本发明属于酿酒微生物技术领域,具体涉及一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途。
背景技术:
浓香型白酒是我国传统白酒中的典型代表之一,在世界范围内产生了广泛的影响,占有举足轻重的地位。现有的高通量测序研究表明,在浓香型白酒酒醅发酵中后期,细菌菌群中有90%以上为耐酸乳杆菌,这主要是因为耐酸乳杆菌能够耐受高乙醇浓度、高酸度、低含氧量等条件。而浓香型白酒发酵中后期是乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等风味物质形成的重要阶段,所以,作为优势菌的耐酸乳杆菌是形成这些风味物质的重要菌株,耐酸乳杆菌对白酒的风味具有重大贡献。因此,对耐酸乳杆菌的分离鉴定以了解其特性就显得非常重要。但在浓香型白酒中,关于耐酸乳杆菌的报道主要是dna序列信息方面,还没有关于分离鉴定获得耐酸乳杆菌菌株的相关报道。
技术实现要素:
本发明要解决的技术问题为:浓香型白酒发酵后期乙醇含量高,需要分离耐受乙醇浓度更高的菌株来适应的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为:提供一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。其保藏编号为cgmccno.16507。保藏时间为2018年9月20日,保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101。
其中,上述耐酸乳杆菌的16srdna序列具有如seqidno:1所示的核苷酸序列。
seqidno:1耐酸乳杆菌的16srdna核苷酸序列
ttcgggtatgaagttagggaagcgagcggcggatgggtgagtaacacgtgggtaacctaccctatagtctgggataccacttggaaacaggtgctaataccggataaaaggagagatcacatgatttctttttgaaaggcggcgtaagctgtcgctaaaggatggacccgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcaacgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttggtgaagaaagatagtgagagtaactgctcattatttgccggtaatcaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggaaagataagtcagatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaatagcatcggaaactgtctttcttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagatacctggtagtccatgctgtaaacgatgagtgctaagtgttgggaggtttccgcctctcagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatctagtgccaacctaagagattaggcgttcccttcggggacactaagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattattagttgccagcattaagttgggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagtacaacgaggagcgaacttgtgaaggcaagcgaatctctgaaagctgttctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaatg。
其中,上述耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的乙醇耐受浓度为≤15%,温度耐受为≤45℃,产乳酸能力为≤17.5g/l。
本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的细胞学特征为:菌体为杆状,菌落呈乳白色,圆形,表明光滑湿润、凸起、边缘整齐。
本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的生物学特征为:能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、土伦糖、塔格糖、核糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、n-乙酰葡萄糖胺、柠檬酸铁、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷或葡萄糖酸钾的至少一种。不能利用阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、来苏糖、岩藻糖、丙三醇、赤藻糖醇、卫矛醇、木糖醇、阿拉伯醇、甲基-β-d-吡喃木糖苷、甲基-α-d-吡喃甘露糖苷、甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷、菊粉、淀粉、糖原、2-酮基葡萄糖酸钾和5-酮基葡萄糖酸钾。
本发明还提供了一种上述耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌在酿酒中的用途。
本发明的有益效果为:本发明首次分离鉴定了一株耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌,该耐酸乳杆菌能耐受15%的乙醇,耐受45℃高温,产乳酸能力达到17.5g/l,是一株新型的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。本发明为有效提高乙醇耐受、高温耐受,提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源,具有很高的应用价值。
本发明提供的耐酸乳杆菌于2018年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc,保藏号为cgmccno.16507,生物学分类命名为耐酸乳杆菌lactobacillusacetotolerans。
附图说明
图1所示为本发明耐酸乳杆菌菌株形态图;
图2所示为耐酸乳杆菌的16srdna系统发育树图;
图3所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐乙醇能力图;
图4所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受温度图;
图5所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受盐度图;
图6所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受ph图。
具体实施方式
本发明提供了一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌,其保藏编号为cgmccno.16507。保藏时间为2018年9月20日,保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101。
本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的乙醇耐受浓度为≤15%,温度耐受为≤45℃,产乳酸能力为≤17.5g/l。
本发明的菌株是从宜宾五粮液股份有限公司酒醅中分离获得。
本发明的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌能耐受15%的乙醇,耐受45℃高温,产乳酸能力达到17.5g/l,是一株新型的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。本发明为有效提高乙醇耐受、高温耐受,提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源,具有很高的应用价值。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明,但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
若未特别指明,实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明使用的培养基mrs组成包括:酪蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰0.05g/l,吐温801g/l,ph自然。
斜面和平板培养基为相应mrs培养基中加入2%的琼脂粉。
实施例1耐酸乳杆菌lactobacillusacetotoleransr3的分离和鉴定
1、菌株的分离
发酵糟醅取自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间。取10g出窖的酒醅于90ml无菌生理盐水中,振荡混匀后取上清液进行梯度稀释,取10-2-10-5稀释液涂布于含溴甲酚绿的mrs平板上,37℃厌氧下培养7天,挑选平板上的菌落进行划线后培养,重复三次,直至分离获得纯化的菌株,斜面保存。菌株命名为r3。
2、菌株的形态学特征
分离得到的r3菌株为革兰氏阳性菌,短杆状,在mrs培养基上菌落为乳白色、表面湿润光滑、边缘整齐、中间凸起。
3、生理生化特性
分离得到的r3菌株能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、土伦糖、塔格糖、核糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、n-乙酰葡萄糖胺、柠檬酸铁、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷或葡萄糖酸钾中的至少一种。不能利用阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、来苏糖、岩藻糖、丙三醇、赤藻糖醇、卫矛醇、木糖醇、阿拉伯醇、甲基-β-d-吡喃木糖苷、甲基-α-d-吡喃甘露糖苷、甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷、菊粉、淀粉、糖原、2-酮基葡萄糖酸钾和5-酮基葡萄糖酸钾。
4、16srdna鉴定
将菌株r3接种于mrs培养基中,37℃厌氧下培养7天,取1ml菌液,离心收集菌体,用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna,-20℃保藏备用。
利用引物27f和1492r对细菌基因组16srdna进行扩增,27f:agtttgatcmtggctcag(seqidno:2),1492r:ggttaccttgttacgactt(seqidno:3)。
扩增体系(共25μl):10×pcrbuffer2.5μl,dntp(2.5mmol/leach)1μl,dna10ng,引物f(10μmol/l)0.5μl,引物r(10μmol/l)0.5μl,加双蒸水至25μl。扩增程序::94℃4min;94℃45s,55℃45s,72℃60s,共30个循环;72℃10min,4℃终止反应。
16srdna序列测定:利用胶回收试剂盒进行pcr扩增产物的纯化;纯化产物的测序工作由上海生工生物有限公司完成,测定结果得到菌株r3的16srdna序列如seqidno:1所示。
系统发育树构建:将所测定的细菌16srdna基因序列分别与genbank数据库进行blastn和rdpclassifier相似性分析,选取与实验菌株亲缘关系相对较近的标准菌株用clustalw软件进行序列比对,采用mega5软件进行系统发育分析,构建系统发育树,如图2所示。
综合菌体形态、生理生化特性和16srdna基因序列,将菌株r3鉴定为耐酸乳杆菌(lactobacillusacetotolerans)。该菌株r3于2018年9月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为cgmccno.16507。
实施例2耐酸乳杆菌r3的产乳酸能力试验
采用高效液相色谱法检测耐酸乳杆菌r3的产乳酸能力。
将菌株r3接种于液体mrs培养基中活化,培养到对数生长期od600=1.8,按照体积比5%的接种量接种到100ml液体mrs培养基,37℃厌氧盒培养7天。采用hplc测定乳酸含量。
前处理:取发酵液0.1ml,以0.1%的磷酸水溶液稀释至1ml,于2ml离心管中,振荡均匀,0.2μm滤膜过滤后作为待测样品。
hplc条件:柱温30℃。流动相:a:甲醇;b:0.1%的磷酸水溶液。梯度洗脱:0min:100b;8min:100b;25min:10b;28.5min:10b;29min:100b;35min:100b;停止:35min;流速:1.0ml/min。乳酸标准曲线:标准曲线为:y=0.284x-3.0446,r2=0.9999。
实验结果为:乳酸含量为17.5g/l。
实施例3耐酸乳杆菌r3的耐乙醇能力试验
将菌株lactobacillusacetotoleransr3和模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720均接种于液体mrs培养基中活化,培养到对数生长期od600=1.8,按照体积比5%的接种量均接种到含不同浓度乙醇(2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、15%和16%)的100ml液体mrs培养基,37℃厌氧下培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(eppendorfbiospectrometer)测定吸光度od600。计算培养后与前的od600差值,结果如图3所示。
由图3可知,菌株lactobacillusacetotoleransr3在乙醇浓度为15%的mrs培养基中培养后其od600差值为1.15,而当乙醇浓度为16%时,其od600差值几乎为0,表明基本不生长。因此lactobacillusacetotoleransr3的乙醇耐受能力为15%。相比模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720的乙醇耐受能力为12%,菌株lactobacillusacetotoleransr3的耐乙醇能力增强。
实施例4耐酸乳杆菌r3的耐温度能力试验
将菌株lactobacillusacetotoleransr3和模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720均接种于液体mrs培养基中活化,培养到对数生长期od600=1.8,按照体积比5%的接种量均接种到100ml液体mrs培养基,分别放置在不同温度(30、35、40、45、50和55℃)的培养箱中厌氧下培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(eppendorfbiospectrometer)测定吸光度od600。计算培养后与前的od600差值,结果如图4所示。
由图4可知,菌株lactobacillusacetotoleransr3在45℃培养后其od600差值为1.41,而当温度为50℃时,其od600差值几乎为0,表明基本不生长。因此菌株lactobacillusacetotoleransr3的温度耐受能力为45℃。相比模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720的乙醇耐受能力为40℃,耐高温能力增强。
实施例5耐酸乳杆菌r3的耐盐能力
将菌株lactobacillusacetotoleransr3和模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720均接种于液体mrs培养基中活化,培养到对数生长期od600=1.8,按照体积比5%的接种量均接种到含不同nacl(2%、4%、6%、8%、9%和10%)的100ml液体mrs培养基,37℃厌氧盒培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(eppendorfbiospectrometer)测定吸光度od600。计算培养后与前的od600差值,结果如图5所示。
由图5可知,菌株lactobacillusacetotoleransr3在nacl为8%的mrs培养基中培养后其od600差值为1.38,而当乙醇浓度为9%时,其od600差值负,表明不生长。因此菌株lactobacillusacetotoleransr3的nacl耐受能力为8%。相比模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720的nacl耐受能力为4%,耐盐能力增强。
实施例6耐酸乳杆菌r3的耐酸能力
将菌株lactobacillusacetotoleransr3和模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720均接种于液体mrs培养基中活化,培养到对数生长期od600=1.8,按照体积比5%的接种量均接种到含不同ph(7、6、5、4、3、2和1.8)的100ml液体mrs培养基,用盐酸调节ph,在37℃厌氧盒培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(eppendorfbiospectrometer)测定吸光度od600。计算培养后与前的od600差值,结果如图6所示。
由图6可知,菌株lactobacillusacetotoleransr3在ph为2的mrs培养基中培养后其od600差值为0.50,而当乙醇浓度为1.8时,其od600差值负,表明不生长。因此,菌株lactobacillusacetotoleransr3的ph耐受能力为2。模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720的ph耐受能力也为2。本发明的菌株r3与现有的耐酸乳杆菌耐ph能力相当。
序列表
<110>宜宾五粮液股份有限公司
<120>耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途
<130>a181256k
<141>2018-11-27
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1369
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<213>人工序列(artificialsequence)
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