本发明涉及有机化学技术领域，具体涉及医用化学喹唑啉酮类骨架化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药，它们的制备方法以及含有所述化合物的药物组合物。本发明还涉及该类化合物及组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用，以及ido异常高表达所引起疾病的药物中的应用。
背景技术
癌症即恶性肿瘤，是一种严重危害人类健康的致命性疾病。目前全世界有1400万新癌症病例，癌症死亡人数达820万。其中新增肺癌病例180万，死亡人数159万。因此，恶性肿瘤已成为仅次于心血管疾病的人类第二类杀手，严重危害人类身体健康。
吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamin2,3-dioxygenase,ido)是人体内催化色氨酸代谢分解的限速酶之一，广泛存在于人体各种组织中，并在肿瘤组织中大量表达，是肿瘤发生免疫逃逸的重要影响因素。ido最早于1967年发现于兔的肠道内，后经研究发现，其在正常人体内除肝脏外广泛存在，主要集中在免疫系统的树突状细胞、巨噬细胞及胎盘等组织细胞内，可由多种炎症细胞因子如干扰素-γ(ifn-γ)、脂多糖(lps)、肿瘤坏死因子(tnf)等诱导其高水平表达。
在炎症反应中，多种炎症细胞因子尤其是ifn-γ能够诱导ido表达，加速l-trp的代谢，ido作为免疫应答的一部分，通过消耗病原体生长所必需的色氨酸，保护宿主免于病原体的感染。而在肿瘤组织中，肿瘤细胞也能利用ido的这一功能，抑制机体的免疫应答反应。ido主要通过gcn2、m-tor和ahr这3种机制介导体内免疫抑制功能。首先，ido降解l-trp，使局部组织微环境中l-trp耗尽，导致转运l-trp的trna处于游离状态，此时压力应答激酶(generalcontrolnonderepressible2，gcn2)因其含有一个感应游离trna的变构调节位点而得到激活，活化的gcn2激酶使下游的真核细胞转录起始因子-2α(eukaryotictranslationinitiationfactor-2α，eif-2α)磷酸化，导致eif-2α促转录功能弱化，从而抑制t细胞中多种rna的转录和蛋白质的翻译过程；其次，l-trp的缺乏能够抑制氨基酸感应激酶1(masteraminoacid-sensingkinase1，glk1)，进而抑制m-tor信号分子，触发t细胞免疫无能和自噬。因此，这两种机制是通过激活氨基酸不足信号(gcn2/eif-2α)和抑制氨基酸充足信号(glk1/m-tor)介导的。第三种机制是由l-trp代谢产物犬尿氨酸(kyn)介导的，ido通过代谢l-trp产生的kyn是芳香烃受体(ahr)的内源性配体，kyn与ahr结合导致未成熟的cd4+t细胞分化为抑制性t细胞(treg)，此外，kyn与ahr结合也能诱导ido的表达，进一步抑制t细胞的免疫应答。
目前，关于ido的研究，已经证实其与肿瘤密切相关，因此，对ido抑制剂的研究受到了众多学者专家的关注。早期的ido抑制剂主要以化学合成手段获得，结构上多以ido的底物色氨酸为基本骨架。自2006年后，研究人员开始尝试从天然产物中寻找ido抑制剂的新结构骨架。近年来，bristol-myerssquibb、roche、incyte、newlinkgenetics等制药公司通过高通量筛选以及基于靶点的药物设计，已经发现了多种新型骨架的ido抑制剂。
色胺酮(吲哚并[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮)来源于药用植物蓼蓝和菘蓝的天然产物，具有广泛的药理学效应，例如可抑制微生物和寄生虫的生长繁殖、具有免疫调节功能、抗炎以及抗肿瘤活性。色胺酮具有抑制氧化偶氮甲烷诱导f344大鼠肠道肿瘤形成，以及大量体外实验证明其具有明显的抗肿瘤效应。
技术实现要素：
本发明人以色胺酮为先导化合物，设计合成了一系列喹唑啉酮类化合物，具有良好的抑制ido活性，并经体外对多种肿瘤细胞株进行抗肿瘤活性筛选，结果表明具有抗肿瘤活性。
本发明的主要目的在于提供喹唑啉酮类化合物及其药学上可接受的盐、水合物或其前药，如通式i所示：：
其中，r1和r2相同或不同，为1～3个取代基，各自独立地选自羟基、卤素、硝基、氨基、氰基、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6烷氧基、任选被羟基、氨基或卤代的c1-c6烷基或c1-c6烷氧基、被1-2个c1-c6烷基取代的氨基、c1-c6烷基酰胺基、c1-c6烷基亚磺酰基、c1-c6烷基磺酰基、c1-c6烷基酰基、氨基甲酰基、被1-2个c1-c6烷基取代的氨基甲酰基、c1-c3亚烷基二氧基、烯丙基和游离的、成盐的、酯化的和酰胺化的羧基。
优选的，r1和r2相同或不同，为1～3个取代基，各自独立地选自羟基、卤素、硝基、氨基、氰基、c1-c4烷基、c2-c4烯基、c2-c4炔基、c1-c4烷氧基、任选被羟基、氨基或卤代的c1-c4烷基或c1-c4烷氧基、被1-2个c1-c4烷基取代的氨基、c1-c4烷基酰胺基、c1-c4烷基亚磺酰基、c1-c4烷基磺酰基、c1-c4烷基酰基、氨基甲酰基、被1-2个c1-c4烷基取代的氨基甲酰基、c1-c3亚烷基二氧基、烯丙基和游离的、成盐的、酯化的和酰胺化的羧基。
优选的，r1和r2相同或不同，为1～3个取代基，各自独立地选自羟基、卤素、硝基、氨基、氰基、c1-c4烷基、c1-c4烷氧基。
本发明通式i所述的化合物、光学异构体及其药学上可接受的盐、水合物或前药：特别优选以下化合物，但这些化合物并不意味着对本发明的任何限制：
6-氟-3-苯基-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
3-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
6-氟-3-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；6-氯-3-(4-甲基苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
3-(4-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
6-氟-3-(4-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
6-氯-3-(4-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
3-(3-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
6-氟-3-(3-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
3-(3,4-二氟苯基)-6-氯-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
3-(4-氟苯基)-7-甲氧基-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮；
3-(3,4-二氟苯基)-6-氟-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮。
此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。本发明衍生物的前药是通式i的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。
本发明中“卤素”是指氟、氯、溴或碘代；“烷基”是指直链或支链的烷基；“芳基”是指无取代基或连有取代基的苯基等。
本发明可以含有上式i的喹唑啉酮类化合物，及其药学上可接受的盐、溶剂化物作为活性成份，与药学上可接受的载体或赋型剂混合制备成组合物，并制备成临床上可接受的剂型，上述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本发明的衍生物可以与其他活性成份组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。
本发明上式i的喹唑啉酮类化合物用于患者的临床剂量可以根据：活性成分在体内的治疗功效和生物利用度、它们的代谢和排泄速率和患者的年龄、性别、疾病期来进行适当调整，不过成人的每日剂量一般应当为10-500mg，优选为50-300mg。因此，当本发明的药物组合物被制成单位剂型时，考虑到上述有效剂量，每单位制剂应当含有10-500mg上式ⅰ的喹唑啉酮类化合物，优选为50-300mg。按照医生或药师的指导，这些制剂可以以一定间隔分若干次给药(优选为一至六次)。
本发明的药用组合物可配制成若干种剂型，其中含有药物领域中一些常用的赋形剂。如上所述的若干种剂型可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。
用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂、防腐剂、加溶剂和基质等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。
通过体外酶活性的测试方法，我们发现本发明化合物具有一定的抗肿瘤活性，因此本发明化合物可以用于制备治疗和/或预防各种癌症的药物，如乳腺、肺、肝脏、肾脏、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、子宫、胰腺、骨髓、睾丸、卵巢、淋巴、软组织、头颈、甲状腺、食道的癌和白血病、成神经细胞瘤等。
此外，本发明化合物可以用于制备治疗和/或预防ido异常高表达所引起疾病的药物中的应用。
本发明的活性化合物或其可药用盐及其溶剂化物可作为唯一的抗肿瘤药物单独使用，或者可以与现已上市的抗肿瘤药物(如铂类药物顺铂、喜树碱类药物伊立替康、长春花碱类药物诺维本、脱氧胞昔类药物吉西他滨、足叶乙甙、紫杉醇等)联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。
下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实施例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。
下面的合成路线描述了本发明的通式i衍生物的制备，所有的原料都是通过这些合成路线中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终化合物都是通过这些合成路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些合成路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。
按照本发明的通式i衍生物，可按照路线所示，以取代的苯胺为起始原料，经异硫氰酸酯反应得到中间体x2，然后与取代的邻氨基苯甲酸环合得到中间体x3，再经甲基化、肼解异构反应得到中间体x5，最后中间体x5经原甲酸三乙酯环合得到目标化合物i。
合成路线：
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细的说明：
化合物的核磁共振氢谱采用brukerarx-400型核磁共振分析仪测定(dmso-d6)为溶剂，tms为内标；质谱采用agilent1100lc/ms测定；熔点采用wrs-1a数字熔点仪测定，温度未经校正；实验中所用试剂均为分析纯或化学纯。
实施例16-氟-3-苯基-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-1)的制备
中间体异硫氰基苯(x2)的制备
室温下，将10.0g(107.5mmol)x1、3.0g(268.8mmol)碳酸钾加入到150mldmf/h2o(5:1)中。搅拌均匀后，20.3g(268.8mmmol)将二硫化碳滴入到反应液中，室温反应3.5h。将反应液冷却至0℃，滴加12.0g(64.5mmol)三聚氯氰的二氯甲烷溶液(100ml)，反应1h后，加入6m的naoh溶液(100ml)，室温搅拌2h，二氯甲烷萃取(100ml)，分离有机层，水层用二氯甲烷(100ml*3)萃取。合并有机层，蒸干后得暗红色油状物，柱层析得无色液体，产量12.5g，收率为86.2％。
中间体6-氟-3-苯基-2-硫代-2,3-二氢喹唑啉-4(1h)-酮(x3)的制备
将2.0g(14.8mmol)x2、2.3g(14.8mmol)2-氨基-5-氟苯甲酸、4.1g(29.6mmol)碳酸钾加入到25ml无水乙醇中，78℃回流2h，反应完毕，有固体析出。抽滤得白色固体3.8g。收率为98.9％。
中间体6-氟-2-(甲硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)-酮(x4)的制备
将2.0g(7.4mmol)x3溶于2％naoh的乙醇溶液(4ml)，逐滴滴入1.1g(7.4mmol)碘甲烷，室温反应1h，反应结束。加20ml水，二氯甲烷萃取(10ml)，分离有机层，水层用二氯甲烷(100ml*3)萃取。合并有机层，蒸干后得白色固体1.4g。收率为66.7％。
中间体3-氨基-6-氟-2-(苯氨基)喹唑啉-4(3h)-酮(x5)的制备
将1g(3.5mmol)x4溶于10ml异丙醇中，逐滴滴入0.22ml水合肼，回流反应4h，反应结束。得白色固体0.8g。收率为85.1％。
目标化合物6-氟-3-苯基-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-1)的制备
将0.2g(0.7mmol)x5溶于5ml原甲酸三乙酯中，25℃反应12h，反应结束。有固体析出，抽滤，薄层分离得白色固体0.08g。收率为38.7％。
按照实施例1的方法，采用合适的原料和试剂，制备得到以下通式i的化合物(实施例2至实施例12)
实施例23-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-2)的制备
以邻氨基苯甲酸和对甲氧基苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.07g，总收率为26.7％。
实施例36-氟-3-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-3)的制备
以2-氨基-4-氟苯甲酸和对氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.15g，总收率为30.6％。
实施例46-氯-3-(4-甲基苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-4)的制备
以2-氨基-4-氯苯甲酸和对甲基苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.14g，总收率为29.6％。
实施例53-(4-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-5)的制备
以2-氨基苯甲酸和对氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.13g，总收率为27.3％。
实施例66-氟-3-(4-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-6)的制备
以2-氨基-4-氟苯甲酸和对氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.14g，总收率为28.0％。
实施例76-氯-3-(4-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-7)的制备
以2-氨基-4-氯苯甲酸和对氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.12g，总收率为27.5％。
实施例83-(3-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-8)的制备
以2-氨基苯甲酸和3-氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.08g，总收率为21.2％。
实施例96-氟-3-(3-氟苯基)-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-9)的制备
以2-氨基-4-氟苯甲酸和3-氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.12g，总收率为26.2％。
实施例103-(3,4-二氟苯基)-6-氯-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-10)的制备
以2-氨基-4-氯苯甲酸和3,4-二氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.11g，总收率为27.0％。
实施例113-(4-氟苯基)-7-甲氧基-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-11)的制备
以2-氨基-5-甲氧基苯甲酸和对氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.13g，总收率为27.7％。
实施例123-(3,4-二氟苯基)-6-氟-[1,2,4]三唑并[5,1-b]喹唑-9(3h)-酮(i-12)的制备
以2-氨基-4-氟苯甲酸和3,4-二氟苯胺为原料，按照上述实施例1的制备方法制得白色固体0.12g，总收率为27.2％。
目标化合物的相关数据如表1所示：
表1
本发明产物的体外抗肿瘤细胞活性：
化合物活性测试采用的是体外酶活性的测试方法，所用激酶为medicilon提供的hido激酶。具体方法为：准备20nm的hido，将化合物在100μl的缓冲液中浓缩，将hido和缓冲液预热至37℃，并于37℃下培养30min。之后用50μl30％三氯乙酸淬灭，继续于52℃下培养30min。室温下离心，取100μl上清液用100μlehrlich’s试剂混合，在480nm波长下读取数值，并根据该数值计算出抑制率，活性数据见表2。
表2
从上述实验结果可以清楚的看出，本发明所要保护的通式i的化合物，具有一定的体外抗肿瘤活性。
对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利。