一种联苄基二聚体类化合物及其从金钗石斛中提取分离的方法与应用与流程

本发明涉及植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种联苄基二聚体类化合物及其从金钗石斛中提取分离的方法与应用。

背景技术

金钗石斛(dendrobiumnobilelindl.)，为兰科石斛属植物，是我国传统名贵中药，贵州道地药材，其中贵州遵义赤水产的金钗石斛已成为地理标志产品。金钗石斛以茎入药，甘，性微寒，益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏、口干烦渴、食少干呕，病后虚热、目暗不明。研究表明石斛属植物具有抗肿瘤、增强机体免疫能力、抗氧化、抗血小板凝集及降血糖等作用，有较大的开发和应用前景，符合国家倡导的大健康研究主题。

金钗石斛因其药理作用明显被誉为“民间仙草、植物黄金”，但是其含有的化学成分复杂多样，主要含有生物碱、芳香族类和倍半萜类化合物，为了彻底了解金钗石斛的化学成分，开发金钗石斛中活性成分，正是当下急需要研究的课题。

技术实现要素：

本发明意在提供一种联苄基二聚体类化合物及其从金钗石斛中提取分离的方法与应用，以开发出金钗石斛中的其中一种活性成分。

本方案中的一种联苄基二聚体类化合物，所述联苄基二聚体类化合物的化学结构通式为：

本发明还提供了从金钗石斛中提取分离所述联苄基二聚体类化合物的方法，包括以下步骤：

1)取金钗石斛干燥茎粉碎后，用浓度70％～95％的乙醇回流提取1～4次，每次提取1～5小时，合并提取液，将提取液减压浓缩得到乙醇浸膏；

2)将1)中所得乙醇浸膏分散于0.5％～5％的盐酸水溶液充分搅拌后，过滤，得到酸水不溶物；酸水不溶物先用体积比为1:1的石油醚：乙酸乙酯萃取剂萃取1～4后，在用乙酸乙酯萃取剂萃取1～4次，两个萃取部分均减压浓缩得到各部位浸膏；

3)将2)中乙酸乙酯部位浸膏通过硅胶柱色谱分离，用石油醚：乙酸乙酯以体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，然后进行tlc检测分析，分为20～30个组分；

4)将3)中第10～20个组分经sephadexlh-20柱色谱分离，用浓度为90％～100％的甲醇进行等度洗脱，分为20～31个亚组分；

5)将4)中第12～20个亚组分通过制备hplc分离，用甲醇70％～100％等度洗脱，得到目标化合物。

进一步，所述3)用石油醚-乙酸乙酯以体积比100:0、9:1、8:2、6:4、0:100进行梯度洗脱。在本方案的基础下，可以更快、更充分的获取到目标组分。

进一步，所述5)中所用hplc柱色谱为5μm，10mm×250mm，c18柱色谱，用浓度为50％～80％的甲醇等度洗脱。采用5μm，10mm×250mm，c18柱色谱，比较便宜，降低成本；采用50％～80％的甲醇等度洗脱可以更快、更充分的获取到目标组分。

进一步，所述5)中的洗脱剂甲醇可采用浓度为50％～80％的乙腈代替。

本发明首次从金钗石斛中获得了此联苄基二聚体类化合物，并确定了它的结构，本方案提取联苄基二聚体化合物的优点在于，首先通过硅胶柱色谱，用tlc方法结合紫外进行粗分，经sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，再利用制备hplc色谱分离得到单体，整个过程只使用了一次硅胶柱色谱，减少样品损失，分离方法使用制备hplc可控性和重现性好，微量成分不易流失，化合物纯度高，操作也较简单。

进一步，所述的联苄基二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中应用。

附图说明

图1为本发明联苄基二聚体类化合物的结构图；

图2为本发明联苄基二聚体类化合物的hr-esi-ms图；

图3为本发明联苄基二聚体类化合物的¹h-nmr图；

图4为本发明联苄基二聚体类化合物的¹³c-nmr图；

图5为本发明联苄基二聚体类化合物的¹h-¹hcosy图；

图6为本发明联苄基二聚体类化合物的hsqc图；

图7为本发明联苄基二聚体类化合物的hmbc图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

本发明所述的联苄基二聚体类化合物，其特征在于：所述联苄基二聚体类化合物的化学结构通式为：

实施例1:

本发明从金钗石斛中提取分离上述联苄基二聚体类化合物的方法，包括以下步骤：

1)取金钗石斛干燥茎5.0kg，经粉碎后，用浓度为95％乙醇回流提取4次，合并4次的提取液，将提取液进行减压浓缩得到乙醇浸膏0.5kg；

2)将步骤1)中乙醇浸膏分散0.5％的盐酸水溶液充分搅拌后，过滤，得到酸水不溶物。酸水不溶物依次用石油醚、石油醚：乙酸乙酯1：1体积、乙酸乙酯各萃取4次，减压浓缩得到各部位浸膏；

3)将步骤2)中乙酸乙酯部位浸膏通过硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以体积比100:0、9:1、8:2、6:4、0:100梯度洗脱，结合tlc检测方法，分为30个组分：fr.1～fr.30；

4)将步骤3)中第20个组分fr.20通过sephadexlh-20凝胶柱色谱，用100％纯甲醇洗脱，共分为20个亚组分；

5)步骤4)中第19个亚组分fr.19通过制备hplc，用浓度80％甲醇，色谱柱用c18，10mm×250mm，流速3.5ml/min等度洗脱，收集8～11min之间色谱峰，检测波长230nm，得到联苄基二聚体类化合物。

实施例2：与实施例1的区别在于

步骤1)中回流提取用的含水乙醇浓度为85％回流提取2次；步骤2)中萃取2次；步骤4)中用浓度为95％的甲醇；步骤5)中用浓度50％的乙腈，检测波长用240nm，260nm。其余步骤同实施例1，也可以取得本发明所述的有益效果。

实施例3：与实施例1的区别在于

步骤1)中回流提取用的含水乙醇浓度为70％回流提取4次；步骤2)中萃取4次；步骤4)中用浓度为90％的甲醇；步骤5)中用浓度70％的乙腈，检测波长用240nm，260nm。其余步骤同实施例1，也可以取得本发明所述的有益效果。

本发明进行tlc检识的条件：展开剂为石油醚-乙酸乙酯系统及二氯甲烷-甲醇系统，显色剂a：紫外灯(254nm)下观察荧光；显色剂b：碘缸显色。

结构鉴定：利用的光谱技术，主要包括核磁共振谱(¹h-nmr、¹³c-nmr、hsqc、hmbc)和质谱分析(hr-esi-ms)鉴定化合物的结构。

该化合物为黄色胶状物。hr-esi-ms[m+h]⁺m/z545.2170(计算值545.2172)，结合nmr谱确定化合物的分子式为c32h32o8,通过光谱技术，确定该化合物为联苄基二聚体类化合物。其核磁数据见表1。

表1联苄基二聚体类化合物的核磁数据(400/100mhz，cdcl3)：

实施例4

测定联苄基二聚体类化合物对人肝癌细胞hepg2的抑制作用。

采用常规mtt法，选取对数生长期的上述细胞，用含10％胎牛血清培养液调节细胞浓度为10×10⁵个/ml，以每孔100μl，接种到96孔平底细胞培养板，置于37℃、5％co2培养箱中培养24h后加入样品样品的浓度分别为0、10、20、40、80、160μg/ml，设3个复孔。在37℃、5％co2培养箱中继续培养48h后弃去带样品的培养液，再补充100μl培养液。然后每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)继续培养4h，离心后弃去上清液，用pbs冲洗2～3次后，再加入含mtt的培养液。终止培养，吸去孔内的培养液。最后，每孔加入100μldmso，低速振荡15min使结晶物充分溶解，将细胞培养板置于酶标仪上，测定490nm波长处的吸光值(a)，即od值，计算生长抑制率。记录实验结果，处理数据。顺铂为阳性对照。生长抑制率＝(1-实验组平均a/对照组平均a值)×100％以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制抑制率曲线图，求出抑制率为50％时样品的浓度。联苄基二聚体类化合物对人肝癌细胞hepg2的ic50为1.25±0.04μm。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。