一种苹果中抗性相关基因MdERF014的克隆及其应用的制作方法

本发明涉及一种苹果中抗性相关基因mderf014的克隆及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

apetala2/ethylene-responsiveelementbindingfactor(ap2/erf)是植物中一个特别的转录因子家族(zhuang等2011；zhang等2008)。一般这个家族含有ap2/erf保守结构域(okamuro等1997)，基于序列同源性和ap2保守结构域分为5个亚家族，分别为ap2、rav、dreb、erf和其他一些基因(sakuma等2002)。ap2/erf在植物的生长发育及胁迫反应中起着重要作用，例如花器官的发育、叶表皮细胞的调控、响应各种生物及非生物胁迫等(zhang等2013；sears等2014；upadhyay等2013；chen等2015；park等2016)。

近年来erf家族在不同物种中的功能已经被广泛报道。例如：在拟南芥中，aterf73/hre1被氨基环丙烷羧酸及低氧所诱导，并且在氧气不足时，aterf73/hre1能够负调控乙烯响应(yang等2011)。在拟南芥中，erf6在抑制叶片生长及诱导胁迫响应基因中作为一个中心催化剂，并且能够诱导efrf11的表达，而erf11能反过来中和erf6的作用，erf6过表达造成的植株矮化能够被erf11过表达所抑制，所以erf6和erf11共同作用维持植物生长和抵御胁迫之间的平衡(dubois等2015)。在小麦中，erf3能够被盐和干旱所诱导，过表达erf3可提高胁迫相关基因的表达，显著增强植物对盐和干旱的抗性(rong等2014)。在大豆中，erf5能够被乙烯、脱落酸(aba)、水杨酸(sa)、大豆疫霉菌所诱导，并且能够增强对大豆疫霉菌的抗性，参与病原菌的抵抗过程(dong等2015)。在野生大豆中，erf71能够通过上调h+-atp酶及改变植物生长素的积累增强植物对碱性胁迫的抗性(yu等2017)。在四翅滨藜中，erf2能够减少活性氧和丙二醛的积累，增加抗氧化酶的活性，在渗透胁迫时快速关闭气孔，并且过表达erf2能够在种子萌发时对aba高度敏感，增强植物对病原菌的抗性(sun等2018)。这些结果表明，erf转录因子在植物的生长发育及抵御生物和非生物胁迫中起重要作用。

苹果是重要的经济作物之一，在苹果中erf是如何发挥功能的也被报道了很多。比如：mderf2的表达量在果树成熟中被乙烯所抑制，并且能够通过减少mderf3启动子的活性，直接抑制mdacs1的表达而负调控乙烯合成(li等2016)。mderf3是乙烯的正调控因子，mdmyc2能绑定到mderf3启动子上负调控对铝的耐受性(an等2017)。在常绿苹果中过表达erf17能够改变叶绿素积累，促进叶绿素降解相关基因的表达，改变苹果的颜色，这对苹果品质的改良提供了一个很好的理论基础(han等2018)。在本研究中，我们发现了一个新的苹果erf家族成员mderf014，其含有ap2保守结构域，能够响应aba及nacl，过表达mderf014基因的愈伤组织不受aba及盐抑制，这对苹果抗逆优良品种的选育具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克隆出一种苹果中抗性相关基因mderf014，并验证了其功能。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，公开了一种苹果中抗性相关基因mderf014及其应用，其完整编码区段的dna片段核苷酸序列如seq.id.no.1所示，其所编码的蛋白质氨基酸序列如seq.id.no.2所示。

本发明公开了一种苹果mderf014基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取‘gala’苹果组培叶片中的rna及反转录；

(2)cdna全长序列的获得：设计兼并引物mderf014-f,mderf014-r，然后以反转录合成的嘎啦基因组cdna为模板进行pcr扩增，得到cdna全长序列；其中，

mderf014-f序列如seq.id.no.3所示，

mderf014-r序列如seq.id.no.4所示；

(3)pcr产物进行回收、载体连接、转化、测序，得到mderf014基因的开放阅读框(openreadingframe,orf)为720bp，编码239个氨基酸。

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果mderf014基因在转基因愈伤组织中的应用，利用强启动子(花椰菜花叶病毒35s启动子)驱动原理的转基因技术，将mderf014基因的超量表达载体转入苹果愈伤组织中，从而获得转基因材料。实验证明，超量表达mderf014基因的转基因‘王林’愈伤组织，其耐盐性提高，对aba的敏感性降低，说明mderf014基因在植株抗性中发挥重要作用。

综上，本发明通过植物基因工程技术，从嘎啦苹果组培苗中分离克隆出抗性相关基因完整编码区段的dna片段，并验证了该基因的功能，发现采用超量表达之后转基因材料抗盐能力明显提高。

附图说明

附图1为pcr扩增产物电泳图谱。

附图2为qrt-pcr检测mderf014转基因愈伤组织的表达，其中control为对照，mderf014-oe-1、mderf014-oe-2、mderf014-oe-3为3个过表达转基因株系。

附图3为转入空载体的愈伤(vector)、3个转基因愈伤组织细胞系(l1、l2、l3)在aba处理下生长21天的状态。

附图4为转入空载体的愈伤(emptyvector)和过表达转基因愈伤3个株系(mderf014-oe-1、mderf014-oe-2、mderf014-oe-3)在aba处理下生长21天的鲜重。

附图5为转入空载体的愈伤(emptyvector)和过表达转基因愈伤3个株系(mderf014-oe-1、mderf014-oe-2、mderf014-oe-3)在aba处理下生长21天的丙二醛含量。

附图6为转入空载体的愈伤(vector)、3个转基因愈伤组织细胞系(l1、l2、l3)在nacl处理下生长21天的状态。

附图7为转入空载体的愈伤(emptyvector)和过表达转基因愈伤3个株系(mderf014-oe-1、mderf014-oe-2、mderf014-oe-3)在nacl处理下生长21天的鲜重。

附图8为转入空载体的愈伤(emptyvector)和过表达转基因愈伤3个株系(mderf014-oe-1、mderf014-oe-2、mderf014-oe-3)在nacl处理下生长21天的丙二醛含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：苹果mderf014基因的克隆

(一)嘎啦组培叶片rna提取及反转录

1、利用ctab法提取总rna

(1)将生根的‘皇家嘎啦’组培苗叶片取样后，液氮冷冻。

(2)取1.5g上述处理后的材料，放入预冷的研钵，加液氮磨碎，转入预冷的50ml离心管中；

(3)迅速加入10ml预热到65℃的提取缓冲液(其中pvp和巯基乙醇现用现加)，轻轻混匀，65℃水浴中0.5h，其中提取缓冲液组成见表1:

表1-提取缓冲液组成

(4)加入与上述步骤(2)离心管中液体等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡0.5h，4℃，12,000rpm离心20min，将上清液转移到新的50ml离心管中；

(5)加入1/3上清液体积的10mol·l^-1预冷licl，-20℃放置3h，12,000rpm离心30min，弃上清液；

(6)加入500μlsste缓冲液充分悬浮沉淀后，平均分装到2支1.5ml离心管中，其中sste缓冲液组成见表2：

表2-sste缓冲液

(7)分别加入与悬浮液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡10min，4℃、12,000rpm离心10min，将上清液转移到新的1.5ml离心管；

(8)分别加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合物，冰浴振荡10min，4℃、12,000rpm离心10min，将上清液转移到新的1.5ml离心管；

(9)加入2.5倍上清液体积的预冷无水乙醇，-20℃放置1-2h；

(10)于4℃、12,000rpm离心20min，70％乙醇洗2次；

(11)于4℃、14,000rpm离心10min，超净台上风干沉淀；加入20μldepc水溶解rna。

(12)置于-80℃储藏，备用,或立即进行以下反转录实验。

2、反转录cdna第一链的合成

(1)在0.2ml的微量离心管中配制表3混合液(其中表3中rna为步骤1提取获得的；如果用的是-80℃储藏rna，必须让其在冰上缓慢融解)：

表3-混合液

(2)用枪头轻轻混匀，将微量离心管放在pcr仪上(65℃，5min)进行变性、退火反应，然后冰上急冷；

(3)在上述微量离心管中继续配制表4反转录反应液。

表4-反转录反应液

(4)在pcr仪上按下列条件进行反转录反应：30℃10min，42℃60min，70℃15min，4℃保存。合成的反转录产物cdna，用于进行后面的相关实验。

3、cdna末端加尾

利用tdt末端转移酶，步骤2中反转录合成的cdna3’末端加上poly(c)尾巴，以此为模板进行5’race扩增。具体步骤如下：

在1.5ml离心管中依次加入表5的pcr反应试剂，终体积为50μl。

表5-pcr反应试剂

(1)37℃反应30min；

(2)加入50μl(等体积)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀；离心，取上层(水层)至另一新的1.5ml离心管中；

(3)加入50μl(等体积)的氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀；离心，取上层(水层)至另一新的1.5ml离心管中；

(4)加入5μl(1/10体积)3mnaac(ph5.2)，再加入125μl(2.5倍体积)预冷的无水乙醇，-20℃放置30-60min；

(5)4℃、12,000rpm离心15min，70％乙醇洗2次；

(6)4℃、12,000rpm离心10min，超净台上风干沉淀；用20μl无菌水溶解dna，4℃保存。获得的加尾cdna作为模板用于后面的5′race扩增。

(二)cdna全长序列的获得

设计兼并引物mderf014-f，mderf014-r，以反转录合成的cdna为模板进行pcr扩增。

mderf014-f：5’-atggtgaagacagatcagagga-3’，其序列如seq.id.no.3所示；

mderf014-r：5’-tcagcagaagctccacaagcga-3’，其序列如seq.id.no.4所示；

其中，pcr扩增体系见表6。

表6-pcr扩增体系

pcr反应程序：94℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，33次循环；72℃延伸10min。

pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图谱如附图1所示，回收目的条带(回收根据takara公司“agarosegeldnapurificationkit”操作)，连接到pmd18-t克隆载体进行测序(操作步骤按pmd18-tvector说明书进行)，转化(连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，在表面涂有iptg/x-gal的lb平板培养基上，37℃倒置培养12-20h；挑取白色菌落，在lb液体培养基中培养过夜)、序列测定(将摇好的菌液取1ml放到1.5ml离心管中，密封，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定后，得到mderf014基因序列，开放阅读框(openreadingframe,orf)为720bp，编码239个氨基酸，其核苷酸序列如seq.id.no.1所示，其氨基酸序列如seq.id.no.2所示。测序正确的单克隆，应用天根质粒提取试剂盒提取pmd18-t-mderf014的质粒dna(操作步骤按照天根质粒小提试剂盒说明书进行)，提取的质粒置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。

实施例2：mderf014基因表达载体的构建

为研究mderf014基因的功能，将包含有mderf014基因编码区在内的共720bp片段正确插入表达载体pri101-an上。

根据用于扩基因mderf014的上下游引物，设计上下游引物分别加上酶切位点smai和ecori后，以pmd18-t-mderf014质粒为模板进行扩增，回收目的条带后连接pmd18-t转化大肠杆菌dh5α，筛菌后进行测序。测序正确后，用smai和ecori酶切，连接到pri101-an载体上，构成mderf014-oe表达载体。将mderf014-oe表达载体及pri101-an空载体(emptyvector)分别转入到农杆菌gv3101，备用。

实施例3：mderf014过量表达苹果愈伤组织的获得

将准备侵染的野生型‘王林’苹果愈伤组织，隔7-9天周期继代，为乳白色或蛋黄色小颗粒为宜。取生长状态良好的苹果愈伤组织，置于农杆菌中浸泡10min，用灭菌的滤纸吸净农杆菌菌液，接种到无抗生素的培养基(ms+6-ba0.4mgl^-1+2,4-d1.5mgl^-1)上，暗培养2天后用灭菌水洗3-5次，洗去多余的农杆菌。用灭菌的滤纸将水吸干后，转移至加cb(300mgl^-1),kana(30mgl^-1)的继代培养基上，铺成薄薄的一层。继代筛选3-5次后，取抗性愈伤，提取dna和rna进行检测。

提取野生型和mderf014转基因苹果愈伤组织总rna，应用qrt-pcr检测mderf014基因在野生型和三个转基因苹果愈伤组织中的表达量，如附图2所示，与对照相比，mderf014的转录水平在三个转基因株系mderf014-oe-1、mderf014-oe-2、mderf014-oe-3中显著升高，表明成功获得了mderf014过量表达的转基因苹果愈伤组织。

实施例4：mderf014转基因愈伤组织对aba敏感性分析

将生长状态好的转入空载体的愈伤组织及转入mderf014的3个转基因愈伤组织细胞系分别置于ms+6-ba0.2mg·l^-1+2,4-d1.5mg·l^-1、ms+6-ba0.2mg·l^-1+2,4-d1.5mg·l^-1+100μmol·l^-1aba、ms+6-ba0.2mg·l^-1+2,4-d1.5mg·l^-1+150μmol·l^-1aba培养基上，并在25℃暗室进行培养。三周后观测表型，并且三个为一组检测愈伤的鲜样重量，测三组算其平均值及误差。实验结果发现，在对照培养基上，转入空载体的愈伤(vector)长势与3个转基因愈伤组织细胞系(l1、l2、l3)相似，而在100μmaba及150μmaba处理后，发现转基因愈伤组织细胞系l1、l2、l3长势相比于vector好，如附图3所示。检测其鲜重及丙二醛含量发现，aba处理愈伤组织后，转基因愈伤组织细胞系l1、l2、l3相比于vector，鲜重明显增加，丙二醛含量明显降低，如附图4-5所示，这表明mderf014过量表达苹果愈伤组织的生长不受aba抑制，抗性增强。

实施例5：mderf014转基因愈伤组织对nacl敏感性分析

检测了盐胁迫与mderf014的关系，如附图6所示，在对照培养基上，转入空载体的愈伤(vector)长势与3个转基因愈伤组织细胞系相似(l1、l2、l3)，而在50mmnacl及100mmnacl处理后，发现转基因愈伤组织细胞系l1、l2、l3长势相比于vector好。检测nacl处理后的转基因愈伤组织的鲜重及丙二醛含量发现，相比于vector，鲜重明显增加，丙二醛含量明显降低，如附图7-8所示，表明mderf014基因在盐胁迫过程中起到正调控的作用。

综上，从苹果中分离到了mderf014基因，通过苹果愈伤组织中转基因功能验证分析发现，mderf014在提高植株的抗性方面具有显著效果，提高了转基因植株的抗逆境能力，对于苹果新品种的选育具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>山东农业大学

<120>一种苹果中抗性相关mderf014基因的克隆及其应用

<141>2018-08-01

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>720

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

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