黑麦分子特异性标记引物、使用方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种黑麦分子特异性标记引物、使用方法及其应用。

背景技术：

黑麦(secalel.)属禾本科(poaceae)、小麦族(triticeae)、小麦亚族(tritticine)，是小麦的一个近缘种。野生型黑麦一般为二倍体，只含有r一个染色体组，它的体细胞染色体数目可以表示为：2n＝2x＝14。我国栽培黑麦主要位于西北，西南以及东北的山区或者是高海拔地区。

栽培黑麦分蘖力强,小穗数多,抗多种病虫害,根系发达,具有抗旱、耐盐碱、耐贫瘠、耐寒和抗干热风等特性,是小麦育种中改善重要性状和丰富遗传多样性的优良基因供体。自然情况下，黑麦和小麦很难杂交结实，因此育种学家用秋水仙碱处理小麦和黑麦的杂种，创造了世界承认的第一种人工合成作物小黑麦，极大地拓展了小麦的遗传基础。小黑麦由于结合了小麦和黑麦籽粒产量与品质两方面的优良特性，具有抗寒、抗病、抗逆性强等优势。通过对小黑麦抗逆性的研究发现，不同的土壤区域产量都比较良好，尤其是在相对贫瘠的土壤区域表现尤为出色，而且对土壤的酸碱度和配离子的忍耐性都很强。另外，由于小黑麦继承了黑麦抗旱性强的特性，在一般情况下，其抗旱性要强于普通小麦，小黑麦在抗病方面同样表现出色；研究表明，绝大多数小黑麦品种对白粉病免疫或高抗，对黄矮病免疫，对叶锈病也存在一定抗性。

利用远缘杂交、染色体工程等多种手段将黑麦中的多种类型优良基因导入到普通小麦中，创制携带黑麦优异性状的小麦新种质，丰富小麦育种的遗传基础，挖掘抗病资源，创制丰富的种质材料，是进行小麦遗传改良的有效途径和重要方向。在黑麦遗传物质向普通小麦转移的过程中，黑麦遗传物质的准确鉴定与追踪已成为本领域亟待研究的重要工作。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种黑麦分子特异性标记引物、使用方法及其应用，主要目的是筛选引物，准确鉴定黑麦。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种黑麦分子特异性标记引物，所述引物包括27个ssr引物对和56个est-sts引物对；

所述ssr引物对的名称分别为：xwmc166、xgwm314、xgwm271、xcfd31、xcfd39、xcfd156、xgpw5195、xgpw7244、xwmc27、xwmc533、xwmc631、xwmc734、xcfd35、xgpw4095、xgpw5237、xmag1932、xmag1809、xmag3056、xmag1441、xmag1682、xmag3318、xmag1932、xmag1809、xmag3056、xmag1441、xmag1682及xmag3318；

所述est引物对的名称分别为：be498572、be426274、be490643、be403214、be426257、be352611、be497177、be499900、be403867、bf291549、bf474569、be590695、be490237、bf484133、be423141、be443796、be497584、be495292、bq162235、bq169707、bq160526、cd490485、cd373475、bf473348、bq169491、bf291730、bm137713、cd452844、cd453612、be606250、bm134465、be404973、cd373484、be444811、be444644、cd491981、bf482781、bf482530、be591737、be637663、bg274576、bq168298、bg606097、be495150、bf291549、be405518、bf485168、be495786、bg262410、be405749、be518255、be443691、bf202706、be606392、bf473020及be638039。

另一方面，本发明实施例提供了上述黑麦分子特异性标记引物在鉴定黑麦中的应用。

又一方面，本发明实施例提供了上述的黑麦分子特异性标记引物的使用方法，包括以下步骤：

(1)采用ctab方法提取待鉴定叶片全基因组dna作为pcr扩增模板；

(2)以权利要求1所述的27个ssr引物对和56个est-sts引物对中的任意一个引物对作为所述pcr的扩增引物，在s1000型热循环仪上进行pcr反应，获得扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示出清晰条带的鉴定为黑麦dna。

作为优选，所述pcr扩增体系为10μl，具体如下：

作为优选，所述pcr的扩增程序：

94℃预变性4min；

94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；

72℃终延伸10min，12℃保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用基因数据库信息，通过筛选、设计、合成、以及pcr扩增验证，筛选出27个ssr分子特异性引物对和56个est分子特异性引物对；上述标记均可在黑麦中扩增出特异的条带；本发明提供的上述83个特异性引物对在普通小麦、普通小麦与近缘物种黑麦的衍生后代材料间具有显著差异；为黑麦分子标记辅助育种工作提供理论依据，可快速有效追踪黑麦的遗传物质，同时也有利于将黑麦的优良基因和优良性状向受体普通小麦品种转移，加快了育种进程，提高了新品种的选育效率。

附图说明

图1是本发明实施例2提供的利用be443103扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

(1.中国春；2.7182；3.长穗偃麦草；4.中间偃麦草；5.拟鹅观草；6.华山新麦草；7.滨麦；8.黑麦。)

图2是本发明实施例2提供的利用cd491981扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图3是本发明实施例2提供的利用be443796扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图4是本发明实施例2提供的利用be591737扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图5是本发明实施例2提供的利用bf202706扩增的目的产物的凝胶电泳图谱。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

缩略语和关键术语定义

ssr：ssr又被称作微卫星，是由2-6个核苷酸为基本单元组成的简单重复序列，在真核生物的基因组中广泛存在。此种标记对dna质量要求中等、多态性高、易用pcr检测、实验周期短、重复性好、不使用放射性同位素等优点，已广泛应用于遗传学及鉴定外源物质的研究上。

est：est即表达序列标签，指从一个随机选择的cdna克隆，进行5'端和3'端单一次测序挑选出来获得的短的cdna部分序列。est作为表达基因所在区域的分子标签因编码dna序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记(如aflp、rapd、ssr等)相比更可能穿越家系与种的限制，因此est标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息时特别有用。

sts：sts标记即序列标签位点，是一种基于特异pcr扩增原理的标记，被定位于染色体的特定位置上。sts标记根据rflp标记的末端插入序列来设计引物进而转化而成。sts标记具有可靠性高、快速、经济、不使用放射性同位素、实验周期短等特点。该技术目前已广泛的应用于外源遗传物质的鉴定和追踪。

实施例1

利用序列数据库查找比对黑麦近缘物种和小麦低同源序列，遵循引物设计原则，利用primer5.0设计est引物和ssr引物，结合小麦近缘物种进行验证，得到的特异标记总计83个，其中ssr标记27个，est-sts标记56个，上述特异性引物的筛选验证工作是由本发明独立完成，上述83对特异引物在染色体的位置和核苷酸序列如表1所示。

表1.黑麦83对特异性引物生物信息

注：1-27为ssr分子标记，28-83为est-sts分子标记；本领域技术人员可根据上述引物对名称从pcr引物网站(http://wheat.pw.usda.gov/snp/new/pcr_primers.shtml)或者urgi(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)中获取上述83对引物的详细信息，如染色体位置和核苷酸序列。

实施例2

(1)dna提取用ctab方法(稍作修改，saghai-maroofetal.1984)提取植株全基因组dna，分别获得8种待鉴定样品dna；具体提取过程如下：

a将2颗灭菌的钢珠放入2ml灭菌的离心管中，剪取适量幼嫩叶片放入离心管中，随后液氮冷冻10min；

b取出离心管，放在高通量组织研磨仪上震荡2min，直至叶片呈粉末状；

c加入60℃预热的ctab微量提取液1000μl，混匀，再加入400ul三氯甲烷，颠倒、混匀，吸出钢珠，60℃水浴10min，取出离心管并冰浴10min；

d10000rpm离心5min,吸取700μl上清液到1.5ml的离心管中，加入相同体积的异丙醇，缓慢颠倒数次，静置10min；

e10000rpm离心5min，倒掉上清液，加入200μl的70％乙醇冲洗，离心，倒去酒精，重复3次；

f.放在超净工作台中，风干12h，加入500μl1×te(100mmtris-hcl，10mmedta，ph＝8.0)溶解。

g.dna充分溶解后，加入1.8μlrnasea(10mg·u^-1)，混匀，37℃水浴30min。

h.加入500μl苯酚/氯仿/戊乙醇(25:24:1)，混匀，8000rpm，4℃离心10min。

i.吸取上清液转移至另一灭菌的离心管中，加入50μlnaoac(3mol·l^-1ph＝5.2)，混匀，再加入1ml的无水乙醇(-20℃)，混匀，沉淀后离心，倒掉上清液。

j.用-20℃预冷的70％乙醇冲洗2～3次，放到超净工作台风干12h，加入100μl1×te溶解备用。

(2)est、ssr引物选取利用数据库信息，设计、最后筛选得到了83对分子特异性引物(引物对的序列如实施例1所示)，包括27对ssr引物和56对est引物，上述特异性引物由北京奥科鼎盛公司合成；

(3)利用表1中的每一对特异引物分别对8种待鉴定物种分别进行pcr扩增，每一种特异引物经过扩增后获得8种目的产物；

上述pcr扩增过程具体如下：

在s1000型热循环仪(bio-rad美国)上进行pcr扩增反应。

扩增体系为10μl：

扩增程序：

94℃预变性4min；

94℃变性45sec，

60℃退火45sec，

72℃延伸2min，

循环35次；

72℃延伸10min；

12℃保存。

(4)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

a制胶、电泳：用无水乙醇将玻璃板擦干净、晾干，利用夹子固定玻璃板，将40ml聚丙烯酰胺胶母液(acr:bis＝37.5:1，w/w)、400μl10％的过硫酸铵、40μltemed混匀，倒入玻璃板中，插入梳子，静置，凝固后拔下梳子，冲洗样孔，放入电泳槽中。在pcr扩增产物中加入2μl5×loadingdyebuffer，混匀，依次向点样孔中加样5μl，在160v恒压下电泳2.5-3.0h；

b银染、显影：电泳结束将聚丙烯酰胺凝胶放入0.1％的硝酸银溶液中，摇床轻摇5min，放入蒸馏水中漂洗30s，之后放入显影液(1.5％氢氧化钠、0.4％甲醛)中，摇床震荡，直至显出清晰的条带，记录，拍照。

每一组特异引物获得一张电泳图(每张电泳图上显示8个待鉴定物种，如普通小麦7182、中国春、十倍体长穗偃麦草、中间偃麦草、拟鹅观草、华山新麦草、滨麦及黑麦)，在获得的83张凝胶电泳图谱上，黑麦均出现特异性亮带(不同bp片段)，该结果验证了本申请设计的83对特异引物可以用以鉴定黑麦。由于实验附图具有83张，数量太多，无法一一展示，仅挑选亮带最明显或特异性较高的电泳图作为本实施例2的实验过程图，具体如图1-图5所示，从图中可以看出，至少在黑麦泳道出现了较亮或dna分子较多的亮带，其可充分证明本实施例2设计的83个引物对具有较高的特异性。本发明利用基因数据库信息，从pcr引物网站(http://wheat.pw.usda.gov/snp/new/pcr_primers.shtml)或者urgi(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)筛选出可用于鉴定黑麦的27个ssr分子特异性标记引物对和56个est分子特异性标记引物对，上述标记均可在黑麦中扩增出特异的条带，本发明的提供的上述83个特异性引物对在黑麦、普通小麦及中国春等间有显著差异。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。