶。
作为本发明更进一步的改进，所述阴性样品培养的温度为25℃；培养时间为18h。
作为本发明更进一步的改进，所述阳性样品培养的温度为25℃；培养时间为6h。
作为本发明更进一步的改进，所述β-内酰胺酶检测方法为杯碟法或试剂条法。
作为本发明更进一步的改进，所述培养基的类型包括血平皿、伊红美兰平皿、bp平皿、myp平皿。
作为本发明更进一步的改进，所述分析方法用于检测生鲜乳中β-内酰胺酶内外源性。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的生鲜乳中β-内酰胺酶内外源性分析方法，可以在生鲜乳样品β-内酰胺酶检测时有效的区分β-内酰胺酶的内源性和外源性；从而辨别样品中的β-内酰胺酶是由耐药菌产生还是商家违法添加，本发明的方法在国内是首创，可有效应用于食品安全监督抽检，对乳制品企业的监管过程中滥用抗生素的现象起到有效的遏制作用。
(2)本发明的生鲜乳中β-内酰胺酶内外源性分析方法，采用现有技术常用的检测方法检测样品，首次检测先将阴性样品排除，阳性样品进一步分析；在阳性样品分析的过程中不断将阳性样品离心后的沉淀接种于灭菌乳中培养，再次鉴别阴阳性样品，鉴别出的阴阳性样品再进行逐步的分析和培养、鉴别过程，最终鉴别出样品的内外源性，并且采用荧光定量pcr技术检测阳性菌的内源基因，进一步证实本发明方法的准确性，证明本发明方法检测的结果与预期一致，操作过程简单方便，结果准确可靠，耗费成本低廉，利于推广。
(3)本发明的生鲜乳中β-内酰胺酶内外源性分析方法，在阳性样品的沉淀进行接种培养过程中首先采用接种于灭菌乳培养的方式，再次选择将其接种于各个培养基平板上进行菌落培养，再将分纯的菌株接种在灭菌乳培养，采用上述培养鉴别方式可以使检测结果更为准确，另一方面采用不同类型培养基平板可以将生鲜乳中产生的各种类型耐药菌株筛选而出，进行生化鉴定，对生鲜乳中产生的耐药菌株进行深入的追踪研究，从而为乳制品食品安全的问题提供参考。
(4)本发明的生鲜乳中β-内酰胺酶内外源性分析方法，根据样品中含有阳性菌几率较大时在接种于灭菌乳中培养时间较长容易造成乳品凝固的特点，选择培养时间为6小时初步得出检测结果，而将该步骤鉴别出的阳性菌几率较小的阴性样品再次鉴定时则选择培养时间为18小时，阴性样品培养时一方面不会引起乳品凝固，另一方面保证长时间培养条件下的结果的准确性；而阳性样品则是通过短时间培养、多次分步培养、鉴别的方式进行β-内酰胺酶内外源性的排查。
附图说明
图1为实施例3中β-内酰胺酶内外源性分析的流程示意图；
图2为实施例4中β-内酰胺酶内外源性分析的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
本实施例中对生鲜乳中的β-内酰胺酶进行内外源性分析的步骤如下：
步骤1)、将500ml生鲜乳采用杯碟法进行β-内酰胺酶检测，分别鉴别阴性样品和阳性样品，所述的阳性样品为含有内源性或外源性β-内酰胺酶的样品，阴性样品则为不含有任何β-内酰胺酶的样品，因此筛选出阳性样品，进行进一步考察。
步骤2)、取步骤1)中筛选出的阳性样品300ml，离心(4℃，6000rpm，15分钟)；将离心后的样品弃上清，取沉淀溶于50mlpbs灭菌溶液(ph7.2±0.2)，吹打数次后离心三次(4℃，6000rpm，15分钟)；取沉淀接种于300ml无抗生素且β-内酰胺酶阴性的灭菌乳(115℃，15分钟)中，25℃±1℃需氧培养6小时后，再次使用杯碟法检测β-内酰胺酶，鉴别出阴性样品和阳性样品。
将阴性样品判定为β-内酰胺酶外源性样品，阳性样品为β-内酰胺酶外源性样品。
采用使用荧光定量pcr检测阳性菌的内源基因检测辅助证实结果，荧光定量pcr结果证明与预期一致。
实施例2
本实施例中对生鲜乳中的β-内酰胺酶进行内外源性分析的步骤如下：
步骤1)将500ml生鲜乳采用杯碟法进行β-内酰胺酶检测，分别鉴别阴性样品和阳性样品，所述的阳性样品为含有内源性或外源性β-内酰胺酶的样品，阴性样品则为不含有任何β-内酰胺酶的样品，因此筛选出阳性样品，进行进一步考察。
步骤2)、取步骤1)中筛选出的阳性样品300ml，离心(4℃，6000rpm，15分钟)；将离心后的样品弃上清，取沉淀溶于50mlpbs灭菌溶液(ph7.2±0.2)，吹打数次后离心三次(4℃，6000rpm，15分钟)。取沉淀接种于300ml无抗生素且β-内酰胺酶阴性的灭菌乳(115℃，15分钟)中，25℃±1℃需氧培养6小时后，再次使用杯碟法检测β-内酰胺酶，分别鉴别出阴性和阳性样品。
步骤3)、将步骤2)中的阴性样品继续放置25℃±1℃需氧培养18小时，再次使用试剂条法检测β-内酰胺酶，鉴别出阴性和阳性样品；阴性样品判定为外源性β-内酰胺酶，阳性样品进一步处理。
步骤4)、将步骤2)中鉴别出的阳性样品和步骤3)中鉴别的阳性样品进行下一步检测：将步骤2)中鉴别出的阳性样品和步骤3)中鉴别的阳性样品分别离心(4℃，6000rpm，15分钟)，将离心后的样品弃上清，取沉淀接种于300ml无抗生素且β-内酰胺酶阴性的灭菌乳(115℃，15秒)中，25℃±1℃需氧培养6小时后，再次使用杯碟法检测β-内酰胺酶，分别鉴别出阴性和阳性样品。阳性样品判定为β-内酰胺酶外源性样品，阴性样品判定为β-内酰胺酶外源性样品。
采用使用荧光定量pcr检测阳性菌的内源基因检测辅助证实结果，荧光定量pcr结果证明与预期一致。
实施例3
本实施例中对生鲜乳中的β-内酰胺酶进行内外源性分析的步骤如下：
步骤1)将500ml生鲜乳采用杯碟法进行β-内酰胺酶检测，分别鉴别阴性样品和阳性样品，所述的阳性样品为含有内源性或外源性β-内酰胺酶的样品，阴性样品则为不含有任何β-内酰胺酶的样品，因此筛选出阳性样品，进行进一步考察。
步骤2)、取步骤1)中筛选出的阳性样品300ml离心(4℃，6000rpm，15分钟)；将离心后的样品弃上清，取沉淀溶于50mlpbs灭菌溶液(ph7.2±0.2)，吹打数次后离心三次(4℃，6000rpm，15分钟)；取沉淀接种于300ml无抗生素且β-内酰胺酶阴性的灭菌乳(115℃，15分钟)中，25℃±1℃需氧培养6小时后，再次使用杯碟法检测β-内酰胺酶，分别鉴别出阴性和阳性样品；其中鉴别的原理在于：在长时间的培养过程中，测定β-内酰胺酶是否有含量的增加，如果β-内酰胺酶增加，则含耐药菌株，如果β-内酰胺酶不增加则证明不含耐药菌株，为阴性样品。
步骤3)、将步骤2)中的阴性样品继续放置25℃±1℃需氧培养18小时，再次使用试剂条法检测β-内酰胺酶，鉴别出阴性和阳性样品；阴性样品判定为外源性β-内酰胺酶；阳性样品进一步处理。
步骤4)、将步骤2)中鉴别出的阳性样品和步骤3)中鉴别的阳性样品分别离心(4℃，6000rpm，15分钟)，将离心后的样品弃上清，分别取沉淀接种于300ml无抗生素且β-内酰胺酶阴性的灭菌乳(115℃，15分钟)中，25℃±1℃需氧培养6小时后，再次检测β-内酰胺酶，鉴别出阴性和阳性样品；阳性样品判定为内源性β-内酰胺酶，阴性样品进一步判定。
步骤5)、将步骤4)中的阴性样品继续放置25℃±1℃需氧培养18小时，再次检测，分别鉴别出阴性和阳性样品；将该步骤中阳性样品为内源性β-内酰胺酶，阴性样品为外源性β-内酰胺酶。
采用使用荧光定量pcr检测阳性菌的内源基因检测辅助证实结果，荧光定量pcr结果证明与预期一致。
实施例4
本实施例中对生鲜乳中进行β-内酰胺酶内外源性分析的步骤如下：
如图2所示，本实施例基本与实施例3相同，不同之处在于：所述步骤4)中，将步骤2)中鉴别出的阳性样品和步骤3)中鉴别的阳性样品接种于β-内酰胺酶阴性的灭菌乳培养之前，首先接种于培养基中培养，具体操作如下：
分别制备血平板，emb平板，bp平板，myp平板。所述血平皿用于检测需氧性的革兰氏阴性和阳性的球菌和杆菌，伊红美兰平皿用于检测大肠菌群，bp平皿用于检测金黄色葡萄球菌，myp平皿用于检测需氧芽孢杆菌。
所述步骤4)中，将步骤2)中鉴别出的阳性样品和步骤3)中鉴别的阳性样品分别离心(4℃，6000rpm，15分钟)，将离心后的样品弃上清，取一菌环沉淀分别无菌接种在上述制备的各个培养基上，25℃±1℃需氧培养24小时后观察菌落形态，将单个菌落继续转接相应培养基分纯培养(25℃±1℃，24小时)，做菌株生化鉴定；采用不同培养基平板可以将生鲜乳中产生的耐药菌株筛选而出进行生化鉴定，对生鲜乳中产生的耐药菌株进行深入的研究，从而为乳制品食品安全的问题提供参考。
挑取一菌环纯培养菌落分别再分别接种到阴性的灭菌乳培养。
以上示意性地对本发明创造及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明创造的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本创造宗旨的情况下，不经创造性地设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本专利的保护范围。