抗GPC3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用的制作方法

本发明涉及一种抗gpc3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用，属于生物技术领域。

背景技术

据发明人所知，肝细胞癌发病广，致死率高，缺乏有效的治疗手段。病人晚期存活率仅有3％^[1]。多数病人确诊时已经处于癌变晚期，对化疗药物不敏感，手术切除后复发率高^[2,3]。glypican-3(gpc3)是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，通过gpi锚定在细胞膜表面。gpc3在胚胎发育早期表达，通过调控发育过程中的关键信号通路(如wnt信号)参与调控细胞增殖。在个体发育成熟后，gpc3表达关闭。大量的研究发现，gpc3在肝细胞癌中特异性高表达，是目前较受关注的肝细胞癌诊断标志物和治疗靶点^[4,5]。

由于肝脏的器官功能特殊性，小分子化学药物极易被肝脏代谢清除。相比较而言，生物大分子药物如治疗型抗体在肝癌的治疗中具有高活性、特异性好等优势。由于gpc3是细胞膜表面蛋白，靶向gpc3的抗体除应用于裸抗治疗外，抗体衍生物以及衍生的嵌合抗原受体t细胞均可作为治疗肝细胞癌的可行性手段，具有直接的临床转化潜力。

经检索发现，专利号cn201280029201.3，授权公告号cn103596985b的中国发明专利，公开了一种对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途。以该技术方案为代表的现有技术中已经存在了一些抗gpc3抗体。发明人课题组经系统地试验研究后得出了不同于现有技术的抗gpc3全人源化抗体。

技术实现要素：

本发明的主要目的是：针对现有技术存在的问题，提供一种抗gpc3全人源化抗体、以及具有该抗体的嵌合抗原受体细胞，有抗肿瘤应用前景。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种抗gpc3全人源化抗体，所述抗体包括重链和轻链；其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：

i、所述重链包括重链cdr1，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；

ii、所述重链包括重链cdr2，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；

iii、所述重链包括重链cdr3，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；

iv、所述轻链包括轻链cdr1，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；

v、所述轻链包括轻链cdr2，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；

vi、所述轻链包括轻链cdr3，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。

优选地，所述抗体至少具有以下技术特征之一：

i、所述重链包括重链cdr1，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26-33；所述重链包括重链cdr2，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50-59；所述重链还包括重链cdr3，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基98-102；

ii、所述轻链包括轻链cdr1，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基161-165；所述轻链包括轻链cdr2，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基182-185；所述轻链包括轻链cdr3，即seqidno:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基223-228。

优选地，所述抗体的氨基酸序列如seqidno:2所示。

优选地，所述抗体为vh单域结构抗体、fab片段、fab′片段、f(ab)′2片段、单链可变区片段(scfv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsfv)、igg分子、或双特异性抗体。

优选地，所述抗体具有标记，所述标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。

本发明还提供：

编码前文所述抗gpc3全人源化抗体的核酸。

优选地，所述核酸的序列如seqidno:1所示。

本发明还提供：

具有前文所述抗gpc3全人源化抗体的细胞或偶联物。

优选地，所述细胞包括嵌合抗原受体t细胞、嵌合抗原受体nk细胞、以及经人工编辑的细胞；所述偶联物包括抗gpc3全人源化抗体-细菌毒素偶联物、抗gpc3全人源化抗体-细菌毒素变体偶联物、抗gpc3全人源化抗体-细胞因子偶联物、以及抗gpc3全人源化抗体-化疗药物偶联物。

本发明还提供：

前文所述抗gpc3全人源化抗体用于制备细胞或偶联物、诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。

前文所述核酸用于制备抗gpc3全人源化抗体、药物或药物组合物的用途。

前文所述细胞或偶联物用于制备药物或药物组合物的用途。

其中，所述药物或药物组合物具有针对gpc3阳性肿瘤的抗肿瘤作用。

本发明通过噬菌体展示技术筛选出抗gpc3的全人源化抗体，该抗体特异性强，亲和力高；具有该抗体的细胞如嵌合抗原受体t细胞对gpc3阳性的肿瘤具有有效地杀伤作用。

附图说明

图1为实施例1中elisa检测富集噬菌体对抗原蛋白结合的示意图。

图2为实施例1中elisa检测噬菌体单克隆对抗原结合的示意图。

图3为实施例2中sds-page检测结果图。

图4为实施例3中抗体32a9对gpc3蛋白的特异性结合elisa检测结果图。

图5为实施例3中抗体32a9对gpc3阳性细胞的特异性结合facs检测结果图。

图6为实施例4中亲和力分析结果图。

图7为实施例5中构建的两个car分子的结构图。

图8为实施例5中慢病毒感染获得两个car-t细胞的流式细胞术检测结果图。

图9为实施例6中32a9car-t细胞的激活情况结果图。

图10为实施例6中32a9car-t细胞特异性杀伤a431-gpc3细胞的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。

实施例1、筛选抗gpc3全人源化抗体

采用噬菌体展示技术，以人源gpc3(q25-s550)蛋白为gpc3抗原进行筛选。

其中，该gpc3抗原的制备过程如下：构建pfuse-hgpc3(q25-s550)-fc真核细胞表达载体；该表达载体利用il-2的信号肽序列置换了gpc3的信号肽序列，引导gpc3-fc融合蛋白分泌到培养基中；利用lipofectamine^tm2000(invitrogen,carlsbad,ca)将上述表达载体转染hek293t细胞，收集上清，并通过proteinaargrose(gehealthcare，piscataway，nj)亲和柱分离纯化gpc3-fc融合蛋白，所得即gpc3抗原。

噬菌体展示的具体过程为：以10μg/ml的上文所得gpc3抗原于4℃包被免疫板过夜；用含有5％脱脂奶粉，0.1％tween-20的pbs溶液室温封闭免疫板1小时；tomlinsoni&j噬菌体文库(genserviceltd.,cambridge,uk，文库大小为1.47x10⁸)以10¹²pfu与5％脱脂奶粉pbs溶液1:1混合后室温孵育2小时，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板20次；100μlph2.0洗脱缓冲液室温洗脱30分钟；向洗脱的噬菌体中加入30μlph8.0溶液进行中和；将中和后噬菌体感染对数生长期的tg1细胞，扩增和回收后用于下一轮淘选。淘选后elisa分析阳性噬菌体富集情况。

elisa检测：以5μg/ml上文所得gpc3抗原、阴性对照蛋白frizzled-fc、以及bsa分别于4℃包被免疫板过夜；用含有5％脱脂奶粉，0.1％tween-20的pbs溶液室温封闭免疫板1小时；将每一轮富集的噬菌体扩增并回收，以1:1比例与10％脱脂奶粉pbs室温孵育2小时，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板5次；将hrp/anti-m13monoclonalconjugate以1：4000比例与含3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板5次；将tmb显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5m硫酸中止显色(100μl/孔)；用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并分析每轮扩增后噬菌体的亲和力。

elisa检测结果如图1所示，以frizzled-fc和bsa为抗原阴性对照，在三轮富集后，噬菌体群对gpc3抗原的亲和力显著升高。

对第三轮富集的噬菌体单克隆进行抗原结合分析，具体过程为：

用第三轮富集的噬菌体库感染tg1细胞，并从中随机挑取200个单克隆，扩增并回收噬菌体。以5μg/ml上文所得gpc3抗原、阴性对照frizzled-fc蛋白分别于4℃包被免疫板过夜；用含有3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液室温封闭免疫板1小时；将200个扩增后的单克隆噬菌体，以1:1比例与6％脱脂奶粉pbs室温孵育1小时，分别加入包被有gpc3抗原和阴性对照frizzled-fc蛋白并封闭好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板5次；将hrp/anti-m13monoclonalconjugate以1：4000比例与含3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板5次；将tmb显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5m硫酸中止显色(100μl/孔)；用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并分析单克隆噬菌体对gpc3抗原的结合能力。检测结果如图2所示，发现9个抗原结合阳性克隆。

分析上述9个抗原结合阳性的噬菌体单克隆序列，发生富集的克隆为抗体32a9，其scfv形式的dna序列为seqidno：1，氨基酸序列为seqidno：2。

seqidno：1：

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaggtattgcttataatggtgcttctacagcttacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaatctgctggttcttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcgacggacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctattctgcatcctctttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactattgtcaacaggattatgcttatccttatacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa。

seqidno：2：

evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsgiayngastayadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaksagsfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggstdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliysasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqdyaypytfgqgtkveik。

在氨基酸序列中，1-116为抗体重链序列，132-239为抗体轻链序列，117-131为连接肽序列。其中包含的cdr区域如下：氨基酸残基26-33(即gftfssya)为重链cdr1，氨基酸残基50-59(即giayngasta)为重链cdr2，氨基酸残基98-102(即ksags)为重链cdr3；氨基酸残基161-165(即issyl)为轻链cdr1，氨基酸残基182-185(即sass)为轻链cdr2，氨基酸残基223-228(即dyaypy)为轻链cdr3。

此外，该抗体形式可选自vh单域结构抗体、fab片段、fab′片段、f(ab)′2片段、单链可变区片段(scfv)、二硫化合物稳定的可变区片段(dsfv)、igg分子、或双特异性抗体。该抗体可选择具有标记，标记包括荧光标记、酶标记、以及放射性标记。

实施例2、抗体32a9的表达与纯化

将抗体32a9的重链序列和轻链序列分别克隆到表达载体pfuse-chig-hg1和pfuse-clig-hk(invivigen,sandiego,ca)中,制备质粒。用添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的dmem培养基在细胞培养皿中种5百万个hek293t细胞，置于5％co2，37℃培养箱中培养。当细胞密度到达60-80％时，将5μgpfuse-32a9vh质粒和5μgpfuse-32a9vl质粒加入1mlopti-mem培养基中，静置5分钟；将30μgpei加入混有质粒的opti-mem培养基中，静置20分钟，静置期间为hek293t细胞更换新鲜的添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的dmem培养基；静置20分钟后将混好的opti-mem培养基加入hek293t细胞培养皿中；每24小时回收上清液，并为hek293t细胞更换新鲜的添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的dmem培养基继续表达蛋白。将回收的上清液于3500rpm、4℃条件下离心20分钟，并用0.45μm的微孔滤膜抽滤，进一步去除碎片；将上清液通过proteinaargrose(gehealthcare，piscataway，nj)亲和柱分离纯化32a9igg重组蛋白。通过bca法测得32a9igg重组蛋白浓度，并将5μg32a9igg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到32a9igg重组蛋白在变性和非变性的环境下的条带，如图3所示。

实施例3、抗体32a9的特异性分析

(1)抗原蛋白结合特异性

以5μg/ml的gpc3-his蛋白、对照gpc5-his蛋白分别于4℃包被免疫板过夜(gpc3-his蛋白、gpc5-his融合蛋白分别购于r&d)；用含有3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液室温封闭免疫板1小时；将32a9igg重组蛋白用含有3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液稀释至5μg/ml，加入封闭好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板3次(340μl/孔)；将goatanti-humanfcγhrp(iacksonimmunoresearch)以1：2000比例与3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板3次；将tmb显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5m硫酸中止显色(100μl/孔)；使用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并分析32a9igg重组蛋白对gpc3蛋白的特异性。

如图4所示，结果表明抗体32a9特异性识别gpc3，但是不识别gpc3的同源蛋白gpc5。

(2)细胞结合特异性

采用的a431细胞(人上皮癌细胞系)购于美国atcc(atcc,manassas,va)。在添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的dmem培养基中，置于5％co2，37℃培养箱中培养；利用lipofectamine^tm2000(invitrogen,carlsbad,ca)将gpc3cdna转染a431细胞，zeocin筛选获得gpc3过表达细胞系a431-gpc3细胞。

收集a431和a431-gpc3细胞，2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用pbsbuffer重悬，再次离心，弃掉pbs溶液，用含5μg/ml实施例2纯化的32a9igg重组蛋白，含5％bsa的pbs溶液重悬细胞，并放置冰上孵育1小时；2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用pbsbuffer重悬，并再次离心，弃掉pbs溶液，将gtf(ab)′2anti-humanigg(γ)r-peconjugate(invitrogen)以1：200比例与含5％bsa的pbs溶液混合并重悬细胞，并放置冰上孵育1小时；2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用pbsbuffer重悬，并再次离心，弃掉pbs溶液，用0.3mlpbs溶液重悬细胞，并用流式细胞仪检测pe荧光标记信号,分析32a9igg重组蛋白对gpc3阳性细胞的特异性。

如图5所示，结果表明抗体32a9特异性识别a431-gpc3细胞，而不识别a431细胞。

实施例4、抗体32a9的亲和力分析

采用elisa实验和流式细胞术实验，分别测定抗体32a9与gpc3-his蛋白以及gpc3阳性细胞的亲和力。

(1)抗原蛋白结合亲和力

使用5μg/ml的gpc3-his蛋白于4℃包被免疫板过夜；用含有3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液室温封闭免疫板1小时；将实施例2所得32a9igg蛋白用含有3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液以20μg/ml起始，1:2梯度稀释，加入封闭好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板3次(340μl/孔)；将goatanti-humanfcγhrp以1：2000比例与3％脱脂奶粉，0.05％tween-20的pbs溶液混合，加入洗涤好的免疫板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％tween-20的pbs溶液洗涤免疫板3次；将tmb显色液加入免疫板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5m硫酸中止显色(100μl/孔)；使用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值，并拟合亲和力曲线分析32a9igg重组蛋白亲和力。

(2)细胞结合亲和力

收集a431和a431-gpc3细胞，2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用pbsbuffer重悬，再次离心，弃掉pbs溶液，用5％bsa的pbs溶液稀释实施例2所得32a9igg，以60μg/ml为起始，1:2梯度稀释，与细胞混匀后放置冰上孵育1小时；2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用pbsbuffer重悬，并再次离心，弃掉pbs溶液，将gtf(ab)′2anti-humanigg(γ)r-peconjugate(life)以1：200比例与含5％bsa的pbs溶液混合并重悬细胞，并放置冰上孵育1小时；2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用pbsbuffer重悬，并再次离心，弃掉pbs溶液，用0.3mlpbs溶液重悬细胞，并用流式细胞仪检测pe荧光标记信号,拟合32a9igg重组蛋白亲和力曲线并计算亲和力。

结果如图6所示，抗体32a9与gpc3-his蛋白的亲和力为1.93nm，抗体32a9与a431-gpc3细胞的亲和力为6.25nm。

实施例5、基于抗体32a9构建嵌合抗原受体t细胞

基于抗体32a9的序列，构建第二代4-1bb型car分子，同时构建fda批准的靶向cd19的car分子fmc63^[6]作为对照，两者的结构如图7所示。

分离人pbmc细胞，用dynabeadshumant-activatorcd3/cd28和il-2定向诱导t细胞活化，利用慢病毒系统构建32a9car-t细胞，具体过程为：

合成32a9二代4-1bbcar分子，并克隆入慢病毒表达载体plvx-ef1a-puro中，制备质粒，转染hek293t细胞，收集病毒上清，超速离心2小时(20000rpm，4℃)；分装病毒颗粒并测定病毒滴度。用添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、50u/mlil-2的rpmi培养基复苏pbmc细胞到24孔板中。将dynabeadshumant-activatorcd3/cd28(invitrogen)以2000rpm，4℃离心5分钟，弃掉上清，并用1mlpbsbuffer重悬，并再次离心，弃掉pbs溶液，用50μl添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的rpmi培养基重悬dynabeadshumant-activatorcd3/cd28，并加入pbmc细胞悬液中混匀；dynabeadshumant-activatorcd3/cd28激活pbmc细胞24小时后，将32a9carlentilvirus以moi＝15的浓度混合10μg/mlpolybrene加入细胞悬液中，1000g，20℃离心1小时，并放入37℃细胞培养箱培养过夜。将细胞悬液1000rpm，室温离心5分钟，弃上清并更换为添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、100u/mlil-2的rpmi培养基。更换培养基后每天检查细胞状态，当细胞密度达到2million/ml或者培养基变黄时为细胞更换新鲜的添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、100u/mlil-2的rpmi培养基；感染病毒后第九天通过流式细胞术检测gfp荧光信号，检测结果如图8所示。

同时，以基本相同的过程构建fmc63car-t细胞，流式细胞术检测结果如图8所示。

实施例6、评估32a9car-t细胞的抗肿瘤效果

(1)激活检测

将扩增后的32a9car-t细胞(效应细胞)分别与2500个a431细胞和a431-gpc3细胞(靶细胞)，按效靶比分别为1.25:1,2.5:1,5:1混合，在添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的rpmi培养基的96孔细胞培养板中共孵育18小时后，得到上清；通过humanil-1elisakit(联科生物)检测上清中il-2的含量，分析32a9car-t细胞激活效率。

如图9所示，实验结果表明32a9car-t细胞与a431-gpc3细胞孵育后il-2的分泌量显著上升，这证明32a9car-t细胞能够有效地被gpc3阳性靶细胞激活。

(2)杀伤实验

将扩增后的32a9car-t细胞(效应细胞)分别与2500个a431细胞和a431-gpc3细胞(靶细胞)，按效靶比分别为1.25:1,2.5:1,5:1混合，在添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的rpmi培养基的96孔细胞培养板中共孵育18小时后，得到上清；通过cytotox96non-radioactivecytotoxicityassay(promega)试剂盒检测上清液中由裂解细胞释放的乳酸脱氢酶(ldh)的含量，分析32a9car-t细胞杀伤效率。

如图10所示，32a9car-t细胞能够显著地杀伤a431-gpc3细胞，而fmc63car-t细胞对a431-gpc3细胞无显著杀伤，这证明32a9car-t细胞能够有效地杀伤gpc3阳性的肿瘤细胞。

除嵌合抗原受体t细胞外，抗体32a9还可用于制备嵌合抗原受体nk细胞或经人工编辑的细胞，或制备偶联物。偶联物可选自细菌毒素偶联物、细菌毒素变体偶联物、细胞因子偶联物、化疗药物偶联物。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

参考文献

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[6].cooperljn,jenab,maitis.anti-cd19scfv(fmc63)polypeptide:,us9701758[p].2017.

序列表

<110>南京医科大学

<120>抗gpc3全人源化抗体、其嵌合抗原受体细胞及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>717

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

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tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcaggtattgcttataatggtgcttctacagcttac180

gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaatctgct300

ggttcttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggt360

tcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcgacggacatccagatgacccagtctcca420

tcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagc480

attagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatc540

tattctgcatcctctttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctggg600

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caacaggattatgcttatccttatacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa717

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<212>prt

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<400>2

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

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