一种快速评估CAR-T细胞体外杀伤效率的方法与流程

本发明涉及细胞免疫学技术领域，具体是通过检测荧光素酶标记的肿瘤靶细胞化学发光信号值，从而推算car-t细胞的杀伤效率。

背景技术

嵌合抗原受体修饰的t细胞(chimericantigenreceptortcells,car-t)治疗技术通过将car基因在体外导入并稳定整合到患者来源t淋巴细胞基因组中，联合单链抗体的靶向作用和t淋巴细胞的效应功能，以非mhc限制性方式高特异性识别细胞表面靶抗原从而杀伤肿瘤靶细胞。car基因通常编码一个用于结合靶抗原的单链抗体可变区片段、跨膜结构域和细胞内信号结构域(如cd3ζ胞内结构域等)。因此，car-t治疗技术的基本原理是依赖抗体与肿瘤细胞膜表面的抗原表位靶点进行特异性结合，激活t细胞的细胞杀伤能力从而清除肿瘤靶细胞。针对不同靶点的car已经被开发，截至目前已有超过250项的car-t治疗恶性肿瘤临床试验在全球范围开展。靶向cd19的car-t技术治疗b细胞恶性肿瘤的基础研究与临床试验已取得里程碑式突破，治疗急性b淋巴母细胞白血病有效率在70％以上，治疗b细胞型非霍奇金淋巴瘤在50％以上。car-t治疗其他肿瘤也显示了良好的应用前景。

如何对car-t细胞的杀伤能力进行功能性检测？目前采用的一种方法是测定car-t细胞杀伤携带抗原表位的细胞系反映其杀伤效率。经典的测定效应细胞对靶细胞杀伤效率的方法包括酶释放法、核素法和化学发光法。酶释放法，如mtt法和乳酸脱氢酶(ldh)释放法，稳定性较差，效应细胞的干扰较大导致灵敏度低；核素法(如铬-51标记)检测较准确，但其操作涉及放射性物质存在安全隐患；化学发光法常用荧光素酶-atp法，需要裂解细胞释放荧光素酶等繁琐手续，检测费时费力。因此，开发一种简便、快速评估car-t细胞杀伤效率的方法是十分必要的。

技术实现要素：

本发明人经过长期地创造性研究，通过大量的筛选和测试，惊奇地发现：荧光素酶标记的肿瘤靶细胞被杀伤后的存活细胞数量与细胞的荧光素酶活力值存在较好的线性关系。car-t细胞与荧光素酶基因稳定转染的肿瘤靶细胞共孵育数小时后，离心沉淀获得存活的肿瘤靶细胞可直接检测其荧光素酶活力，通过设置阳性和阴性对照，可准确计算出car-t细胞的杀伤效率。

在此基础上，本发明人提供了一种非治疗性和非诊断性的简便、快速检测car-t细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率的技术方案，具体步骤包括：

(1)提供一种培养体系，在适合细胞培养的条件下，在所述培养体系中贴壁或悬浮培养肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞为含有car-t细胞特异性识别抗原表位并稳定转染荧光素酶基因的肿瘤靶细胞；

(2)在所述的含有肿瘤靶细胞的培养体系中加入car-t细胞，获得car-t细胞和肿瘤细胞的混合培养体系，共孵育特定的时间；

(3)离心沉淀所述的混合培养体系中的细胞，培养基重悬细胞后，加入荧光素酶底物，检测细胞的荧光素酶活力值，记为k；

(4)步骤(1)所述培养体系中不加入car-t细胞，培养时间与步骤(2)相同，通过步骤(3)方法检测所得荧光素酶活力值为kmin；

(5)步骤(1)所述培养体系中加入细胞裂解液，培养时间与步骤(2)相同，肿瘤细胞得到最大程度的杀伤，通过步骤(3)方法检测所得荧光素酶活力值为kmax；

(6)计算car-t细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率为：

杀伤效率％＝(kmin-k)/(kmin-kmax)x100％。

本发明中，步骤(1)中所述的car-t细胞特异性识别抗原表位，选自cd19、cd20、cd22、cd23、cd30、cd38、cd44v7/8、cd123、cd138、afp、bcma、cll-1、cs-1、cea、ca125、ca199、claudin-18、epcam、egfr、egfrviii、fap、gpc1、gpc3、il-13rα2、integrinβ7、muc1、nectin-4、ny-eso-1、gd2、psma、gp100、vegfr1、vegfr2中的一种或多种；优选为cd19。

本发明中，步骤(1)中所述的荧光素酶，优选但不限于萤火虫荧光素酶。

本发明中，步骤(3)中对所述培养体系离心后，未被杀伤的靶细胞表达荧光素酶，加入荧光素酶底物直接检测细胞的荧光素酶活力值，优选荧光素酶底物为d-荧光素，其浓度优选为0.5mm。

本发明中，步骤(5)中加入细胞裂解液，优选为triton-x100，其浓度优选为2.5％。

本发明的有益效果：

本发明提供一种简便、快速评估car-t细胞对靶细胞杀伤能力的检测方法。本发明区别于现有的荧光素酶-atp法，后者需要绘制细胞数与荧光素酶活力值的标准曲线，再分别收集培养体系上清和细胞沉淀物裂解液，通过含有atp的荧光素酶检测试剂盒测定相应的荧光素酶活力值、进而推算出细胞数目，从而获得杀伤比例。而本发明指出，不对存活靶细胞进行裂解处理，直接加入荧光素酶底物(不含atp)即可检测荧光素酶活力，其与存活靶细胞数量有着较好的线性关系。另外与核素法相比，本发明避免了使用铬-51等同位素的安全隐患。同时，因car-t细胞不表达荧光素酶，存活细胞测得的荧光素酶活力值不受其干扰，故其检测稳定性和准确度均高于现有的mtt法和乳酸脱氢酶(ldh)释放法等。根据本发明，car-t细胞和肿瘤靶细胞混合培养4小时后，仅需半小时即可完成杀伤效率的检测，且不需购买特殊试剂盒。本实验重复性好，结果非常稳定。

附图说明

图1为细胞数与其荧光值的线性关系图；

图2为细胞的荧光值与加入d-荧光素持续时间的关系曲线；

图3为acd19-car-t细胞对cd19-k562细胞的杀伤曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

术语：

术语“cd19-k562”指稳定表达cd19和荧光素酶的k562细胞系，“acd19-car-t”指表达抗cd19单链抗体的t细胞，“mock”指未处理的t细胞作为car-t细胞的阴性对照。

本实施例中，96孔平底不透明白板购自corning公司；d-荧光素购自perkinelmer公司；酶标仪varioskanflash购自thermo公司；triton-x100购自merk公司。

统计学方法：采用graphpadprism软件制图和统计分析，各样本结果用均数±标准误表示，比较采用双因素方差分析(two-wayanova)。

实施例1

检测细胞数与荧光素酶活力值的线性关系

(1)培养cd19-k562细胞至对数生长状态；

(2)96孔平底不透明白板中分别加入1x10⁴、2x10⁴、4x10⁴、6x10⁴、8x10⁴、1x10⁵个cd19-k562细胞，培养基体积为100ul，同时设置三个复孔；

(3)每孔加入0.5mm的d-荧光素，10min后在酶标仪用化学发光模式(luminometricmeasurement)检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms；

(4)统计各孔的荧光强度值，并分析与细胞数的线性关系(结果如图1所示)，从图中可以看出，细胞数与其荧光值有着较好的线性关系。

实施例2

检测加入d-荧光素后，细胞荧光强度与时间的关系

(1)培养cd19-k562细胞至对数生长状态，取一定细胞数离心沉淀后计数；

(2)96孔平底不透明白板中加入1x10⁴个cd19-k562细胞，加入培养基体积为100ul；

(3)每孔加入0.5mm的d-荧光素后1小时，每间隔10min用酶标仪用化学发光模式(luminometricmeasurement)检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms；

(4)统计各孔的荧光强度值，并分析与时间的关系(结果如图2所示)，从图中可以看出，有较好的稳定性。

实施例3

acd19-car-t细胞(效应细胞)对cd19-k562(靶细胞)的杀伤效率检测

(1)培养cd19-k562细胞至对数生长状态，取一定细胞数离心沉淀后计数；

(2)96孔平底不透明白板中加入1x10⁴个cd19-k562细胞，加入培养基体积为100ul；

(3)acd19-car-t细胞与cd19-k562细胞数比例设定为5:1、10:1、20:1和40:1，将相应的car-t细胞加入每孔混合培养；

(4)设置mock细胞组，t细胞的数目与acd19-car-t细胞的数目相同；

(5)同时设置两个对照，阴性对照：为cd19-k562细胞在培养基培养；阳性对照：在培养基加入2.5％的triton-x100，两者均不加mock细胞或car-t细胞，作为细胞杀伤的最小和最大化背景值，即kmin和kmax。

(6)以上每组设3个复孔；

(7)培养4小时后，96孔板以1500rpm速度离心5min，弃掉上清，用培养基洗一次后重悬细胞

(8)每孔加入0.5mm的d-荧光素，10min后在酶标仪用化学发光模式(luminometricmeasurement)检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms；

统计各孔的荧光强度值k，比较car-t与mock细胞对cd19-k562细胞的杀伤效率％，计算公式为：杀伤效率％＝(kmin-k)/(kmin-kmax)x100％(结果如图3所示)，图中显示acd19-car-t细胞对cd19-k562细胞有较好的杀伤效率。