特异性针对V5标签蛋白的单域抗体及其衍生蛋白的制作方法

本发明涉及生物技术或生物医学领域，具体涉及一种特异性针对v5标签蛋白的单域抗体及其衍生蛋白。

背景技术：

抗体是一种由浆细胞分泌，被免疫系统用来鉴别并中和外来物质如细菌、病毒等的y型蛋白质，被发现存在于脊椎动物的体液及b细胞的膜表面。抗体是生物技术药物最重要的组成部分，也是医学诊断和生物学研究中最常用到的试剂之一。因此，抗体相关的生物产品具有极高的应用前景和商业价值。通过免疫动物获得特异性针对某个蛋白（抗原）的抗体，可以被广泛应用于学术科研和工业生产。抗体是通过其可变区与目标蛋白发生结合，传统抗体包含轻链和重链，轻链和重链的可变区的结合构成了传统抗体的抗原结合单位，在自然界的一些动物体内，还存在着一种天然缺失轻链的重链抗体，其抗体的可变区相比传统抗体，在结构上更为简单，并能发挥相同甚至更强大的抗原结合能力。在重组抗体的获得方面，重链抗体的重链可变区，即单域抗体可以在体外单独表达并与抗原很好的结合，而传统抗体则需要将重链和轻链的可变区融合表达，即表达单链抗体（singlechainvariablefragment，scfv）才能发挥较好的抗原结合能力。在重组抗体表达方面，单域抗体在原核表达系统中可以大量可溶性表达，降低生产成本，而单链抗体在原核表达系统中表达则会形成包涵体，失去活性，只能在酵母或者哺乳动物细胞等高成本表达系统中表达。

v5标签蛋白是一个包含14个氨基酸的肽段，它来源于猿猴病毒5rna聚合酶α亚基的第95-108氨基酸，由于其氨基酸数目少不会影响目的蛋白本身的性质，并且与特异性抗体亲和力较高的特性，它被普遍添加在目的蛋白的碳端或者氮端用来纯化、检测、示踪目的蛋白。

细胞活动包含多种机制，要深入理解细胞各种活动的机制，最直接的方法是在单个蛋白或者细胞器水平上解析的突触内细胞器与分子组织构架的变化。然而，这些蛋白复合结构或者细胞器的大小在几百纳米和微米之间，常规荧光显微方法虽然提供了极高的灵敏度和特异性，但由于光学衍射的限制，只能达到亚微米级(数百纳米)的分辨率，因此不可能精确的研究生物大分子之间的相互作用，也没办法解析细胞内部的精细结构。近年来涌现的超微荧光显微方法如随机光学重构显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,storm)和光激活定位显微镜成像（photo-activatedlocalizationmicroscopy，palm)等利用单分子荧光定位重构突破了衍射极限(betzigetal.,2006;rustetal.,2006)，达到小于10纳米的有效分辨率（kexu.,et.al.,2012）。但是由于超分辨率成像对样品质量要求非常高，所以实际运用的时候经常会遇到一些困难，例如荧光成像依赖于分子的特异荧光标记，但常规免疫荧光标记依赖于抗体的质量，而且每批抗体生产之后的纯化和检测都花费了很多时间，另外常规抗体空间位阻比较大，直径达到10nm，已经超过了很多蛋白分子的大小和超分辨率的有效分辨率，从而使实际观测的结果有偏差，另外荧光蛋白标记由于荧光蛋白本身的光子产率大大低于荧光染料，所以导致用荧光蛋白做超分辨率成像的结果精确度不够(evgeniaplatonovaetal.,2015)，或者由于这些标记的特性如非均匀标记和自发聚集而影响成像结果(deschoutetal.,2014)。这些技术局限制约了对细胞触精细结构和功能的研究。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种特异性针对v5标签蛋白的单域抗体及其衍生蛋白，首先，在获得特异性强的单域抗体后通过原核表达便可以获得，产量和纯化效率高并且批间质量稳定，其次，单域抗体只有单结构域，空间位阻比传统抗体低了很多，可以大大增加超分辨率成像的精确度，此外，单域抗体可以很容易通过氨解反应标记上性质很好的染料，这样就能提供足够的光子数进行超分辨率的重构，大大提高了成像的分辨率。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：特异性针对v5标签蛋白的单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区cdr；所述互补决定区cdr包括cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列；

所述的单域抗体的互补决定区cdr的序列包括下述（1）-（8）中的至少一种：

（1）seqidno:3所示的cdr1，seqidno:5所示的cdr2，seqidno:7所示的cdr3；

（2）seqidno:11所示的cdr1，seqidno:13所示的cdr2，seqidno:15所示的cdr3；

（3）seqidno:19所示的cdr1，seqidno:21所示的cdr2，seqidno:23所示的cdr3；

（4）seqidno:27所示的cdr1，seqidno:29所示的cdr2，seqidno:31所示的cdr3；

（5）seqidno:35所示的cdr1，seqidno:37所示的cdr2，seqidno:39所示的cdr3；

（6）seqidno:43所示的cdr1，seqidno:45所示的cdr2，seqidno:47所示的cdr3；

（7）seqidno:51所示的cdr1，seqidno:53所示的cdr2，seqidno:55所示的cdr3；

（8）seqidno:59所示的cdr1，seqidno:61所示的cdr2，seqidno:63所示的cdr3。

上述（1）-（8）中的所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80%同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85%同源性”，更优选为“至少90%同源性”，更优选为“至少95%同源性”，最优选为“至少98%同源性”。

所述单域抗体具有seqidno:1、seqidno:9、seqidno:17、seqidno:25、seqidno:33、seqidno:41、seqidno:49、seqidno:57、seqidno：65-72中的至少一条所示的抗体链。

抗体链的编码序列如seqidno：73-88所示。

所述的抗体序列还包括框架区fr；所述框架区fr包括fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列；框架区fr的氨基酸序列分别为：

seqidno:2所示的fr1，seqidno:4所示的fr2，seqidno:6所示的fr3，seqidno:8所示的fr4；

或seqidno:10所示的fr1，seqidno:12所示的fr2，seqidno:14所示的fr3，seqidno:16所示的fr4；

或seqidno:18所示的fr1，seqidno:20所示的fr2，seqidno:22所示的fr3，seqidno:24所示的fr4；

或seqidno:26所示的fr1，seqidno:28所示的fr2，seqidno:30所示的fr3，seqidno:32所示的fr4；

或seqidno:34所示的fr1，seqidno:36所示的fr2，seqidno:38所示的fr3，seqidno:40所示的fr4；

或seqidno:42所示的fr1，seqidno:44所示的fr2，seqidno:46所示的fr3，seqidno:48所示的fr4；

或seqidno:50所示的fr1，seqidno:52所示的fr2，seqidno:54所示的fr3，seqidno:56所示的fr4；

或seqidno:58所示的fr1，seqidno:60所示的fr2，seqidno:62所示的fr3，seqidno:64所示的fr4；

上述所有fr1、fr2、fr3和fr4的序列可以替换为其保守序列变体。

所述的单域抗体，为vhh，其仅包含抗体重链，不包含抗体轻链。

本发明的另一个目的为提供核苷酸序列，该核苷酸序列编码前述的特异性针对v5标签蛋白的单域抗体，其核苷酸序列如seqidno：73-88中的任意一条所示。

本发明还涉及一种表达载体，其包含前述的核苷酸序列。

本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞或非人生物体，其可以表达出前述针对v5标签蛋白的单域抗体，或其包含前述的表达载体。

本发明还公开特异性针对v5标签蛋白的单域抗体的复合物，由前述针对v5标签蛋白的单域抗体与荧光染料偶联得到，或者由前述针对v5标签蛋白的单域抗体对目标蛋白进行标记而得。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：目前并未检索到针对v5标签蛋白的单域抗体，而单域抗体在应用方面有着传统抗体不可替代的优势，在超分辨率成像方面，荧光成像依赖于分子的特异荧光标记，但常规免疫荧光标记依赖于传统抗体的质量，而且每批抗体生产之后的纯化和检测都花费了很多时间，另外传统抗体空间位阻比较大，直径达到10nm，已经超过了很多蛋白分子的大小和超分辨率的有效分辨率，从而使实际观测的结果有偏差。这些技术局限制约了对细胞触精细结构和功能的研究。而单域抗体原核表达简单，产量和纯化效率高并且批间质量稳定，空间位阻也比传统抗体低了很多，可以大大增加超分辨率成像的精确度，此外，单域抗体可以很容易通过氨解反应标记上性质很好的染料，这样就能提供足够的光子数进行超分辨率的重构，大大提高了成像的分辨率。

在后续的研究当中，研究者可以通过基因编辑的方式将目的蛋白和v5标签蛋白融合，然后让该融合蛋白在细胞内表达，利用本发明中的特异性针对v5标签蛋白的单域抗体检测v5标签融合蛋白，进而对细胞中目的蛋白进行高精度的定位，从而获得细胞中不同蛋白分子的精确分子组织结构。

附图说明

图1是对所构建的单域抗体噬菌体展示文库进行目的片段插入率检测的pcr产物电泳图，从左至右，泳道1是dna分子marker，泳道2-25是从构建的针对v5标签蛋白单域抗体文库中随机挑取的不同克隆的pcr产物；

图2是表达的针对v5标签蛋白的单域抗体，蛋白粗液经镍柱树脂亲和层析纯化后的sds-page电泳图，从左至右，泳道1是蛋白marker，泳道2-9是经镍离子耦联的琼脂糖树脂一步亲和层析纯化后的单域抗体，其中seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:79、seqidno:80与图2中的vp14、38、71、78、82、102、163、167一一对应；

图3是以抗v5标签蛋白单域抗体为核心材料对神经元细胞中的目标蛋白进行染色进行表达谱分析的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

特异性针对v5标签蛋白的单域抗体、复合物

单域抗体(sdab，也被研发者ablynx称为纳米抗体或vhh)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(cdr)1(cdr1)、单个cdr2和单个cdr3。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。

单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的vhh分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有cdr1、cdr2和cdr3以及框架区。纳米抗体的分子量仅为约12-15kda，比由两条重链和两条轻链组成的普通抗体的分子量(150-160kda)小得多。

在一些实施例中，特异性针对v5标签蛋白的单域抗体为复合物，其含有两种或两种以上的单链抗体，该复合物是二价抗体或多价抗体，二价或多价可以使抗体以高亲合力结合多聚体抗原。在一些实施例中，特异性针对v5标签蛋白的单域抗体只含有（1）-（8）所述的一种单链抗体。单链抗体与荧光染料偶联，也可以构成单域抗体复合物；单链抗体通过标记目标融合蛋白，也可以形成单域抗体复合物，用于目标蛋白的定位。

值得一提的是，本发明中，与本发明公开的cdr1-3的序列同源性高的序列，也可以得到特异性针对v5标签蛋白的单域抗体。在一些实施例中，与（1）-（8）中的序列具有“至少80%同源性”的序列，或者“至少85%同源性”、“至少90%同源性”、“至少95%同源性”、“至少98%同源性”的序列都可以实现发明目的（即衍生蛋白）。

在一些实施例中，与（1）-（8）中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度或在确定单域抗体中的cdr1、cdr2和cdr3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下（a）-（d）组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：（a）极性带负电残基及其不带电酰胺：asp、asn、glu、gln；（b）极性带正电残基：his、arg、lys；（c）芳香族残基：phe、trp、tyr；（d）脂肪族非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、gly、pro、met、leu、ile、val、cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：asp被glu取代；asn被gln或his取代；glu被asp取代；gln被asn取代；his被asn或gln取代；arg被lys取代；lys被arg、gln取代；phe被met、leu、tyr取代；trp被tyr取代；tyr被phe、trp取代；ala被gly或ser取代；ser被thr取代；thr被ser取代；gly被ala或pro取代；met被leu、tyr或ile取代；leu被ile或val取代；ile被leu或val取代；val被ile或leu取代；cys被ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在cdr1-3区，而框架区序列fr1-4并非是不可改变的，fr1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。

用途

v5标签蛋白的特异性单域抗体与荧光染料偶联，能提供足够的光子数进行超分辨率的重构，大大提高了成像的分辨率。

可以通过基因编辑的方式将目的蛋白和v5标签蛋白融合，然后让该融合蛋白在细胞内表达，利用本发明中的特异性针对v5标签蛋白的单域抗体检测v5标签融合蛋白，进而对细胞中目的蛋白进行高精度的定位，从而获得细胞中不同蛋白分子的精确分子组织结构。还可用于分离、纯化v5标签融合蛋白。

可应用于随机光学重构显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,storm)和光激活定位显微镜成像（photo-activatedlocalizationmicroscopy，palm)中对生物样本中的目标蛋白的进行定位、示踪和检测。其可以原位标记几乎任何重要的蛋白，适应性广。

后续研究时，还可以探讨利用v5标签蛋白的特异性单域抗体的随机光学重构显微装置(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,storm)和光激活定位显微镜成像（photo-activatedlocalizationmicroscopy，palm)装置的具体组成。

本发明采用合成的v5标签多肽（序列已知，gkpipnpllgldst）偶联血蓝蛋白（v5-klh）来免疫阿拉善双峰驼，经过7次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并建立针对v5标签蛋白的单域抗体文库。在抗体筛选过程中，将v5标签多肽偶联生物素（v5-biotin），将中性亲和素蛋白偶联在酶标板上，利用生物素和中性亲和素结合的特性，使v5标签多肽间接展示在酶标板表面，使其抗原表位得以暴露，然后利用噬菌体展示技术筛选v5标签蛋白免疫后的单域抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的单域抗体株。

将筛选获得的单域抗体在大肠杆菌中表达后通过镍离子偶联的琼脂糖进行纯化，将纯化后的纳米抗体偶联荧光素。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：针对v5标签蛋白的单域抗体文库的构建：

(1)将1mgv5-klh抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共连续免疫7次，免疫过程中刺激b细胞表达特异性的纳米抗体；(2)免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总rna；(3)合成cdna并利用套式pcr扩增vhh；(4)利用限制性内切酶pstⅰ及notⅰ酶切20ugpmecs噬菌体展示载体及10ugvhh并连接两种片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞tg1中，构建v5标签蛋白噬菌体展示文库并测定库容，文库库容的大小约为2×10⁸；同时，通过菌落pcr检测所建文库中目的片段的正确插入率，图1显示菌落pcr结果，随机的选取24颗克隆做菌落pcr，结果显示插入率达到95.8%。

实施例2：针对v5标签蛋白单域抗体的筛选过程：

(1)取200ul重组tg1细胞至2×ty培养基中培养，期间加入40ul辅助噬菌体vcsm13侵染tg1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用peg/nacl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；(2)将稀释在100mmph8.3的nahco3中的中性亲和素蛋白500ug偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔；（3）第二天加入100ul生物素标记的v5标签蛋白（v5-biotin），室温孵育2小时，阴性对照孔加入100ulpbs；(4)2小时后，加入100ul的3%的bsa，室温封闭2h；(5)封闭结束后，加入100ul扩增后噬菌体文库（大约2×10¹¹个噬菌体颗粒），室温作用1h；(6)作用1小时后，用pbs+0.05%tween-20洗5遍，以洗掉未结合的噬菌体；(7)用终浓度为25mg/ml的胰蛋白酶将与v5标签蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌tg1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步实现富集。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法（elisa）筛选特异性阳性克隆:

(1)根据上述单域抗体筛选方法对v5标签蛋白进行3轮筛选，筛选结束后，针对v5标签蛋白的噬菌体富集因子达到10以上，从筛选获得的阳性克隆中挑选100个单菌落分别接种于含100ug/ml氨苄青霉素的tb培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mm的iptg，28℃培养过夜；(2)利用渗透涨破法获得粗提抗体；将中性亲和素蛋白稀释至100mmph8.3的nahco3中并将100ug中性亲和素蛋白在酶标板中4℃包被过夜，次日向酶标板内加入100ugv5-biotin蛋白；（3）将上述步骤中获得的抗体粗提液取100ul转移至加入抗原的elisa板上，室温孵育1h；(4)用pbst洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的mouseanti-hatagantibody（鼠抗ha抗体，thermofisher），在室温孵育1h；(5)用pbst洗去未结合的抗体，加入100ul经1:20000稀释后的anti-rabbithrpconjugate（山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，购自于thermofisher），在室温孵育1h；(6)用pbst洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，28℃下反应15min后，于酶标仪上405波长处，读取吸收值；(7)当样品孔od值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；(8)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100ug/ul氨苄青霉素的lb培养基中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件vectornti分析各个克隆株的基因序列，把cdr1，cdr2，cdr3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对v5标签蛋白的单域抗体（单域抗体氨基酸序列分别如seqidno:1、seqidno:9、seqidno:17、seqidno:25、seqidno:33、seqidno:41、seqidno:49、seqidno:57、seqidno：65-72中的任意一条所示，每个序列针对一个克隆株）。其抗体的氨基酸序列为fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4结构，构成整个vhh。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。

实施例4：v5标签蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达

（1）将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒（pmecs-vhh）分别电转化到大肠杆菌wk6中，并将其涂布在lb+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5ml含有岸边青霉素的lb培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1ml的过夜培养菌种至330mltb培养液中，37℃摇床培养，培养到od600nm值达到0.6-0.9时，加入1miptg，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，纯化后的单域抗体，如图2所示。

实施例5：v5标签蛋白的特异性单域抗体与荧光染料的偶联

将含有nhs-easter的染料真空干燥之后溶于dmso中，浓度大约为10mg/ml；（2）将纯化后的单域抗体通过脱盐柱置换至0.1m0.1mnahco3，ph8.3溶液中；（3）将含有nhs-easter染料和更换缓冲液后的单域抗体在ph8.3的环境中进行氨解反应1-2小时，最终将染料标记在抗体游离的氨基上；（4）将用染料标记好的单域抗体用脱盐柱更换缓冲液到pbs，ph7.4中，-20℃储存备用。

实施例6：融合v5标签蛋白编码序列的目的基因的载体构建

glua2蛋白即ampa受体2，是谷氨酸的一种离子性跨膜受体，介导中枢神经系统的快速突触传递，通过将v5标签蛋白的编码序列和glua2蛋白编码序列融合，使glua2在神经元细胞中表达后带有v5标签，进而可以通过检测v5标签来检测glua2蛋白的神经元分布。

（1）设计pcr引物，其中上游引物f包括v5标签蛋白的编码序列和glua2蛋白编码序列5’端的20个碱基，下游引物r为glua2蛋白编码序列3’端30个碱基的反向互补序列，其目的是为了将v5标签蛋白融合于glua2蛋白的氮端；引物序列具体如下：

f引物：5’-ggcaaaccgattccgaacccgctgctgggcctggatagcaccaacagcattcagattggcgg-3’（seqidno.89）；

r引物：5’-aattttcacgctttcaatgccatacacgtt-3’（seqidno.90）；

（2）通过pcr反应，以神经元细胞mrna反转录的cdna为模板，扩增v5标签蛋白编码序列和glua2编码序列融合后序列；

（3）将扩增后的融合序列通过ta克隆的方法连接到pcdna3.1载体中，将构建好的重组质粒送去生物公司进行测序鉴定；

（4）将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌扩大培养，大量提取质粒，去除内毒素，获得转染级别的重组质粒。

实施例7：原代神经元细胞的培养

（1）离体神经元细胞培养方法按照已经发表的文献中描述的方法进行(lauandbi,2005)，将spraguedowley（sd）大鼠中怀孕18天的胎鼠进行解剖；（2）将脑组织中的海马细胞在胰蛋白酶处理解离后接种在表面经多聚l-赖氨酸处理的盖玻片或含有穿孔碳膜的电镜金载网上；（3）海马细胞在离体培养7-10天后，根据其生长情况添加阿糖胞苷以抑制胶质细胞的过量生长；（4）利用慢病毒感染或者磷酸钙转染的方法将融合有v5标签蛋白编码序列的目的基因（由实施例6制得）转入神经元（例如glua2-v5），细胞在离体培养2周左右开始使用。

实施例8：v5标签蛋白的特异性单域抗体对目的蛋白的荧光显微成像（两步法）

（1）将实施例7得到的神经元用多聚甲醛固定后用tritonx-100进行膜通透处理；（2）用抗v5标签蛋白的单域抗体或者阳性对照抗体对细胞中的目标蛋白进行标记；（3）用荧光素标记的抗阳性抗体的二抗或者荧光素标记的抗单域抗体的二抗进一步结合阳性对照抗体或单域抗体；（4）在荧光显微镜或或者超微显微镜下进行图像捕捉，实验结果如图3所示：positivectrl为v5标签蛋白的阳性对照抗体的染色结果，单域抗体上带有ha标签蛋白，所以negativectrl为抗ha标签蛋白的染色结果，vp38和vp163为两个特异性针对v5标签蛋白的单域抗体的染色结果。定位的目标蛋白为glua2-v5融合蛋白，该蛋白在表达谱上可以与psd95蛋白重合，所以psd95-mkate2在每个实验组中为目的蛋白表达谱的对照。

实施例9：v5标签蛋白的特异性单域抗体对目的蛋白的荧光显微成像（一步法）

（1）将实施例7得到的神经元用多聚甲醛固定后用tritonx-100进行膜通透处理；（2）用实施例4中方法标记后的单域抗体直接对神经元中的靶标蛋白进行染色，5分钟之后洗脱；（3）使用激光共聚焦活细胞成像平台连续对神经元成像并观察树突中标记了v5标签蛋白的特异性单域抗体的突触蛋白表达和转运，以实时观测突触蛋白定位的动态变化，并选取典型的时期分别进行固定处理后再进行关联超微成像以精确测定特定突触的蛋白定位和超微结构。

v5标签只有14个氨基酸，不会影响目标蛋白的正常功能，因此这一方法将可以原位标记几乎任何重要的蛋白，从而对其进行活细胞成像和超分辨荧光显微成像。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

序列表

<110>南京融捷康生物科技有限公司

<120>特异性针对v5标签蛋白的单域抗体及其衍生蛋白

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151015

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151015

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gluserglyglyglyservalglnalaglyglyserleuargleuser

151015

cysalaalaser

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151015

lys

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<211>7

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ilevalseraspglyargthr

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sertyralaaspservallysglyargphethrileserlysaspasn

151015

alalysasnileleutyrleuglnmetasnasnleulysprogluasp

202530

thralamettyrtyrcys

35

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<211>16

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151015

<210>16

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glyglnglythrglnvalthrvalserser

1510

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gluserglyglyglyservalglnglnglyglyserleuargleuser

151015

cysvalvalthrglyserilehisserglyhiscysmetglytrpphe

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505560

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65707580

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serser

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151015

ala

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151015

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mettyrtyrcys

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151015

lys

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151015

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151015

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505560

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65707580

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100105110

thrvalserser

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151015

ala

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<211>38

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151015

lys

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ilevalseraspglyargthr

15

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sertyralaaspservallysglyargphethrileserlysaspasn

151015

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cysalaalaser

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151015

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cysalaalaser

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lys

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151015

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505560

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65707580

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859095

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65707580

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serlysaspasnalalysasnileleutyrleuglnmetasnasnleu

65707580

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100105110

thrvalserser

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151015

cysalaalaserglytyriletyrserasntyrcysmetglytrpphe

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argargalaproglylysgluarggluglyvalalalysilevalser

354045

aspglyargthrsertyralaaspservallysglyargphethrile

505560

serlysaspasnalalysasnileleutyrleuglnmetasnasnleu

65707580

lysprogluaspthralailetyrtyrcysalaalaaspserasppro

859095

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100105110

thrvalserser

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