本发明涉及鉴定atp5b基因启动子活性区域的方法，还涉及鉴定调控atp5b基因启动子转录活性的调控元件的方法。
背景技术：
atp5b(腺嘌呤核苷三磷酸5b，adenosinetriphosphate5b)是atp合酶β亚基编码的蛋白，对于整个酶来讲，β亚基是催化亚单位，在真核细胞中，其催化atp合成的限速反应，是细胞能量代谢过程中氧化磷酸通路上的重要蛋白。有研究发现，atp合酶的α、β亚基存在于3t-3l1前体脂肪细胞质膜表面，细胞质膜内atp合酶在脂肪细胞转化过程中表达量显著增加。arakaki等在脂肪分化过程中，应用atp合酶的不同小分子抑制剂、抗α/β亚基的特异性抗体作用于细胞，结果发现细胞质中脂质小滴积累量明显减少。肝细胞表层atp5b作为富含载脂蛋白ai或载脂蛋白e的高密度脂蛋白的受体，在hdl的代谢机理和atp的生物合成中起着重要作用。徐等研究发现，atp5b基因多态性与肌内脂肪含量呈显著相关。而且在瘦肉型和脂肪型猪中的atp5b基因的蛋白表达量存在显著差异。认为atp5b基因可能在肌内脂肪形成过程中起着重要作用。但目前关于牛atp5b基因的转录调控机制未见报道。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴定调控atp5b基因启动子转录活性的调控元件的方法，并确定了myod和gata转录因子结合位点维持atp5b启动子基本转录活性。
本发明提供鉴定atp5b基因启动子活性区域的方法，包括以下步骤：
(1)克隆atp5b基因启动子序列；
(2)构建atp5b基因5′端启动子系列缺失片段荧光素酶报告载体：pgl-1972/-76(p1)、pgl-1682/-76(p2)、pgl-1370/-76(p3)、pgl-1067/-76(p4)、pgl-753/-76(p5)、pgl-539/-76(p6)、pgl-220/-76(p7)；
(3)将步骤(2)的atp5b基因5′端启动子系列缺失片段荧光素酶报告载体分别进行转染细胞，进行荧光素酶活性分析，若相邻两个缺失片段间启动子活性发生显著变化，则表明atp5b基因启动子活性区域在该相邻两个缺失片段之间的区域。
作为优选，步骤(1)中，所述克隆atp5b基因启动子序列具体为：根据atp5b基因5′utr序列，以5′-race鉴定的转录起始位点为+1位，设计atp5b基因启动子特异性引物，对atp5b基因启动子进行pcr扩增，目的片段为从启动子序列-1972位到-76位。
作为优选，所述特异性引物为：
上游引物为f1:5'-cagtcttctccttattcctctgcta-3′；
下游引物为r1：5'-tctgcttatcactctgggcg-3′。
作为优选，步骤(2)中，所述构建atp5b基因5′端启动子系列缺失片段荧光素酶报告载体的具体方法为：将atp5b基因启动子序列的克隆产物胶回收，并与
作为优选，所述系列引物为：
本发明还提供鉴定调控atp5b基因启动子转录活性的调控元件的方法，包括以下步骤：
(1)克隆atp5b基因启动子序列；
(2)构建atp5b基因5′端启动子系列缺失片段荧光素酶报告载体：pgl-1972/-76(p1)、pgl-1682/-76(p2)、pgl-1370/-76(p3)、pgl-1067/-76(p4)、pgl-753/-76(p5)、pgl-539/-76(p6)、pgl-220/-76(p7)；
(3)将步骤(2)的atp5b基因5′端启动子系列缺失片段荧光素酶报告载体分别进行转染细胞，进行荧光素酶活性分析，确定atp5b基因核心启动子活性区域；
作为优选，步骤(1)中，所述克隆atp5b基因启动子序列具体为：根据atp5b基因5′utr序列，以5′-race鉴定的转录起始位点为+1位，设计atp5b基因启动子特异性引物，对atp5b基因启动子进行pcr扩增，目的片段为从启动子序列-1972位到-76位；作为优选，所述特异性引物为：
上游引物为f1:5'-cagtcttctccttattcctctgcta-3′；
下游引物为r1：5'-tctgcttatcactctgggcg-3′。
作为优选，步骤(2)中，所述构建atp5b基因5′端启动子系列缺失片段荧光素酶报告载体的具体方法为：将atp5b基因启动子序列的克隆产物胶回收，并与
作为优选，所述系列引物为：
(4)分析atp5b基因核心启动子活性区域内的转录因子结合位点，设计突变转录因子结合位点特异引物，对转录因子结合位点分别进行定点突变，根据突变后的atp5b基因启动子活性变化情况确定调控atp5b基因启动子转录活性的调控元件：若对转录因子结合位点突变后，启动活性显著变化则说明该转录因子结合位点是调控atp5b基因启动子转录活性的调控元件。
作为优选，步骤(4)中，所述突变转录因子结合位点特异引物为
本发明通过荧光素酶活性分析方法鉴定了atp5b基因启动子活性区域，并进一步鉴定调控atp5b基因启动子转录活性的调控元件，确定了myod和gata转录因子结合位点是调控atp5b基因启动子转录活性的调控元件。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为牛atp5b基因启动子扩增。
图2为pgl-atp5b不同片段kpni和smai双酶切鉴定结果。
图3为atp5b基因启动子重组报告质粒在c2c12和3t3l1细胞系中的启动子活性。
图4为mmyod和gata转录因子结合位点突变分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
一、atp5b基因启动子的荧光素酶活性分析
1、启动子引物设计
根据genebank中atp5b基因5′utr序列，以5′-race鉴定的转录起始位点为+1位，通过clonemanage软件设计基因特异引物：
上游引物为forwardprimerf1：5'-cagtcttctccttattcctctgcta-3′
下游引物为reverseprimerr1：5'-tctgcttatcactctgggcg-3′。
以牛基因组dna为模板进行pcr扩增，目的片段从启动子序列-1972位到-76位共计1897bp。在200μlpcr管中依次加入1.2μl(100ng)dna摸板、0.4μlkod-plus-ver2.0(1u/μl)、2μl10×pcrbuffer、2μldntp(2mmol/l)、0.8μlmgso4(25mol/l)、0.6μlforwardprimerf1(10μm)、0.6μlreverseprimerr1(10μm)、12.4μlddh2o，共计20μl，涡旋震荡离心后放入pcr仪中进行反应，反应条件如下：预变性95℃5min，变性97℃20s，退火63.5℃30s，延伸72℃2.1min，35个循环，最后72℃8min。
2、启动子扩增片段回收、连接及转化
pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段1897bp，按照dna胶回收试剂盒说明操作，进行切胶回收目的片段。回收目的片段与
3、提取质粒
将步骤2离心管中扩繁的大肠杆菌进行菌液pcr扩增，经鉴定阳性克隆菌液送南京金斯瑞测序。测序结果如下：
其中，上述序列第1-1897位碱基为pcr扩增目的片段，加粗部分分别为上下游引物，方框处碱基为转录起始位点。
对于测序正确的菌液参照omega公司操作说明书小提中量试剂盒提取质粒，得到
4、atp5b基因5′端启动子系列缺失荧光素酶报告载体构建
(1)引物设计
以步骤3制备得到的
表1牛atp5b基因启动子缺失片段扩增
(2)5′侧翼序缺失片段扩增
在200μlpcr管中依次加入12.6μlddh2o、0.6μl上游引物(10μm)、0.6μl下游引物(10μm)、0.8μlmgso4(25mol/l)、2μldntp(2mmol/l)、2μl10×pcrbuffer、0.4μlkod-plus-ver2.0(1u/μl)和1.0μl模板dna(
(3)系列缺失荧光素酶报告基因载体构建
将步骤(2)扩增获得的系列pcr产物分别进行纯化，然后分别用kpni和smai双酶切消化，接着与双酶切过的pgl3-basic载体进行连接、转化后进行菌液pcr阳性克隆鉴定和测序。进而得到牛atp5b基因5′端启动子系列缺失报告质粒，分别命名为pgl-1972/-76(p1)、pgl-1682/-76(p2)、pgl-1370/-76(p3)、pgl-1067/-76(p4)、pgl-753/-76(p5)、pgl-539/-76(p6)、pgl-220/-76(p7)。
其中，将纯化后的pcr产物分别用kpni和smai双酶切消化，接着与双酶切过的pgl3-basic载体进行连接、转化后进行菌液pcr阳性克隆鉴定和测序的具体步骤为：
将纯化后的pcr扩增产物以及报告基因pgl3-basic进行kpni和smai的进行双酶切鉴定。反应体系中依次加入ddh2o、10×quickcutgreenbuffer、quickcutkpni、quickcutsmai，最后加入pcr扩增产物或pgl3-basic载体，震荡混匀离心，37℃水浴3h进行消化反应，反应体系见表2。
表2酶切体系
将上述酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，然后切胶回收纯化。参照neb公司t4连接酶说明书，在反应体系中依次加入5μl(50ng)酶切后的
表3连接体系
将连接产物进行转化、阳性克隆菌液pcr鉴定、送测序，详细步骤同步骤2和步骤3。对测序结果正确的菌液提取质粒，得到atp5b系列荧光素酶报告基因载体。
提取质粒按照omega公司提取质粒试剂盒说明书进行：
(1)将测序正确菌液接种到15ml氨苄培养基中，37℃摇床培养16h；
(2)室温下10000×g离心1min收集细菌；
(3)弃掉培养基，加入500μlsolutionⅰ/rnase混合液，涡旋振荡使细胞完全悬浮；
(4)往重悬混合液中加入500μlsolutionⅱ，轻轻颠倒混匀4-6次。此操作避免剧烈混匀裂解液，且裂解反应不要超过5min；
(5)加入700μlsolutioniii，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；
(6)室温下，以≥12000×g离心10min；
(7)转移上清液至套有2ml收集管的hibinddna结合柱中，室温下以10000×g离心1min，倒去收集管的液体；
(8)把柱子重新装回收集管中，加入500μlhbbuffer，按步骤(7)中条件进行离心，去滤液；
(9)把柱子重新装回收集管中，加入700μldnawashbuffer，按步骤(7)中条件进行离心，弃去滤液；
(10)弃去滤液，重复第九步操作一次；
(11)弃去滤液，把柱子重新装回收集管，12000×g离心空柱2min以甩干柱子基质；
(12)把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入80-100μlelutionbuffer，-20℃保存备用。
5、细胞培养和牛atp5b基因5′端启动子系列报告质粒转染
小鼠c2c12细胞系和3t3-l1细胞系培养在包含体积百分比为90％dmem和体积百分比为10％胎牛血清的培养基中，将生长状态良好的细胞在转染前一天接种至24孔板中，每孔接种密度为1×105个细胞，然后在37℃、5％co2培养箱中培养，待细胞密度达到70～80％时，将牛atp5b基因5′端启动子系列荧光素酶报告基因载体(pgl-1972/-76(p1)、pgl-1682/-76(p2)、pgl-1370/-76(p3)、pgl-1067/-76(p4)、pgl-753/-76(p5)、pgl-539/-76(p6)、pgl-220/-76(p7))转染细胞。转染的同时用prl-tk作为内参质粒，pgl3-basic作为阴性对照质粒，pgl3-control作为阳性对照质粒。顺时转染步骤按照罗氏x-tremegenehp操作说明进行质粒转染，每次转染三个复孔，具体转染步骤如下：
(1)a液的配制：50μlopti-mem+1.6μlx-tremegenehp；
(2)b液的配制：50μlopti-mem+10ng(prl-tk)+800ng(pgl-3)；
(3)a液配制5min后与b液混匀，室温静置20min；
(4)将100μl混合液均匀逐滴加入到每孔中，48h后荧光素酶活性检测。
6、荧光素酶活性分析
(1)配制被动裂解液1×plb：将1倍体积的5×passivelysisbuffer(plb)加到4倍体积的蒸馏水中，混合均匀，4℃保存(≤1个月)；
(2)配制larⅱ：用luciferaseassaybufferⅱ溶液解冻干粉luciferaseassaysubstrate，-20℃保存(≤1年)；
(3)配置一定量1×stop&
(4)吸取步骤5得到的质粒转染后细胞中的培养基，用1×pbs清洗培养的细胞，去掉清洗液；
(5)每孔中加入被动裂解液80μl，室温下摇床200转/min摇15min；
(6)取步骤(5)获得的裂解液20μl到96孔板中，加入50μl萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后在多功能酶标仪上读取荧光强度值(a值)；
(7)接着加入50μl海肾荧光素酶检测试剂，混匀后在多功能酶标仪上读取荧光强度值(b值)；
(8)用a值/b值计算出启动子系列缺失片段的相对转录活性。
二、统计学分析
实验结果以平均数±标准差表示，采用spss16.0统计学分析软件分析处理实验数据，采用单因素方差分析方法进行多组间比较，而组间比较采用lsd-t检验法，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
三、结果
1、atp5b基因启动子扩增
以秦川牛血液基因组dna为模板，设计启动子特异引物，pcr扩增atp5b基因启动子序列，获得约2000bp的pcr产物(图1)，连接
图1为牛atp5b基因启动子扩增结果；其中，m：dl2000dnamarker；1：atp5b基因启动子pcr产物。
2、atp5b基因启动子系列缺失体荧光素酶报告载体构建
为确定牛atp5b基因核心启动子区域，以
图2为pgl-atp5b不同片段kpni和smai双酶切鉴定结果。其中，m：dnamarker；p1：pgl-1972/-76；p2：pgl-1682/-76；p3：pgl-1370/-76；p4：pgl-1067/-76(p4)；p5：pgl-753/-76；p6：pgl-539/-76；p7：pgl-220/-76。
3、确定atp5b基因核心启动子区域
将构建好的含atp5b基因启动子5′端系列缺失片段重组质粒的萤火虫荧光素酶报告基因表达载体、海肾荧光素酶报告基因载体prl-tk作为内参分别共转染3t3l-1和c2c12细胞系，其中空载体pgl-basic作为阴性对照、pgl-control载体作为阳性对照。细胞培养48h后，检测荧光素酶的相对活性。如图3所示，在3t3l1和c2c12细胞系中，pgl-1972/-76质粒启动子相对活性是阴性对照pgl-basic的22和27倍，说明我们克隆牛atp5b基因启动子是一个功能性的启动子。
图3为atp5b基因启动子重组报告质粒在c2c12和3t3l1细胞系中的启动子活性。
一系列atp5b基因5′端缺失启动子片段重组质粒报告基因表达载体的启动子活性趋势在两种细胞系中类似。从启动子-1972位缺失到-539位时，在两种细胞系中启动子活性并没有明显的改变，说明在-1537位到-96位并不存在重要的调控元件；pgl-539/-76启动子在c2c12和3t3l1中的活性是pgl-220/-76的12和11倍，说明牛atp5b基因核心启动子区域位于-220到-539区域内(p<0.01)。
四、确定维持atp5b基因启动子转录活性的调控元件
1、atp5b基因启动子定点突变实验
根据在线软件预测，对牛atp5b基因启动子转录起始位点上游-220bp～-539bp区域的moyd(-309bpto-295bp)，gata(-347bpto-335bp)转录因子结合位点进行定点突变，参照
表4突变质粒的引物
(2)定点突变反应体系
按照
(3)转化及测序
将pcr产物在超级感受态xl10-gold细菌中进行转化。具体步骤见第二部分，测序正确后摇菌、提取质粒-20℃保存备用。
(4)细胞培养及瞬时转染
c2c12细胞培养在含有10％胎牛血清+90％dmem高糖培养液中，在37℃5％co2细胞培养箱中进行传代培养。在转染前24h将细胞接种于24孔板中。采用罗氏试剂(x-tremegenehp)进行瞬时转染，每个质粒转3个孔，具体转染方法与第一部分的第5步骤相同。转染同时prl-tk作为内参质粒，pgl3-basic作为阴性对照质粒，pgl3-control作为阳性对照质粒。
2、实验结果：myod和gata转录因子结合位点维持atp5b启动子基本转录活性
通过构建系列缺失启动子片段载体，转染c2c12和3t3l1细胞进行荧光素酶活性分析后，确定启动子最小活性区域位于-539bp～-76bp区域内，其中在-539bp～-76bp之间存在调控atp5b基因启动子活性的重要元件。利用gemomatix和tfsearch在线软件分析发现atp5b基因启动区域内存在多个潜在的转录因子结合位点，其中包括sreb、cebp、myod、gata、mtbf、mef3等转录因子结合位点。
为进一步研究这些转录因子结合位点在维持atp5b基因启动子活性中的作用，依据各转录因子结合位设计相应的引物对pgl-539/-76质粒进行定点突变，并瞬时转染c2c12细胞。实验结果见图4。
图4为mmyod和gata转录因子结合位点突变分析。
实验结果表明：分别定点突变sreb、cebp、mtbf、mef3转录因子结合位点对atp5b启动子活性无显著影响(p＞0.05)，突变myod和gata转录因子结合位点，启动活性分别下降了70％和55％(p＜0.01)；说明myod和gata录因子结合位点是维持牛atp5b基因启动子基本转录活性必需的调控作元件。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>甘肃农业大学
<120>鉴定atp5b基因启动子活性区域的方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1975
<212>dna
<213>腺嘌呤核苷三磷酸5b(adenosinetriphosphate5b)
<400>1
cagtcttctccttattcctctgctatttcccaagatggtttatttttttctacctgctcc60
atacacattgctgttttcttgggttctttccctcttactaggcaagagtacctgtgtgga120
tgctaagttgctttagacgtgaacttttgggacgctatggactgtaatccaccaggttcc180
tctttccatgggattctccaggcaagaatactggagtgggttgccatgcccttcttcaag240
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gttctcttatgttcctgctttctccttttaagttctttgtagttcttgctaccaaacagt420
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ggggaagtagcttcatgctgacctgcagccatgtttgtcattagccatgtttgttctaat540
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atccagctcccaaataccttaaagtcaatactacattaaaggatgtcctatttattttat660
gatttttcataaatcataaatgtgttttcataaatgtgttttcataaatcataaatgtgt720
tcaaggaccacacacttacctctgccctgcttccactcccatccaaggccctgagaactg780
gttcttctctctgtattcatctctttgctaagtcgcttcagtcctgtccgactctgtgcg840
accccagagatgacagcccaccaggctccccggtccctgggattctccaggcaagaacac900
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tcagtcgtgtccaactcttcgggaccccatggactgcagcctaccaggttcctctgtcca1020
tgggattttccaggcaagagtactggagtggggtgccattgccttctccattcatctctt1080
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aaacatgctgtgtaatacaaatatataatggaatagtcttcctactttaccctaggaatt1200
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ccctgttgtccaattatgtttcaaagttctgagggttgcaccgagccagtcattgtccaa1800
taagaaaaggaattcagattagcacgaattttggccaatgattgagaagatgagagacta1860
ttggcctatagcagcagcgcccagagtgataagcagaaaaattacccaatggccgtgcct1920
actgcagagtgggtctcgcctccaactgctggcagttggaggccagaccgctgca1975