本发明属于生物医药领域，具体的涉及一种磷酸化吡唑类化合物及其制备方法。
背景技术：
蛋白质磷酸化是生物体内一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰形式，这种氨基酸与磷酸基团共价连接的修饰模式对蛋白质结构和功能起到了重要调节作用。例如，微生物的双组分信号转导系统，该系统由跨膜的受体组氨酸激酶(receptorhistidinekinase，rhk)和胞质内的反应调节蛋白(responseregulator，rr)组成。当rhk感应到外界环境刺激后，其保守组氨酸残基发生自磷酸化，随后将磷酸基团转移给rr上的保守天冬氨酸残基。rr发生磷酸化后对下游基因的表达进行调控。研究表明双组分信号转导系统不仅对细菌的基本生命活动有调节作用，还参与调控很多病原菌的毒力和耐药机制的产生，与致病性密切相关，被认为是潜在的药物鞭标。
迄今，人们发现9种天然氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和组氨酸)与羟脯氨酸可被磷酸化。磷酸化的方式主要包含4种模式，即o-磷酸化，n-磷酸化，s-磷酸化和酰基磷酸化。目前，针对磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸与磷酸化酪氨酸结构类似物的合成以及基于其结构类似物的磷酸化抗体的制备研究的比较多。
磷酸化组氨酸是一种广泛存在的磷酸化氨基酸，磷酸化模式为n-磷酸化，但由于磷酸化组氨酸本身的化学不稳定性，其在生物体内的功能研究受到限制。磷酸化组氨酸中磷酸基团与组氨酸咪唑环上的n原子连接形成磷酰胺键，而磷酰胺结构中的p-n化学键本身非常不稳定。从热力学角度，其水解过程的自由能变化(约为-12～-14kcal/mol)较磷酸酯结构(磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸)中的p-o化学键水解过程的自由能变化(约为-6.5～-9.5kcal/mol)高很多；从动力学角度，磷酸化组氨酸对酸较为敏感，在1mol/l盐酸溶液49℃下，游离磷酸化组氨酸的半衰期只有数十秒。因此在传统的研究方法中，磷酸化组氨酸很容易发生水解去磷酸化。
基于磷酸化组氨酸本身的不稳定性，人们考虑设计合成一些结构类似物对其进行模拟。设计合成磷酸化组氨酸结构类似物的主要思路是：(1)合成硫代磷酸化组氨酸及其多肽，该类型化合物在酸性条件下稳定性较高；(2)将咪唑环改造为其他杂环，如呋喃环、三唑环等，将易水解的磷酰胺键改为c-p键。然而，这些结构类似物均存在着一定的局限：(1)单一的组氨酸硫代磷酸化在生物体内无法实现，因为该过程会使所有的组氨酸残基以及其它亲核残基全部硫代磷酸化；此外，硫代磷酸化只能得到n3异构体，在生化反应中，不是所有的组氨酸激酶都可以使用γ-35s-atp和γ-35s-thio-gtp作为底物。(2)基于呋喃环和三唑环的结构类似物，虽解决了n-p键稳定性较差的问题，但它们的环结构与天然组氨酸相差较大，以其作为半抗原制备组氨酸磷酸化蛋白的抗体时，所得抗体的特异性相对较差。由于以上缺点，现有的组氨酸结构类似物还无法在磷酸组氨酸蛋白质译后修饰体的分离和检测方面得以深入应用，磷酸组氨酸蛋白质译后修饰体的功能依然未知。
技术实现要素：
为弥补现有技术的不足，本发明以吡唑环为结构基础，以性质稳定的c-p键替代n-p键，设计并合成一系列与磷酸化组氨酸结构类似、性质稳定的磷酸化吡唑类化合物，为开发具有更高特异性和稳定性的组氨酸磷酸化蛋白抗体，以及免疫学研究提供工具。
本发明的技术方案如下：一种磷酸化吡唑类化合物，结构式为：
其中：r1＝h，-(ch2)nch3；r2＝h，-(ch2)nch3；a＝-(ch2)n-，-(ch2-o)m-，b＝-cooh，-nh2，-sh，-oh；n取自1-20的任意整数，m取自1-20的任意整数。
本发明同时请求保护所述化合物的制备方法，步骤如下：含碘吡唑化合物与亚磷酸二乙酯在催化剂存在条件下，10～200℃反应1～72小时生成化合物1；化合物1与叔丁氧羰基(boc)保护的溴代化合物在催化剂存在条件下，10-200℃反应1～72小时生成化合物2；化合物2脱boc保护生成磷酸化吡唑类化合物。
在上述反应式(ⅰ)中，数字1-7代表催化剂；1为醋酸钯或钯碳；2为三苯基膦；
3为ch3-(ch2)n-ch2oh(n＝1-10)，丙酮，四氢呋喃，乙腈，n-甲基吡咯烷酮，二甲基亚砜，二恶烷，二甲基甲酰胺或甲苯；
4为氢氧化钾，碳酸钾，碳酸氢钾，氢氧化钠，碳酸钠，碳酸氢钠，磷酸钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，碳酸铯，醋酸钠，醋酸钾或三乙胺；
5为ch3-(ch2)n-ch2oh(n＝1-10)，丙酮，四氢呋喃或乙腈；
6为碳酸铯，醋酸钠，醋酸钾或三乙胺；
7为三氟乙酸，氢溴酸或盐酸。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明具有反应温度低，反应时间短，纯化方法简单，产率高等优点。
(2)本发明设计的磷酸化吡唑类化合物结构更加接近天然磷酸化组氨酸，同时以c-p键替代天然磷酸化组氨酸中的n-p键，分子化学稳定性更高。
附图说明
图1化合物1红外光谱图；
图2化合物11h核磁谱图；
图31-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸红外光谱图；图41-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸1h核磁谱图；图51-(2-氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸红外光谱图；
图61-(2-氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸1h核磁谱图；
图71-(2-氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸13c核磁谱图；
图81-(2-叔丁氧羰基氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸红外光谱图；图91-(2-氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸红外光谱图；
图101-(2-氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸1h核磁谱图；
图111-(2-氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸13c核磁谱图；
图121-(2-叔丁氧羰基氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸红外光谱图；图131-(2-氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸红外光谱图；
图141-(2-氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸1h核磁谱图；
图151-(2-氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸13c核磁谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，若无特殊说明，本发明所用原料均市售可得。
本发明提供的磷酸化吡唑类化合物均以化合物1作为初始反应原料。化合物1的具体合成方法如下：
在装有100ml乙醇的圆底烧瓶中，加入15mmol4-碘吡唑，30mmol亚磷酸二乙酯，6mmol三苯基磷，30mmol三乙胺，氮气气氛下搅拌溶解。将溶液加热至60℃，加入1.5mmol醋酸钯。反应混合物在氮气气氛下剧烈搅拌12小时，然后用100ml饱和nh4cl水溶液(ph＝7)淬灭并用乙酸乙酯(4×100ml)萃取。合并有机相并用50ml饱和nacl洗涤，再用分液漏斗分离并减压蒸发(35℃)。将所得黄色残余物加载到硅胶柱(5cm×25cm，用乙酸乙酯填充)上，用100％乙酸乙酯洗脱。将洗脱液旋蒸得到白色固体，即为化合物1，产率89％。
化合物1的红外光谱数据如图1所示：在3440.43cm-1处为亚氨基的特征吸收峰；在2930-3000cm-1处为甲基和亚甲基特征吸收峰；在1640.12cm-1处为酰胺键特征吸收峰；在695.14cm-1处为c＝c特征吸收峰；在606.78cm-1处为磷酸根特征吸收峰；在500.29cm-1处为c-p特征吸收峰。
化合物1的核磁数据如图2所示：1hnmr(400mhz，cdc13)，δ7.53(s，1h，pyrazolec-h)，7.46(s，2h，pyrazolec-h)，3.54(s，4h，pyrazolen-h)，1.25(s，6h，p(och2ch3)2)，0.88(s，5h，p(och2ch3)2)ppm。
实施例11-(2-氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的制备
(1)在装有2ml乙腈的圆底烧瓶中，加入3.67mmol化合物1和5.13mmol2-(boc-氨基)溴乙烷，氮气气氛下室温搅拌溶解。将12.80mmol碳酸铯加入到反应混合物中，室温下剧烈搅拌4h。将反应混合物用36ml乙酸乙酯稀释并过滤以除去固体。将所得溶液减压蒸发，粗产物通过硅胶快速柱色谱(100％乙酸乙酯)纯化，得到100ml白色纯化液；再次将所得溶液减压蒸发得到黄色液体，冷却后变为白色固体粉末即1-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，产率70％。
1-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的红外数据如图3所示：在3278.43cm-1处为亚氨基的特征吸收峰；在3060.46cm-1处为c＝c特征吸收峰；在2974.57cm-1处为甲基和亚甲基特征吸收峰；在1695.12cm-1处为羰基特征吸收峰；在1556.12cm-1处为酰胺键特征吸收峰；在606.78cm-1处为磷酸根特征吸收峰。
1-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的核磁数据如图4：1hnmr(400mhz，cdc13)，δ7.52(s，1h，pyrazolec-h)，7.42(s，1h，pyrazolec-h)，4.84(s，1h，nhboc)，4.23(s，2h，n-ch2)，3.54(d，3h，nh-ch2)，1.43(t，m，10h，tent-butyl)ppm。
(2)在装有磁力搅拌的圆底烧瓶中，加入0.574mmol1-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，室温下加入hbr(33％乙酸，2.4ml，0.25m)溶液。氮气气氛下，混合物在室温搅拌48h。用丙酮洗涤(10×2.0ml)，液体由黄色洗至无色。旋蒸得到白色固体粉末即1-(2-氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，产率96％。
1-(2-氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的红外数据如图5：在3100.57、2600、1489.35、1570.60cm-1处为氨基特征吸收峰；在3444.43cm-1处为亚氨基的特征吸收峰；在950.46、850.29和768.14cm-1处为c＝c特征吸收峰；在490.29cm-1处为c-p特征吸收峰；在1388.78、cm-1处为p-o特征吸收峰；在610.78cm-1处为磷酸根特征吸收峰；在1570.12cm-1处为酰胺键特征吸收峰。
1-(2-氨基乙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的核磁数据如图6、图7：1hnmr(400mhz，d2o)δ7.73(s，1h，pyrazolech)，7.58(s，1h，pyrazolech)，4.38(s，2h，alkylch2)，3.36(s，2h，alkylch2)ppm。13cnmr(400mhz，d2o)δ145.80(-ch＝n)，136.53(＝ch-n)，57.83(p-c)，48.83(n-ch2-)，39.57(ch2-nh2)。
实施例21-(2-氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的制备
(1)在装有2ml乙腈的圆底烧瓶中，加入3.67mmol化合物1和5.13mmol2-(boc-氨基)溴丙烷，氮气气氛下室温搅拌溶解。将12.80mmol碳酸铯加入到反应混合物中，室温下剧烈搅拌4h。将反应混合物用36ml乙酸乙酯稀释并过滤以除去固体。将所得溶液减压蒸发，粗产物通过硅胶快速柱色谱(100％乙酸乙酯)纯化，得到100ml白色纯化液；再次将所得溶液减压蒸发得到黄色液体，冷却后变为白色固体粉末即1-(2-叔丁氧羰基氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，产率97％。
1-(2-叔丁氧羰基氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的红外数据如图8：在3278.43cm-1处为亚氨基的特征吸收峰；在3060.46cm-1处为c＝c特征吸收峰；在2974.57cm-1处为甲基和亚甲基特征吸收峰；在1695.12cm-1处为羰基特征吸收峰；在1556.12cm-1处为酰胺键特征吸收峰；在606.78cm-1处为磷酸根特征吸收峰。
(2)在装有磁力搅拌的圆底烧瓶中，加入0.574mmol1-(2-叔丁氧羰基氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，室温下加入hbr(33％乙酸，2.4ml，0.25m)溶液。氮气气氛下，混合物在室温搅拌48h。用丙酮洗涤(10×2.0ml)，液体由黄色洗至无色。旋蒸得到白色固体粉末即1-(2-氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，产率85％。
1-(2-氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的红外数据如图9：在3055.30、1463.51、1570.60cm-1处为氨基特征吸收峰；在3456.67cm-1处为亚氨基的特征吸收峰；在880.40和797.23cm-1处为c＝c特征吸收峰；在553.73cm-1处为c-p特征吸收峰；在1388.78cm-1处为p-o特征吸收峰；在602.55cm-1处为磷酸根特征吸收峰；在1470.66cm-1处为酰胺键特征吸收峰。
1-(2-氨基丙基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的核磁数据如图10、图11：1hnmr(400mhz，d2o)δ7.67(s，1h，pyrazolech)，7.51(s，1h，pyrazolech)，4.15(s，2h，alkylch2)，2.80(s，2h，alkylch2)，2.04(s，2h，alkylch2)ppm。13cnmr(400mhz，d2o)δ145.01(-ch＝n)，136.15(＝ch-n)，56.32(p-c)，49.19(n-ch2-)，37.10(ch2-nh2)，27.76(c-c)。
实施例31-(2-氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸
(1)在装有2ml乙腈的圆底烧瓶中，加入3.67mmol化合物1和5.13mmol2-(boc-氨基)溴丁烷，氮气气氛下室温搅拌溶解。将12.80mmol碳酸铯加入到反应混合物中，室温下剧烈搅拌4h。将反应混合物用36ml乙酸乙酯稀释并过滤以除去固体。将所得溶液减压蒸发，粗产物通过硅胶快速柱色谱(100％乙酸乙酯)纯化，得到100ml白色纯化液；再次将所得溶液减压蒸发得到黄色液体，冷却后变为白色固体粉末即1-(2-叔丁氧羰基氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，产率96％。
1-(2-叔丁氧羰基氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的红外数据如图12：在3357.28cm-1处为亚氨基的特征吸收峰；在3061.73cm-1处为c＝c特征吸收峰；在2980.81cm-1处为甲基和亚甲基特征吸收峰；在1705.35cm-1处为羰基特征吸收峰；在1518.12cm-1处为酰胺键特征吸收峰；在606.78cm-1处为磷酸根特征吸收峰。
(2)在装有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，加入0.574mmol1-(2-叔丁氧羰基氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，室温下加入hbr(33％乙酸，2.4ml，0.25m)溶液。氮气气氛下，混合物在室温搅拌10min。用丙酮洗涤(10×2.0ml)，液体由黄色洗至无色。得到白色固体粉末即1-(2-氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸，产率86％。
1-(2-氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的红外数据如图13：在2981.59、1598.66、1475.64cm-1处为氨基特征吸收峰；在3240.46cm-1处为亚氨基的特征吸收峰；在868.93cm-1处为c＝c特征吸收峰；在516.00cm-1处为c-p特征吸收峰；在1386.68、cm-1处为p-o特征吸收峰；在617.67cm-1处为磷酸根特征吸收峰；在1469.23cm-1处为酰胺键特征吸收峰。
1-(2-氨基丁基)-1-氢-吡唑-4-基膦酸的核磁数据如图14、图15，1hnmr(400mhz，d2o)δ7.78(s，1h，pyrazolech)，7.62(s，1h，pyrazolech)，4.13(s，2h，alkylch2)，2.84(s，2h，alkylch2)，1.75(s，2h，alkylch2)，1.46(s，2h，alkylch2)ppm.13cnmr(400mhz，d2o)δ143.41(-ch＝n)，136.84(＝ch-n)，56.93(p-c)，51.50(n-ch2-)，39.06(ch2-nh2)，23.92(c-c)。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。