用于检测rs662的引物探针组及其应用的制作方法

本发明涉及一种用于检测rs662的引物探针组及其应用。

背景技术

对氧磷酶1(paraoxonase1,pon1)由肝脏合成，含有354个氨基酸，相对分子质量为43，人类定位于7号染色体长臂q21.3〜q22.1，长约25.9kb，含9个外显子，8个内含子。p0n1在血清中借助于极端疏水的n端和载脂蛋白a1紧密结合，固定于高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，hdl)中,因能水解有机磷酸酯的底物对氧磷而命名。研究表明，pon1活性是预测冠心病（coronaryarterydisease，cad）危险性的一个独立因素。pon1通过抑制低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，ldl)的生成和水解氧化型ldl，抑制巨噬细胞的氧化应激，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。研究发现血浆对氧磷酶1活性降低的个体，氯吡格雷的活性代谢产物减弱，血小板抑制作用减少。

氯吡格雷(clopidogrel)是继阿司匹林之后一个重要的噻吩并吡啶类抗血小板药物，也是目前经皮冠状动脉介入治疗（percutaneouscoronaryintervention，简称pci）后的常规用药，但临床应用氯吡格雷时仍有4%～30%的患者在常规剂量治疗中达不到预期的抗血小板作用，严重者会导致血栓、再次心梗死、死亡等心血管不良事件，称为氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，cr)。基因的多态性是引起氯吡格雷抵抗的重要因素之一。

rs662是位于pon1基因中的一个snp，存在两种多态形式，a/g，a为野生型，g为突变型。基于rs662，人群中存在三种基因型，aa/ag/gg。gg纯合型，氯吡格雷活性代谢物水平高，血小板活性被抑制程度高，几乎无氯吡格雷抵抗风险；ag杂合型，半年后出现支架血栓的风险比为4.52，出现心肌梗死的风险比为2.3，氯吡格雷活性代谢物水平中等，血小板活性被中度抑制，有部分氯吡格雷抵抗风险；aa纯合型，半年后出现支架血栓的风险比为12.90，出现心肌梗死的风险比为4.93，氯吡格雷活性代谢物水平低，血小板活性较少被抑制，有氯吡格雷抵抗风险。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测rs662的引物探针组及其应用。

本发明首先保护一种引物探针组，由引物f、引物r和探针p组成；

引物f为如下（a1）或（a2）：

（a1）序列表的序列1所示的单链dna分子；

（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

引物r为如下（b1）或（b2）：

（b1）序列表的序列2所示的单链dna分子；

（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；

探针p为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链dna分子，且dna分子中的部分核苷酸为锁核酸，dna分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：

（c1）序列表的序列3所示；

（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

探针p为5’末端具有fam荧光基团且3’末端具有bhq1荧光淬灭基团的单链dna分子。

具体来说，所述探针p的核苷酸序列如序列表的序列3所示，且第1-3位核苷酸和第19-21位核苷酸均为锁核酸。

所述引物探针组中，引物f、引物r、探针p的摩尔配比为：20：5：10。

本发明还保护所述引物探针组在制备用于检测rs662的试剂盒中的应用。

本发明还保护一种用于检测rs662的试剂盒，包括所述引物探针组。

本发明还保护组件甲和组件乙在制备用于检测rs662的试剂盒中的应用；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量pcr的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2g/100ml的nacl水溶液，具体可为1.7g/100ml的nacl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份fg缓冲液和4体积份蛋白酶k溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddh2o混合，得到保存液。

本发明还保护一种用于检测rs662的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量pcr的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2g/100ml的nacl水溶液，具体可为1.7g/100ml的nacl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份fg缓冲液和4体积份蛋白酶k溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddh2o混合，得到保存液。

本发明还保护一种试剂盒，包括裂解液。所述试剂盒的功能为用血液样本制备用于荧光定量pcr的模板样本。所述裂解液为1.5-2g/100ml的nacl水溶液，具体可为1.7g/100ml的nacl水溶液。所述试剂盒还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份fg缓冲液和4体积份蛋白酶k溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddh2o混合，得到保存液。

本发明还保护一种用血液样本制备用于荧光定量pcr的模板样本的方法，包括如下步骤：

（1）取抗凝血，加入所述裂解液，颠倒混匀，离心弃上清；

（2）完成步骤（1）后，加入所述保存液，先60-70℃（具体可为65℃）水浴，再80-90℃（具体可为85℃）水浴，然后离心，使用时取上清，即为模板样本。

所述用血液样本制备用于荧光定量pcr的模板样本的方法，具体包括如下步骤：

（1）取65μledta抗凝血，加入500μl所述裂解液，颠倒混匀，12000rpm离心4min，弃上清；

（2）完成步骤（1）后，加入120μl所述保存液，先65℃水浴10min，再85℃水浴10min，然后12000rpm离心4min，然后置于4℃保存备用，使用时取上清，即为模板样本。

本发明还保护特异探针在进行荧光定量pcr检测中的应用；所述特异探针为具有锁核酸修饰的分子信标。

本发明还保护一种用于荧光定量pcr检测的特异探针，为具有锁核酸修饰的分子信标。

以上任一所述rs662为人基因组dna中序列表的序列4所示核苷酸的第51位核苷酸。

以上任一所述rs662为人基因组中的pon1基因中序列表的序列4所示核苷酸的第51位核苷酸。

本发明旨在检测pon1基因中主要的单核苷酸多态性位点的基因分型，判定患者的药物代谢速率类型，从而帮助医生正确选择药物并合理调整药物剂量，提高药物使用有效性，并降低毒副作用。

本发明提供的引物探针组，采用分子信标作为探针，并且引入了若干锁核酸。分子信标是一种荧光探针，由环状区和茎干区组成，其茎干区的5'末端标记荧光基团，3'末端标记猝灭基团，闭合时呈发夹结构，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，整体不发出荧光信号。当目标序列存在时，环部与目标序列结合，茎干部分被迫打开，荧光基团远离淬灭基团，发出荧光。具有单核苷酸差异的核苷酸链之间δtm值很小，一般检测手段难以区分。锁核酸是一类双环状寡核苷酸衍生物，能够遵循碱基互补配对原则与核酸结合，其结构中的β-d-呋喃核糖的2'-o与4'-c位通过缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖c3'-内型的n构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。lna/dna杂交双链中，每增加一个lna单体，tm提高2-6℃。

本发明提供的引物探针组的使用方法：用血液样本制备模板样本，然后采用引物探针组进行不平衡的荧光定量pcr扩增，通过观察熔解曲线判断基因型。不平衡扩增：加入过量的与探针反向的引物，少量的与探针同向的引物，以及适量的探针p，经过扩增后，由于一侧引物过量存在，其参与扩增得到的模板链远远多于与另一侧引物扩增得到的链，多余的模板链未形成双链，在体系中单独存在。

本发明提供的用血液样本制备用于荧光定量pcr的模板样本的方法，操作简便，其产物可以实现作为模板进行有效的荧光定量pcr扩增。

本发明提供的用于荧光定量pcr检测的特异探针，为具有锁核酸修饰的分子信标。由于引入了锁核酸可以显著提高核苷酸结合双链的tm值。通过控制熔解曲线的温度变化，从而控制分子信标的闭合，通过数据分析得到荧光曲线改变对应的峰值图谱很好地区分野生链和单位点的突变链。另外，对于杂合型样本，在熔解曲线的峰值图谱中会出现两个峰值，避免了一般pcr两次扩增确定结果的繁琐。

本发明可用于检测rs662，判断待测样本基于该位点的基因型，从而指导用药，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为示例性样本的熔解曲线（aa纯合型）。

图2为示例性样本的熔解曲线（gg纯合型）。

图3为示例性样本的熔解曲线（ag杂合型）。

图4为示例性样本的熔解曲线（aa纯合型）。

图5为示例性样本的熔解曲线（gg纯合型）。

图6为示例性样本的熔解曲线（ag杂合型）。

图7为示例性样本的熔解曲线（aa纯合型）。

图8为示例性样本的熔解曲线（gg纯合型）。

图9为示例性样本的熔解曲线（ag杂合型）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，引物、探针以及靶序列中的各个核苷酸均为常规意义上的核苷酸。

实施例1、用于检测rs662的引物探针组的设计

经过大量设计、预实验、效果比较，获得一组用于检测rs662的引物探针组。

引物f：5'-tgagcacttttatggcacaaatgat-3'；

引物r：5'-accacgctaaacccaaatacatctc-3'；

探针p：5'-fam-atcgtaagtaggggtcaagat-bhq1-3'。

引物f为序列表的序列1所示的单链dna分子。引物r为序列表的序列2所示的单链dna分子。探针p为5’末端具有fam荧光基团且3’末端具有bhq1荧光淬灭基团的单链dna分子，dna分子的核苷酸序列如序列表的序列3所示，下划线标注的核苷酸（即第1位、第2位、第3位、第19位、第20位和第21位）为锁核酸（lna）。

引物f和引物r的靶序列如序列表的序列4所示。

实施例2、用于检测rs662的引物探针组的应用

一、血液样本处理（单个血液样本的处理方法）

1、取65μledta抗凝血，加入500μl裂解液，颠倒混匀，12000rpm离心4min，弃上清。

裂解液为：1.7g/100mlnacl水溶液。

2、完成步骤1后，加入120μl保存液，先65℃水浴10min，再85℃水浴10min，然后12000rpm离心4min，然后置于4℃保存备用，使用时取上清，即为模板样本。

保存液的制备方法：①将25体积份fg缓冲液和4体积份蛋白酶k溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddh2o混合，得到保存液。

fg缓冲液：血液基因组dna提取系统（0.1-20ml）(dp319)试剂盒内的bufferfg。蛋白酶k溶液：血液基因组dna提取系统（0.1-20ml）(dp319)试剂盒内的proteinasek，浓度为20mg/ml。血液基因组dna提取系统（0.1-20ml）(dp319)的厂家为天根生化科技（北京）有限公司。

二、pcr的扩增及荧光信号的采集

1、取ep管，加入各个组分，制备反应体系。

反应体系：7.5μl2×reactionbuffer、0.12μltaqdna聚合酶溶液（含0.6utaqdna聚合酶）、0.09μldntp溶液（dntp溶液中含有datp、dctp和dgtp，datp、dctp和dgtp在dntp溶液中的浓度均为33mmol/l）、0.06μldutp溶液（dutp溶液中，dutp的浓度为100mmol/l）、0.06μludg酶溶液（含0.12uudg酶）、3μl5×pcrenhancer、0.3μl引物f溶液、0.3μl引物r溶液、0.3μl探针p溶液、1μl步骤一得到的模板样本，加入ddh2o至15μl。反应体系中，引物f的浓度为20μm，引物r的浓度为5μm，探针p的浓度为10μm。

2×reactionbuffer：菲鹏生物股份有限公司。taqdna聚合酶溶液即anstarttaqdnapolymerase,5u/μl，菲鹏生物股份有限公司。udg酶溶液即uracil-dnaglycosylase，2u/μl，菲鹏生物股份有限公司。5×pcrenhancer：天根生化科技有限公司，货号rp202。

2、取完成步骤1的ep管，加入25μl石蜡。

3、取完成步骤2的ep管，进行荧光定量pcr。

①50℃2min、95℃10min；

②95℃15s、55℃15s、72℃20s，50个循环；

③95℃5min、20℃5min；45℃1s、然后从45℃开始以0.3℃为间隔升温直至75℃（每个温度采集荧光，获得熔解曲线）、然后75℃15s。

如果熔解曲线中显示为单峰，且峰值对应的tm值为50.0℃-51.50℃，样本基于rs662的基因型为aa纯合型。

如果熔解曲线中显示为单峰，且峰值对应的tm值为58.5℃-60.0℃，样本基于rs662的基因型为gg纯合型。

如果熔解曲线中显示为双峰，且两个峰的峰值分别对应50.0℃-51.50℃和58.50℃-60.0℃，样本基于rs662的基因型为ag杂合型。

对500位知情同意的志愿者采集edta抗凝血，然后按照上述步骤进行检测，70位志愿者的基因型为aa纯合型、200位志愿者的基因型为gg纯合型、230位志愿者的基因型为ag杂合型。提取edta抗凝血的基因组dna并进行测序验证，测序结果表明，上述步骤鉴定的准确率为100%。

500位知情同意的志愿者采集edta抗凝血中，3个示例性样本的结果见图1、图2和图3。图1中示例性样本的熔解曲线中显示为单峰，峰值对应的tm值为50.78℃，该志愿者的基因型为aa纯合型。图2中示例性样本的熔解曲线中显示为单峰，峰值对应的tm值为59.1℃，该志愿者的基因型为gg纯合型。图3中示例性样本的熔解曲线中显示为双峰，峰值对应的tm值分别为51.05℃和59.60℃，该志愿者的基因型为ag杂合型。

对比例1、

一、血液样本处理

同实施例2的步骤一。

二、pcr的扩增及荧光信号的采集

1、取ep管，加入各个组分，制备反应体系。

用探针dp代替探针p，其他同实施例2的步骤二的1。

探针dp：5'-fam-atcgtaagtaggggtcaagat-bhq1-3'。

2、取完成步骤1的ep管，加入25μl石蜡。

3、取完成步骤2的ep管，进行荧光定量pcr。

反应程序同实施例2的步骤一的3。

对实施例2中的500份edta抗凝血，然后按照上述步骤进行检测。

各个基因型的样本均无有效峰显示。

3个示例性样本的结果见图4（aa纯合型）、图5（gg纯合型）和图6（ag杂合型）。

对比例2、

一、血液样本处理

同实施例2的步骤一。

二、pcr的扩增及荧光信号的采集

1、取ep管，加入各个组分，制备反应体系。

用引物df代替引物f，并且用引物dr代替引物r，其他同实施例2的步骤二的1。

df：5'-gcatgagcacttttatggcacaaat-3'；

dr：5'-ctaaaccacgctaaacccaaatac-3'。

2、取完成步骤1的ep管，加入25μl石蜡。

3、取完成步骤2的ep管，进行荧光定量pcr。

反应程序同实施例2的步骤一的3。

对实施例2中的500份edta抗凝血，然后按照上述步骤进行检测。

各个基因型的样本均无有效峰显示。

3个示例性样本的结果见图7（aa纯合型）、图8（gg纯合型）和图9（ag杂合型）。

序列表

<110>潍坊德诺泰克生物科技有限公司

<120>用于检测rs662的引物探针组及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgagcacttttatggcacaaatgat25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

accacgctaaacccaaatacatctc25

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atcgtaagtaggggtcaagat21

<210>4

<211>83

<212>dna

<213>homosapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(51)

<223>r=aorg

<400>4

tgagcacttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttacratcctggga60

gatgtatttgggtttagcgtggt83