本发明属于有机小分子荧光探针领域，涉及一种对粘度响应能够靶向线粒体的近红外发射荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术：
粘度是反应溶液粘稠度的一种指标，主要取决于物质在溶液中的扩散速度。在生物体系中，粘度极大的影响细胞内信号运输、大分子之间的相互作用以及活性代谢物的扩散。因此，细胞内粘度的变化与生理功能和疾病的产生密切相关。文献报道，正常细胞质中的粘度约1-2cp，而病变的细胞中粘度显著升高，可以达到140cp，甚至更高。线粒体是能量产生的主要舱室，粘度的增加可以通过降低线粒体膜的流动性，产生更多的活性氧物质，导致机体处于病理状态，比如，阿尔兹海默症和帕金森病。因此，测量或者检测细胞内粘度变化具有重要的意义，发展一种有效的方法将有助于了解细胞内反应动力学的机制，为进一步设计疾病的诊断和治疗策略提供有效工具。
目前，对粘度检测方法有毛细管粘度计、落球粘度计、旋转粘度计。但是，这些检测方法操作繁琐，工作效率低，检测误差较大，而且无法实现对生物样品的无损伤检测，这些因素也就限制了它们在生物样品中的应用。荧光探针结合成像技术可以有效地避免上述缺陷，而且能够实时对细胞中粘度进行检测，具有较高的时间和空间分辨率。针对粘度的分子荧光探针已有文献报道，但这些常见的荧光探针对粘度响应较差，而且激发与发射波长较短，也就限制了他们对活体粘度的检测。
技术实现要素：
针对现有粘度探针对粘度响应差、激发与发射波长较短的问题，本发明提供一种靶向线粒体的近红外发射的粘度荧光探针（tpe-vis），并对该探针进行生物成像。利用本发明的探针对细胞中的粘度进行评估。该探针选择性好、灵敏度高。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种靶向线粒体的粘度荧光探针，简称为tpe-vis，其结构式如式（i）所示：
式（i）。
一种上述粘度荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）化合物1的制备：在密闭无氧环境下，将三苯溴乙烯，4-甲酰基苯基硼酸溶于四氢呋喃和去离子水中，在pd(pph3)4，碳酸钾和四丁基溴化铵催化下，加热反应，然后经分离、纯化得化合物1：
（2）化合物tpe-vis的制备：步骤（1）所得化合物1与2,3,3-三甲基-3h-吲哚盐在氮气保护下于乙醇和氢氧化钠中加热回流反应，经分离、纯化得探针tpe-vis：
步骤（1）中，所述三苯溴乙烯与4-甲酰基苯基硼酸的摩尔比为5：6。
步骤（1）中，所述反应温度为80℃，反应时间为10h。
步骤（1）中所述分离、纯化步骤为：将反应液减压蒸馏，加入二氯甲烷：饱和食盐水（2：1）的混合液，萃取后，用无水硫酸钠干燥，以乙酸乙酯：石油醚（1:10，v/v）为淋洗液进行柱层析纯化。
步骤（2）中，所述化合物1与2,3,3-三甲基-3h-吲哚盐的摩尔比为1：1。
步骤（2）中，所述反应温度为85℃，反应时间为6h。
步骤（2）中，所述分离、纯化步骤为：将反应液减压蒸馏，用二氯甲烷萃取后，以二氯甲烷：甲醇（20:1，v/v）为淋洗液进行柱层析纯化。
上述荧光探针在检测溶液和细胞线粒体粘度中的应用；应用于溶液中时，激发波长为460nm，发射波长为650nm；应用于细胞时，激发波长为488nm，发射波段为570-620nm。
上述荧光探针的反应机理如下：
本发明所述的近红外发射荧光探针（tpe-vis）以四苯乙烯为荧光团，与吲哚盐连接，利用分子转子的特点（在粘度低的溶液中，分子能够自由旋转，电子通过非辐射跃迁回到基态，荧光淬灭，而在高粘度溶液中，限制了分子的自由旋转，荧光增强），由于双键的自由旋转，能够实现对粘度的检测。随着粘度的增强，近红外发射荧光强度增强，且对粘度响应具有专一性：
本发明的有益效果为：
本发明根据分子转子的特点（在粘度低的溶液中，分子能够自由旋转，电子通过非辐射跃迁回到基态，荧光淬灭，而在高粘度溶液中，限制了分子的自由旋转，荧光增强。）设计合成了近红外发射荧光探针（tpe-vis）。该探针以四苯乙烯为荧光团，与吲哚盐连接。由于双键的自由旋转，能够实现对粘度的检测。随着粘度的增强，近红外发射荧光强度增强，在甘油中增强倍数高达100倍左右，说明该探针能够高灵敏的响应粘度。选择性实验证明该探针对生物体中其他物质没有响应，也就是说能够专一性响应粘度。此外，该探针成功用于检测细胞线粒体中的粘度。在生物体分析检测中显示出很大的优越性。
本发明所述的近红外发射荧光探针（tpe-vis）对粘度响应具有专一性，可用于荧光检测溶液与细胞线粒体中的粘度变化，抗多种离子、氨基酸、活性氧的干扰，具有较好的特异性。其合成方法步骤少、收率高。
附图说明
图1是探针的1hnmr谱(a)和13cnmr谱(b)；
图2是探针tpe-vis检测不同粘度的荧光光谱实验；
图3是探针在不同溶剂中的荧光光谱实验；
图4是探针的选择性实验；
图5是探针对细胞中粘度的成像应用；
图6是探针在细胞中定位实验。
具体实施方式
下面通过实例和附图对本发明进行说明，但本发明不受实例的限制，实施例中的化合物号码对应上述化合物中的号码。
实施例1靶向线粒体检测粘度的近红外发射荧光探针的合成
（1）化合物1的合成：
三苯溴乙烯（335mg，1mmol），4-甲酰基苯基硼酸（181mg，1.2mol），pd(pph3)4（62mg，0.05mmol），碳酸钾（166mg，1.2mmol）与四丁基溴化铵（tbab，2mg）加入密封管中，除氧后，注射5ml四氢呋喃，6ml去离子水。上述溶液在80℃下反应过夜，反应结束后，降至室温，减压蒸馏，加入一定量二氯甲烷和饱和食盐水，萃取，用无水硫酸钠干燥，粗产品柱层析纯化（乙酸乙酯：石油醚=1:10，v/v）得到化合物1（淡黄色固体，产率80%）；
（2）化合物tpe-vis的合成：
化合物1（0.2g，0.66mmol），2,3,3-三甲基-3h-吲哚盐（0.24g，0.66mmol）与1mg氢氧化钠溶于20ml乙醇中，氮气保护下，回流反应6h，降至室温，减压蒸馏，加入20ml二氯甲烷萃取，得粗产品，柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇=20:1）得到红色固体tpe-vis（0.3g，产率70%）；
1hnmr(400mhz,dmso)δ9.01(d,j=16.4,1h),8.48(m,3h),8.36(m,1h),8.28(d,j=16.4,1h),8.148(m,2h),7.58(m,17h),5.37(q,j=7.2,2h),2.38(s,6h),2.06(t,j=7.2,3h).13cnmr(101mhz,dmso)δ206.75,154.46,144.68,143.72,143.63,143.44,133.12,132.52,131.55,131.41,130.71,130.30,130.29,129.89,128.48,128.22,127.61,127.38,123.58,115.70,112.55,53.24,43.44,25.98,13.90。
实施例2探针tpe-vis检测不同粘度的荧光光谱实验
配制浓度为1mm的实施例1中所得探针tpe-vis的dmso溶液，作为测试母液待用；
配制探针终浓度为10μm，与不同粘度的溶液（水与甘油体积比分别10:0、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0）作用，进行荧光检测（λex=460nm）。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与粘度标准曲线（图2a）。以logη（η为粘度值）为横坐标，logi650nm为纵坐标作图2b。由2a可知，随着粘度的增加，650nm处的荧光强度逐渐增加，当探针在纯甘油中时，体系荧光强度增强倍数很高，约100倍。由2b可知，荧光强度与粘度存在良好的线性关系，说明荧光探针tpe-vis能够对粘度变化进行检测。
实施例3探针在不同溶剂中的荧光光谱实验
配制浓度为1mm的实施例1中所得探针tpe-vis的dmso溶液，作为测试母液待用；
配制探针终浓度为10μm，加入不同溶剂（二氧六环、丙酮、乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、水、四氢呋喃、甘油、乙醇、甲醇）后进行荧光检测（λex=460nm），得各体系的荧光强度。以波长为横坐标，以不同溶剂的荧光强度为纵坐标作图3。由图3可知，探针在不同溶剂与在纯甘油体系中相比，荧光强度变化很弱，说明该探针对溶剂极性基本不响应。
实施例4探针的选择性实验
配制浓度为1mm的实施例1中所得探针tpe-vis的dmso溶液，作为测试母液待用；
配制探针终浓度为10μm，加入不同生物活性分子（牛血清蛋白、氯化钙、氯化镁、硫酸铜、半胱氨酸、谷胱甘肽、双氧水、次氯酸、硫化钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸铁、氯化锌、碘化钾、高半胱氨酸、二叔丁基过氧化物、醋酸钠、氟化钠、叔丁基过氧化氢、氯化钠、探针-tpe-vis）在pbs溶液中进行荧光检测（λex=460nm）。此外，本发明所述的探针溶于甘油中，进行荧光检测（λex=460nm），得各体系的荧光强度。以波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图4a，以对应的活性分子为横坐标，650nm下的荧光强度为纵坐标作图4b。由图4可知探针与其他活性分子作用，荧光强度基本没有增强，但在甘油中荧光强度有明显的增强，说明该探针能够特异性响应粘度。
实施例5探针对细胞中粘度的成像应用
将适当密度的hela细胞接种到两个灭菌的35mm成像培养皿中，在co2培养箱（温度为37℃，5%co2）中培养，待细胞贴壁后，分为三组实验：第一组，向培养皿中加入实施例1所得的荧光探针tpe-vis，使其终浓度均为10μm，作用30min后进行成像。第二组，向培养皿中加入粘度刺激剂-制霉菌素，培养40min后加入实施例1所得的荧光探针tpe-vis，继续作用30min后进行成像。第三组，向培养皿中加入粘度刺激剂-莫能菌素，培养40min后加入实施例1所得的荧光探针tpe-vis，继续作用30min后进行荧光成像（激发波长为488nm，检测波段为570-620nm）。由图5可知，只加入探针时，细胞具有较弱的红色荧光，加入莫能菌素或制霉菌素后，细胞红色荧光明显增强，说明本发明荧光探针tpe-vis能够进入细胞中并检测细胞中的粘度。
实施例6探针在细胞中定位实验
细胞培养步骤与实施例5一致，待细胞贴壁后，加入实施例1所得的荧光探针tpe-vis，探针终浓度为10μm，作用30min后，加入商业线粒体染料-mito-trackergreen作用10min后进行成像。由图6可知，商业线粒体染料与本发明所述的粘度荧光探针在细胞中重合度较高，皮尔森系数高达0.95，说明该探针成功定位于线粒体中。