本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)，是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)感染引起的危害极大的传染病。感染者被感染后，机体免疫屏障通常会遭到较为严重的破坏进而易于罹患各种机会性感染和肿瘤以及自身慢性疾病。因而艾滋病成为目前病死率较高的痼疾之一。
hiv-1逆转录酶(reversetranscriptase，rt)在该病毒的复制周期中具有关键性的作用，使其成为抗hiv-1药物研发的重要靶点。作用于rt的抑制剂主要分为核苷类逆转录酶抑制剂(nucleosidereversetranscriptaseinhibitors,nrtis)和非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleosidereversetranscriptaseinhibitors,nnrtis)。其中，nnrtis由于其活性高、选择性强、毒性低等诸多优点，是目前治疗艾滋病高效抗逆转录病毒疗法(haart)重要组成部分。但是nnrtis在临床治疗出现的耐药性、毒副作用以及药代动力学性质差的问题在一定程度上限制了其临床应用。因此，研发新型高效低毒、广谱抗耐药以及具有良好药代动力学性质的新型nnrti是目前抗艾滋病药物研究的重要方向之一。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂及其制备方法，本发明还提供上述化合物作为hiv-1抑制剂的活性筛选结果及其应用。
本发明的技术方案如下：
1.含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂
一种含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂，或其药学上可接受的盐，具有通式i所示的结构：
其中，
x为：o或者mh；
r为：ch3，cn或者ch＝chcn；
r1为：苯基或吡啶基；或卤素、so2nh2、so2ch3、conh2、no2、cn、nh2、cf3、nhch3、oh、cooh、ch2oh、co2me、och3、nhcoch3取代的苯基；取代基为邻、间、对位单取代或多取代；或conr2；
其中，r2为：苯基；或卤素、so2nh2、so2ch3、conh2、no2、cn、nh2、cf3、nhch3、oh、cooh、ch2oh、co2me、och3、nhcoch3取代的苯基；取代基为邻、间、对位单取代或多取代；五元杂环、六元杂环。
根据本发明优选的，含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂是下列化合物之一：
本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式i化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见s.m.birge等，j.pharm.sci.,1977,66,1-19页。
2.含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂的制备方法
含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂的制备方法，步骤包括：以2,4-二氯取代的噻吩并[3,2-d]嘧啶1为初始原料，首先在n,n-二甲基甲酰胺溶液中与取代苯酚或苯胺经亲核取代反应生成中间体2；然后中间体2与n-boc-4-氨基哌啶经亲核取代反应生成中间体3，进而在三氟乙酸中脱去boc保护得到中间体4。然后4与溴丙炔反应生成关键中间体5，进而与叠氮取代基发生一价铜催化的叠氮-末端炔环加成反应(cuaacclick)反应得到目标产物式i化合物。合成路线如下：
试剂及条件:(i)取代苯酚或苯胺，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；(ii)n-boc-4-氨基哌啶，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，110℃；(iii)二氯甲烷，三氟乙酸，室温；(iv)溴丙炔，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；(v)维生素c钠，五水硫酸铜，n,n-二甲基甲酰胺，水，叠氮取代基，50℃；
x、r、r1同上述通式i所示；
所述的取代苯酚或苯胺为：均三甲基苯酚、2,6-二甲基-4-氰基苯酚、2,6-二甲基-4-(e)-氰基乙烯基苯酚、均三甲基苯胺、2,6-二甲基-4-氰基苯胺、2,6-二甲基-4-(e)-氰基乙烯基苯胺；
所述的叠氮取代基为：邻氯苄基叠氮、间氯苄基叠氮、对氯苄基叠氮、邻溴苄基叠氮、间溴苄基叠氮、对溴苄基叠氮、邻氟苄基叠氮、间氟苄基叠氮、对氟苄基叠氮、2,4-二氟苄基叠氮、3,4-二氟苄基叠氮、邻氰基苄基叠氮、间氰基苄基叠氮、对氰基苄基叠氮、邻硝基苄基叠氮、间硝基苄基叠氮、对硝基苄基叠氮、邻甲氧基苄基叠氮、间甲氧基苄基叠氮、对甲氧基苄基叠氮、对甲磺酰基苄基叠氮、间甲磺酰基苄基叠氮、邻甲磺酰基苄基叠氮、对磺酰胺基苄基叠氮、间磺酰胺基苄基叠氮、邻磺酰胺基苄基叠氮、对甲酰胺基苄基叠氮、间甲酰胺基苄基叠氮、邻甲酰胺基苄基叠氮苄、2-叠氮基-1-(吡咯烷-1-基)乙-1-酮、2-叠氮基-n-环丙基乙酰胺、2-叠氮基-1-吗啉-1-酮。
本发明所述的室温为20-30℃。
3.含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂的抗hiv-1活性及应用
本发明对按照上述方法合成的部分含三氮唑环的二芳基嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗hiv-1(iiib)，双耐药突变株res056(k103n/y181c)的活性筛选，以奈韦拉平(nvp)和依曲韦林(etv)为阳性对照。
活性结果如表1所示，多数化合物表现出了极强抗hiv-1iiib活性，ec50值在范围为3.28-10.4nm之间，远优于阳性药物nvp(ec50＝163nm)。其中，化合物a7(ec50＝3.28nm)和a9(ec50＝4.38nm)表现出最好的抗hiv-1iiib活性，优于最新一代上市药物etv(ec50＝5.1nm)。且a7(cc50>210μm，si>64103)和a9(cc50>212μm，si>48544)均具有极低的细胞毒性，表现出了极高的选择性。
本发明的含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂可作为非核苷类hiv-1抑制剂应用。具体地说，作为hiv-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
一种抗hiv-1药物组合物，包括本发明的含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
本发明提供了结构全新的含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂及其制备方法，本发明还提供了化合物抗hiv-1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的含三氮唑环的二芳基嘧啶类衍生物可作为hiv-1抑制剂应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为hiv-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
具体实施方式
通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。
实施例中所涉及的合成路线如下：
实施例1：4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(6)的制备
称取4-羟基-3,5-二甲基苯腈(1.5g,10mmol)和碳酸钾(1.7g,12mmol)于30ml的dmf中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶1(1.9g,10mmol)继续室温搅拌2h(tlc检测反应完毕)。待有大量白色固体生成，慢慢向其中加入100ml冰水，过滤，真空干燥，乙醇中重结晶得中间体6。白色固体，收率93.8％，熔点258-260℃。esi-ms:m/z316.3[m+1]+.c15h10cln3os(315.02).
实施例2：3,5-二甲基-4-((2-(哌啶-4-基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)苄腈(8)的制备
依次将6(0.95g,3.17mmol)，n-boc-4-氨基哌啶(0.83g,3.80mmol)与碳酸钾(0.87g,6.33mmol)加入到20ml的dmf中，然后加热回流10h(tlc检测)。待反应冷却至室温，慢慢将反应液滴加到50ml水中，有大量黄色固体生成。静置30min后过滤，真空干燥得粗品。称取该粗品(1.26g,2.53mmol)溶于4ml二氯甲烷中，加入2.22ml三氟乙酸(30mmol)，室温条件下搅拌3-5h(tlc检测)。然后用饱和的碳酸氢钠溶液调节反应液ph为9，二氯甲烷萃取(3×5ml)，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥。然后快速柱层析分离得中间体8。白色固体，收率84.2％，熔点：114-116℃.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm)δ:8.20(d,j＝5.4hz,1h),7.72(s,1h),7.26(s,1h),6.92(s,1h),3.78(s,1h),2.89(s,2h),2.12(s,6h),1.74-1.78(m,2h),1.23-1.28(m,4h).esi-ms:m/z380.5[m+1]+.c20h21n5os(379.15).
实施例3：3,5-二甲基-4-((2-((1-(丙-2-炔-1-基)哌啶-4-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)苯甲腈(9)的制备
称取中间体8(0.5mmol，0.19g)于5mldmf中，然后依次加入无水碳酸钾(1.0mmol，0.14g)与溴丙炔(0.6mmol，0.07g)，室温条件下反应(tlc检测反应完毕)。反应完全以后，向反应液中加入饱和食盐水20ml,乙酸乙酯洗涤(3×15ml)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。快速柱层析分离，然后在乙酸乙酯-石油醚中重结晶得到目标化合物9。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.3hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),7.72(s,2h,c3,c5-ph-h),7.27(s,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.88(s,1h,nh),3.69(s,1h),3.22(s,2h,n-ch2),3.13(s,1h,ch≡),2.74(s,2h),2.12(s,6h),1.90–1.30(m,6h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ162.4,160.5,153.4,133.2,132.9,123.7,119.0,109.0,75.9,51.3,46.6,31.5,16.2.esi-ms:m/z418.5[m+1]+.c23h23n5os(417.16).
实施例4：目标化合物a1-a10的制备
将9(0.5mmol)和不同的叠氮取代基(0.6mmol)加入到dmf/h2o混合溶剂(v/v＝1:1,10ml)中。然后向此混合溶液中加入1m的新鲜配置的维生素c钠(0.1mmol)水溶液与质量分数为7.5％的cuso4·5h2o(0.1mmol)的水溶液。加热至50℃并搅拌4-12h(tlc检测)。反应完生成大量沉淀，过滤，用水洗涤滤饼，干燥。然后在甲醇溶液中重结晶得到目标产物a1-a10。
4-((2-((1-((1-(2-氰基苄基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(a1)
白色固体，收率92％，熔点149-151℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),8.08(s,1h,triazol-h),7.92(dd,j＝7.7,1.4hz,1h,c3-ph’-h),7.73(d,j＝1.5hz,1h,c5-ph’-h),7.72(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.60–7.55(m,1h,c6-ph’-h),7.36(d,j＝7.8hz,1h,c4-ph’-h),7.26–7.25(m,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.88(s,1h,nh),5.80(s,2h,triazol-ch2),3.71(s,1h),3.56(s,2h,n-ch2),2.80(s,2h),2.11(s,6h),1.72-1.53(m,3h),1.45–1.39(m,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ162.4,153.4,139.4,134.3,133.8,133.2,133.0,129.8,129.6,124.9,119.0,117.4,111.6,109.0,52.9,52.3,51.4,39.6,31.5,16.2.esi-ms:m/z576.6[m+1]+.c31h29n9os(575.22).
4-((2-((1-((1-(4-氰基苄基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(a2)
白色固体，收率90％，熔点140-142℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.3hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),8.13(s,1h,triazol-h),7.86(d,j＝8.0hz,2h,c3,c5-ph’-h),7.72(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.44(d,j＝7.5hz,2h,c2,c6-ph’-h),7.27(s,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.87(s,1h,nh),5.73(s,2h,triazol-ch2),3.72–3.71(s,1h),3.54(s,2h,n-ch2),2.79(s,2h),2.11(s,6h),1.91–1.57(m,4h),1.45–1.39(s,2h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ162.4,153.4,139.4,134.3,133.8,133.2,133.0,129.8,129.6,124.9,119.0,117.4,111.6,109.0,52.9,52.3,51.4,39.6,31.5,16.2.esi-ms:m/z576.6[m+1]+.c31h29n9os(575.22).
3,5-二甲基-((2-((1-((1-(2-硝基苄基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)苄腈(a3)
白色固体，收率93％，熔点155-157℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.21(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),8.19–8.17(m,1h),8.01(s,1h,triazol-h),7.72(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.62–7.55(m,2h),7.32–7.31(m,2h),7.26–7.24(m,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.88(s,1h,nh),5.80(s,2h,triazol-ch2),3.70(s,1h),3.52(s,2h,n-ch2),2.80(s,2h),2.11(s,6h),1.85-1.60(m,4h),1.42–1.31(m,2h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ162.4,153.4,139.7,134.3,133.8,133.2,133.0,129.8,124.9,119.0,117.4,111.6,109.0,52.9,52.3,51.3,39.6,31.5,16.2.esi-ms:m/z596.4[m+1]+.c30h29n9o3s(595.21).
3,5-二甲基-((2-((1-((1-(2-甲基苄基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)苄腈(a4)
白色固体，收率88％，熔点114-116℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),7.91(s,1h,triazol-h),7.71(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.28–7.18(m,4h),7.05(d,j＝7.4hz,1h),6.87(s,1h,nh),5.58(s,2h,triazol-ch2),3.68(s,1h),3.52(s,2h,n-ch2),2.77(s,2h),2.30(s,3h),2.11(s,6h),1.90–1.39(m,6h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ162.4,153.4,136.6,134.8,133.2,130.8,128.9,128.7,126.7,124.9,119.0,117.4,111.6,109.0,53.0,52.3,51.3,39.6,31.5,19.1,16.2.esi-ms:m/z565.6[m+1]+.c31h32n8os(564.24).
3,5-二甲基-((2-((1-((1-(4-甲基苄基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)苄腈(a5)
白色固体，收率84％，熔点112-114℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),7.98(s,1h,triazol-h),7.71(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.25–7.12(m,5h),6.87(s,1h,nh),5.51(s,2h,triazol-ch2),3.68(s,1h),3.50(s,2h,n-ch2),2.76(s,2h),2.28(s,3h),2.11(s,6h),1.87–1.62(m,3h),1.50–1.39(m,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ162.4,153.4,139.4,137.8,134.3,133.6,133.2,129.7,128.3,124.9,119.0,117.8,109.0,52.9,52.3,31.5,21.1,16.2.esi-ms:m/z565.6[m+1]+.c31h32n8os(564.24).
4-((4-((4-((4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)甲基)苯磺酰胺(a6)
白色固体，收率93％，熔点186-188℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),8.07(s,1h,triazol-h),7.82(d,j＝8.2hz,2h,c3,c5-ph’-h),7.72(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.46(d,j＝8.0hz,2h,c2,c6-ph’-h),7.38(s,2h,so2nh2),7.26(s,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.87(s,1h,nh),5.67(s,2h,triazol-ch2),3.69(s,1h),3.52(s,2h,n-ch2),2.76(s,2h),2.11(s,6h),1.89–1.52(m,4h),1.46–1.22(m,2h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ162.4,153.4,144.5,144.2,140.4,139.4,133.2,133.0,129.8,128.7,126.5,124.5,119.0,117.6,112.1,109.0,53.1,52.5,52.4,39.6,31.6,16.2.esi-ms:m/z530.5[m+1]+.c30h31n9o3s2(629.20).
4-((4-((4-((4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)甲基)苯甲酰胺(a7)
白色固体，收率91％，熔点200-202℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),8.05(s,1h,triazol-h),7.86(d,j＝8.0hz,2h,c2,c6-ph’-h),7.71(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.40(s,1h,conh2),7.34(d,j＝8.0hz,2h,c3,c5-ph’-h),7.27(s,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.87(s,1h,nh),5.63(s,2h,triazol-ch2),3.69(s,1h),3.51(s,2h,n-ch2),2.77(s,2h),2.11(s,6h),1.91–1.72(m,3h),1.51–1.23(m,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ167.8,165.4,162.8,153.1,144.5,139.7,134.4,133.2,133.0,128.3,128.0,126.1,124.4,119.0,117.1,112.5,109.8,53.12,52.7,52.4,39.6,31.6,16.2.esi-ms:m/z594.6[m+1]+.c31h31n9o2s(593.23).
2-(4-((4-((4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-n-(4-(甲基磺酰基)苯基)乙酰胺(a8)
白色固体，收率93％，熔点173-175℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.93(s,1h,conh),8.20(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),8.00(s,1h,triazol-h),7.90(d,j＝8.7hz,2h,c3,c5-ph’-h),7.82(d,j＝8.7hz,2h,c2,c6-ph’-h),7.72(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.28(s,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.88(s,1h,nh),5.38(s,2h,triazol-ch2),3.62–3.48(m,3h),3.18(s,3h),2.85–2.82(m,2h),2.11(s,6h),1.91–1.55(m,4h),1.43–1.17(m,2h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ165.7,162.4,153.4,143.3,140.3,139.8,135.6,133.2,128.8,126.5,124.5,119.5,117.1,112.5,109.8,52.6,52.3,44.2,39.4,31.6,16.2.esi-ms:m/z672.3[m+1]+.c32h33n9o4s2(671.21).
3,5-二甲基-4-((2-((1-((1-(2-吗啉代-2-氧代乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)苄腈(a9)
白色固体，收率93％，熔点228-230℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),7.84(s,1h,triazol-h),7.72(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.27(s,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.87(s,1h,nh),5.44(s,2h,triazol-ch2),3.64(d,j＝4.8hz,2h),3.59–3.52(t,j＝4.9hz,3h),3.53(d,j＝5.2hz,4h),3.46(d,j＝4.8hz,2h),2.79(s,2h),2.11(s,6h),1.90–1.51(m,4h),1.47–1.23(m,2h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ165.0,162.3,153.7,143.3,140.3,139.8,135.6,133.2,125.8,117.5,112.1,109.6,66.4,66.3,53.1,52.3,50.9,45.1,42.3,31.6,16.2.esi-ms:m/z588.5[m+1]+.c29h33n9o3s(587.24).
3,5-二甲基-4-((2-((1-((1-(2-氧代-2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)甲基)苯甲腈(a10)
白色固体，收率91％，熔点219-221℃。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝5.4hz,1h,c6-thienopyrimidine-h),7.84(s,1h,triazol-h),7.72(s,2h,c3,c5-ph”-h),7.27(s,1h,c7-thienopyrimidine-h),6.87(s,1h,nh),5.31(s,2h,triazol-ch2),3.69(s,1h),3.52(t,j＝6.8hz,4h),3.51–3.47(s,2h,n-ch2),3.40–3.24(m,4h),2.79(s,2h),2.11(s,6h),2.02–1.62(m,4h),1.53–1.39(s,2h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ164.2,162.1,153.0,143.6,140.1,139.5,135.6,133.2,133.0,125.7,119.0,53.0,52.3,51.6,46.2,45.5,39.6,31.6,26.0,24.1,16.2.esi-ms:m/z572.5[m+1]+.c29h33n9o2s(571.25).
实施例5：目标化合物的体外抗hiv活性测试实验
测试原理：
化合物体外抗hiv活性筛选采用mtt法。mtt全称为溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮，可用于检测细胞的存活和生长。检测原理为：mtt可以与活的细胞内琥珀酸脱氢酶结合还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。二甲基亚砜可以溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测其在540nm下的吸光度(a)值可以间接的反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。
由于hiv感染的mt-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向hiv感染的mt-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用mtt分析法测定mt-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度ec50，同时得到目标化合物使50％未感染hiv的细胞发生病变的浓度cc50，计算出选择系数si(si＝cc50/ec50)。
测试材料和方法：
(1)hiv-1(iiib)、hiv-2(rod)毒株、hiv-1双突变株res056：由比利时鲁汶大学医学院rega研究所提供。
(2)mt-4细胞：由比利时鲁汶大学医学院rega研究院提供。
(3)mtt：购自美国sigma公司。
(4)样品处理：样品临用前溶于dmso配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。
(5)阳性对照药：奈韦拉平(nvp)和依曲韦林(etv)。
(6)测试方法：样品稀释后加入到hiv感染mt-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用mtt比色法测定细胞活力，用酶标仪中记录在540nm下的吸光度(a)值，计算出ec50，cc50以及si。
(7)mtt比色法：加入样品溶液培养一段时间后，向每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，继续培养若干小时后，弃染色液，并向每孔加入150μldmso，用酶标仪中测定540nm下的吸光度(a)值。
实验方法：
50μl含1×104mt-4细胞培养液加入96孔细胞培养板，加入20μl感染hiv-1(iiib、单突变株或双突变株)或hiv-2(rod)的mt-4细胞混悬液或者空白培养基，加入不同浓度的待测化合物或阳性对照药物溶液，每个浓度设3个复孔。细胞在5％co2氛围，37℃下培养5天，向每孔加入20ml(5mg/ml)mtt溶液，继续培养2小时，然后加入dmso，测定反应溶液在540nm处的吸收度，计算化合物不同浓度下的细胞增值率p％。同时设空白和阳性药物对照组，由此计算化合物保护50％的细胞免于hiv诱导的细胞病变所需浓度(ec50)，使50％未感染hiv的细胞发生病变的浓度(cc50)。选择指数的计算：si＝cc50/ec50。
按照上述实验方法对合成的部分含三氮唑环的二芳基嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗hiv-1(iiib)以及双突变株res056(k103n/y181c)的活性筛选，活性结果如表1所示。
表1.部分含三氮唑环的二芳基嘧啶类类化合物抗hiv活性、毒性及选择指数
aec50:抑制50％的病毒诱导的致细胞突变效应的化合物浓度或保护50％感染病毒的细胞免于细胞病变的化合物浓度。
bcc50：使50％未感染hiv的细胞发生病变的浓度。
csi:选择系数，cc50/ec50的比值。