增强成纤维细胞治疗活性的方法与流程
本申请要求于2017年1月11日提交的美国临时申请62/445,133的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
本公开的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、生物化学和医学领域。
背景技术：
脊柱的肌肉骨骼病症的发生很常见地与令人衰弱的背痛相关，导致巨大的社会心理后果和经济后果。下腰痛是45岁以下的人残疾的主要来源，其导致大量的经济损失[1]。美国80％的人在其生命的某一时段将会经历背痛[2]，其是因症状去看医生的第二大最常见原因[3]。背痛的原因包括损伤诱发，其作为小问题存在，加速形成慢性病症，以及退行性脊柱疾病，退行性脊柱疾病导致退行性脊柱滑脱和脊柱狭窄。绝大多数慢性背痛与椎间盘的退变有关，其可以表现为许多不同的临床病况，包括脊柱狭窄和不稳定、神经根病、脊髓病和椎间盘突出。
尽管椎间盘退变和慢性背痛之间建立了关联关系，但事实是椎间盘退变可以在没有背痛的情况下发生。已知椎间盘退变在许多个体中作为自然过程无症状地存在。因此疼痛的起源被称作“椎间盘源性的”，不一定是因为椎间盘退变过程引起的，而是部分由侵袭椎间隙并引起炎症和伤害感受的肉芽组织导致[4]。
存在一种流行的观点，即大多数与椎间盘退变相关的下腰痛由神经根压迫(神经根痛)引起；然而，多次磁共振成像没有检测到神经压迫，甚至在患有坐骨神经痛的患者中也没有检测到[5]。最近的研究表明腰椎间盘突出本身不是下腰痛的主要病因，而是椎间盘源性疼痛由纤维环破裂(诸如纤维环撕裂)导致[6-9]。纤维环本身被各种各样的神经末梢围绕这一事实提供了与纤维环破裂相关的炎症是引发疼痛的原因的可能性[10]。
大体上来说，椎间盘退变早至生命的前十年就开始了，此时各种生化变化在终板和髓核中变得很明显[11]。随后，在第二个十年中，脊索细胞开始经历被软骨细胞替代。在第三个十年中，发生精细纤维结缔组织网络的损失并被透明样化的胶原纤维替代，同时开始产生纤维环中的裂隙。在第四个十年中开始和在第五个十年中几乎总存在的是髓核胶冻样物质被类似纤维环的纤维状ii型胶原结构替代。到第七个十年，髓核完全缺少携带水的蛋白聚糖块，相反是空的或填充以非晶态物质。在此天然过程期间，含有用于纤维环和髓核的血管的软骨终板逐渐被纤维软骨替代，并且血流进行性地消失。由于供溶质与椎间盘外的血管交换的仅有的2条路线是经过纤维环的外周，以及通过终板，终板血供的自然退变导致髓核细胞发挥功能/存活的能力下降，由此引起蛋白聚糖合成减少和椎间盘退变[12]。
髓核中蛋白聚糖的合成天然地通过髓核的细胞成分发生。特异性生长因子诸如tgf-b和egf参与对蛋白聚糖合成的刺激。有趣的是，在患有退行性椎间盘病的患者中，与健康的髓核细胞相比这些细胞因子的量是减少的[13]。抑制蛋白聚糖合成的另一原因是由腰椎区域缺血引起的低ph[14]。另一方面，已知基质金属蛋白酶参与裂解蛋白聚糖，并且基质金属蛋白酶活性的上调与椎间盘退变有关[15]。基质金属蛋白酶的活化已知受炎性细胞因子诸如tnf和il-1的诱导[16]。另外，动物研究已经证明椎间盘节段的超生理负荷诱导基质金属蛋白酶的上调[17]。
因此，似乎下腰痛至少在大比例的患者中是由与腰间盘退变结合发生的炎性事件引起的。在研究中建立了炎症和疼痛之间的联系，研究显示放射线检查发现的退变的椎间盘与大量受试者中的大部分无关。相反，局部炎症的存在与椎间盘退变相关，如通过肉芽组织的存在所例证，据信肉芽组织是慢性难治性下腰痛的伤害感受和症状的病因[10,18]。
尽管椎间盘退变在全世界仍然具有巨大的和不断增加的影响，但目前的治疗选项并没有解决根本原因。这些治疗选项包括在病理学的早期的卧床休息、非甾体抗炎药物，以及当之前的方式不能减轻疼痛时后期的程序诸如椎间盘切除术、关节成形术(关节置换)、注射人工髓核和融合。诸如之前提到的方式不仅是不可预测的，而且几乎仅仅处置终末期临床表现，因此不会改变疾病过程本身。另外，诸如椎体融合的程序由于改变了工作载荷的生物力学分布从而导致在邻接的椎间盘中椎间盘退变的发生率增加。
最近生物技术的进展以及我们对生物化学构成和椎间盘环境的理解增加了对退变过程的兴趣以及开发直接针对椎间盘保留的新疗法的可能性。发现对椎间盘内基质合成和分解代谢具有显著影响的某些基因已经为科学家寻求改变两者之间平衡提供了靶标。为此，在过去数年中更多的注意力集中于基因疗法，并且这些努力就其在治疗椎间盘退变的用途方面已经产生了有希望的临床前结果[19]。
目前，还没有生物治疗可广泛获得用于椎间盘退变。然而，正在调研具有潜在治疗益处的许多不同的分子。分子疗法的焦点是预防或逆转椎间盘细胞外基质中这些改变的一个或多个方面。至少4种不同类型的分子可以在椎间盘修复中有效。这些包括抗分解代谢物、有丝分裂原、软骨发生成形素和细胞内调节物[20-22]。
如上所述，椎间盘退变的标志包括椎间盘基质中的蛋白聚糖、水和ii型胶原的损失。此外，基质中的定性变化不太明确，包括较高分子量蛋白聚糖的损失，以及较难量化的其他变化(胶原交联、蛋白聚糖的组织等)。椎间盘退变中的重要过程似乎是髓核中的分化的软骨细胞表型改变成更加纤维化的表型。椎间盘基质中的这些改变一起导致椎间盘和脊椎解剖的改变，这一改变最终与病理状况有关[23,24]。
因为基质损失是基质合成和降解之间的平衡，因此有可能通过增加合成或通过减少降解来增加椎间盘基质。一种方式是通过抑制降解酶来防止基质损失。
降解的椎间盘具有升高浓度的基质金属蛋白酶(mmp)。在基质内，mmp活性通常被mmp的组织抑制剂(timp)抑制[25-27]。wallach等人利用体外实验测试了这些抗分解代谢分子之一timp-1是否可以增加基质蛋白聚糖的积累。研究者发现实际上椎间盘细胞中的timp-1表达增加了蛋白聚糖的积累，并且还增加了蛋白聚糖的“测量的合成速率”[27]。
软骨发生成形素是不仅拥有有丝分裂能力而且其特征是它们增加靶细胞的软骨细胞特异性表型的能力的细胞因子。大多数对软骨发生成形素的研究利用了转化生长因子-b(tgf-b)、骨形态发生蛋白(bmp)或生长和分化因子(gdf)。软骨发生成形素是特别有吸引力的，因为它们可以将椎间盘细胞的纤维状表型逆转为较年轻的更多“正常”椎间盘中的椎间盘髓核细胞的更多的软骨细胞表型。作为定义，这些分子是分泌的分子，并且因此可以潜在地以自分泌、旁分泌和内分泌的方式起作用。tgf-b1是被研究的第一批椎间盘形态发生分子之一。thompson等人报道了tgf-b1是有丝分裂原而且显示其是高度同化的分子，导致每个细胞的蛋白聚糖合成显著增加。使用腺病毒/cmv载体对tgf-b的基因转移能够逆转兔模型中椎间盘退变的放射学表现[28]。
bmp-2是另一种原型软骨发生成形素[29]。yoon等人报道了重组人bmp-2增加大鼠椎间盘细胞蛋白聚糖的产生并且显著增加椎间盘细胞的软骨细胞表型，如通过增加的聚集蛋白聚糖和ii型胶原蛋白基因表达，而i型胶原蛋白基因表达没有变化[30]。kim等人报道bmp-2可以部分地逆转烟碱对椎间盘细胞蛋白聚糖合成的抑制效应[31]。bmp-7也已知为op-1(成骨蛋白-1),其是另一种椎间盘细胞成形素，已经证明其在体外具有增强椎间盘细胞中的基质形成的强力活性[32-34]。gdf-5也已知为cdmp-1，其也被认为用于椎间盘细胞的再生，尽管这仅在体外实验中发生[35]。
本公开涉及满足本领域中对退行性椎间盘修复的长久需求的方法和组合物。
技术实现要素：
本公开涉及与可用于个体中的疗法的某些细胞相关的方法和组合物，所述疗法诸如哺乳动物的一个或多个椎间盘中的疗法。在具体实施方案中，所述细胞是成纤维细胞，在特定情况下，成纤维细胞在暴露于一种或多种生物活性物质和/或一种或多种条件后被修饰。在某些实施方案中，与缺少所述暴露的成纤维细胞相比，所述暴露提高一种或多种治疗活性。尽管成纤维细胞的任何特定的治疗活性可以在暴露于一种或多种生物活性物质和/或一种或多种条件后被增强，但在一些情况下，作为例子，所述活性是抗炎、血管生成、再生和/或椎间盘再生特性。在其中成纤维细胞具有提高的活性的具体实例中，成纤维细胞是缓解与个体的一个或多个椎间盘相关的医学病况的至少一种症状的直接或间接原因。
在特定实施方案中，本公开的方法直接或间接导致椎间盘基质的增加，包括通过增加椎间盘中的合成，通过减少降解，和/或通过抑制降解酶来防止基质损失。
在一个实施方案中，提供了增加成纤维细胞再生细胞和/或组织的功效的方法，包括下述步骤：(任选地)获得成纤维细胞；使成纤维细胞与一种或多种生物活性物质接触；和/或在提高所述成纤维细胞用于再生细胞和/或组织的功效的条件下培养所述成纤维细胞。在具体实施方案中，所述一种或多种生物活性物质包括一种或多种细胞因子,诸如生长因子(例如，fgf-α、fgf-β、和/或tgf-β家族成员)。在具体实例中，所述一种或多种生物活性物质包括富血小板血浆。在特定实施方案中，成纤维细胞对细胞和/或组织的再生包括免疫调节、血管生成、椎间盘的再生，其组合，等等。
被利用的成纤维细胞可以选自由下列各项组成的组：(a)通过活检、培养和增殖获得的成纤维细胞；(b)其具有更大分化能力的亚组；和(c)它们的组合。在具体例子中，成纤维细胞表达阶段特异性胚胎抗原3(ssea3)。在某些例子中，成纤维细胞包含在选自由下列各项组成的组的药学上可接受的载体中：无菌溶液、水凝胶、可植入的细胞基质、装置及其组合。
本公开的实施方案包括用于增加成纤维细胞中的pd-1l表达、通过成纤维细胞抑制t-细胞活化和/或通过成纤维细胞抑制t-细胞产生一种或多种因子(诸如γ干扰素)的方法。
前面已经相当广义地概述了本公开的特征和技术优点以便可以更好地理解后续的详述。下文将描述另外的特征和优点，它们形成本发明的权利要求书的主题。本领域技术人员应当理解，公开的概念和具体实施方案可以容易地被用作用于修改或设计为实现本设计的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应当认识到这样的等效构造没有偏离如附带的权利要求中所示的精神和范围。当与附图结合考虑时，据信是本文公开的设计特有的新特征，关于组织和操作方法两者，与进一步的目的和优点一起将从下面的描述得到更好的理解。然而，要特别地理解，每一张附图仅被提供用于说明和描述的目的，并不意在被定义为是对本公开的限制。
附图说明
为了更完整地理解本公开，现在结合附图参考下面的描述，在附图中：
图1显示了递增量的富血小板血浆对成纤维细胞中pd-1l表达的作用；
图2显示了递增量的富血小板血浆对成纤维细胞抑制t细胞活化的作用；
图3证明了递增量的富血小板血浆对成纤维细胞抑制t细胞产生γ干扰素的作用。
详述
i.定义的实例
与长久的专利法惯例保持一致，当在本说明书中与词语“包括”一起使用时(包括在权利要求书中)，词语“一个”和“一种”是指“一个或多个/一种或多种”。本发明的一些实施方案可以由本发明的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由本发明的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。认为本文所述的任何方法或组合物可以关于本文所述的任何其他方法或组合物来实现。
在本公开中使用的“生物相容性聚合物”选自由下列各项组成的组：卡波姆(与聚链烯基聚醚交联的丙烯酸聚合物)、聚烷撑二醇(例如，聚乙二醇和聚丙二醇)、泊洛沙姆(聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)、聚酯、聚醚、聚酐、聚丙烯酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮和多糖诸如，例如，透明质酸，透明质酸衍生物，特别是交联的透明质酸和透明质酸的酯类(例如，透明质酸的苄基酯)、羟烷基纤维素(例如，羟甲基纤维素和羟乙基纤维素)、和羧烷基纤维素(例如，羧甲基纤维素)。
“生长因子”是指具有对活组织有正性反应(诸如促进组织的生长)的任意的一种或多种材料。示例性的生长因子包括，但不限于，血小板衍生生长因子(pdgf)、血小板衍生血管生成因子(pdaf)、血管内皮生长因子(vegf)、血小板衍生表皮生长因子(pdegf)、血小板因子4(pf-4)、转化生长因子β(tgf-b)、酸性成纤维细胞生长因子(fgf-a)、碱性成纤维细胞生长因子(fgf-b)、转化生长因子a(tgf-a)、胰岛素样生长因子1和2(igf-1和igf-2)、b血小板球蛋白相关蛋白质(btg)、血小板反应蛋白(tsp)、纤连蛋白、vonwallinbrand因子(vwf)、纤维肽a、纤维蛋白原、白蛋白,纤溶酶原激活物抑制剂1(pai-1)、骨粘连蛋白、受激活调节的正常t细胞表达和推测分泌的因子(rantes)、gro-a、玻璃粘连蛋白、纤维蛋白d-二聚物、v因子、抗凝血酶iii、免疫球蛋白-g(igg),免疫球蛋白-m(igm)、免疫球蛋白-a(iga),a2-巨球蛋白、血管生成素、fg-d、弹性蛋白酶、角质细胞生长因子(kgf)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、肿瘤坏死因子(tnf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和白介素-1(il-1)、角质细胞生长因子-2(kgf-2)及其组合。上面列举的生长因子的一个共同的重要特性是每个物质已知或据信对活组织具有正性反应(已知为生物活性)以提高细胞或组织生长。
术语“再生”当在本文中使用时是指一个区域诸如受损伤区域，包括椎间盘中的新细胞和/或组织的生长。
术语“治疗有效量”当在本文中使用时是指当施用于个体用于治疗疾病时足以对所述疾病实现此种治疗，包括减轻所述疾病的至少一个症状的量。
ii.一般实施方案
本公开涉及增加成纤维细胞的治疗活性的手段，所述成纤维细胞诸如至少用于在体内一个或多个部位处的抗炎、血管生成、再生和/或椎间盘再生特性的成纤维细胞。在本公开的一个实施方案中，成纤维细胞在施用于个体之前与细胞因子、生长因子、肽或其组合一起培养，所述个体诸如哺乳动物，包括人、马、狗、猫，等等。在另一个实施方案中，本公开涵盖增加待用作治疗剂的成纤维细胞的再生活性，例如通过与一种或多种药剂培养(在施用于个体之前和/或期间)，所述药剂诸如富血小板血浆(prp)。在另一个实施方案中，本公开提供了通过共同施用一种或多种药剂和/或prp，例如与成纤维细胞一起施用，来增强一种或多种用于治疗活性的成纤维细胞活性的方法。在特定的实例中，所述增强的成纤维细胞被递送至个体用于治疗所述个体中的椎间盘医学病况的目的。在一些实例中，个体被确定为需要所述增强的成纤维细胞，诸如由于其椎间盘受损或具有椎间盘受损的风险。处于风险中的个体为年龄超过约40、45、50、55、60、65、70、75、80等的个体；为运动员或曾是运动员的个体；具有需要体力活动的职业的个体；具有脊柱损伤的个体；或其组合。
在一些实施方案中，成纤维细胞暴露于富血小板血浆并且这种暴露直接或间接地产生增强的成纤维细胞。大量的生长因子、细胞因子和肽从激活的血小板中释放出来，并且治疗性地利用此的一种方式是利用悬浮于血浆中的自体血小板浓缩物，也称为富血小板血浆(prp)。制备prp的几种手段在本领域中是已知的，其中一些描述于下面的文献[36,37]中，所述文献通过引用并入本文。用于生成prp的装置的实例包括例如，smartprep、3ipccs、sequestra、secquire、cats、interporecross、biometgps和harvest’sbmac[38]。生成prp的其他手段描述于美国专利号5,585,007；5,599,558；5,614,204；6,214,338；6,010,627；5,165,928；6,303,112；6,649,072；和6,649,072中,这些专利的全部内容通过引用并入本文。在具体的实施方案中，可以在个体注射的时候给予prp，诸如不需要提前与成纤维细胞一起培养。
在本公开的一个实施方案中，将成纤维细胞全身或局部递送到有需要的个体，包括需要治疗的个体，包括通过使用包含富血小板血浆(prp)和/或透明质酸(ha)的载体(例如，水凝胶)；在特定的实例中，prp和/或ha掺加作为胶凝剂的巴曲酶(btx)。成纤维细胞可以包封在水凝胶中，诸如prp/ha/btx水凝胶,并且例如，在生长培养基和/或含有或不含有(例如)tgf-β1的培养基两者中培养持续特定的时间段，诸如从1分钟(min)至21天。对于任意细胞的培养持续时间的范围可以为从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟(或更多分钟或从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或更多小时)至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。时间范围可以为从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多分钟至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或更多小时。
在一个实施方案中，水凝胶在特定的温度下在特定的时间段内凝胶化。水凝胶可以在18、19、20、21、22、23、24、25℃或更高的℃下在10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟或更多时间内，或在35、36、37、38、39、或40℃或更高的℃下在1、2、3、4、5或更多的分钟内以下述的方式凝胶化：使得所述成纤维细胞维持高细胞活力和增殖。在一个实施方案中，本公开涵盖成纤维细胞用于在患有退行性椎间盘疾病的个体中局部递送(诸如通过盘内注射)的用途。在这样的实施方案中，成纤维细胞在合适的条件下培养以提高gag的产生，在至少一些情况下这通过与一种或多种细胞因子(诸如tgf-β)一起培养来实现。用于生长间充质干细胞的方法在下面的文献[39]中提供，所述文献通过引用并入，所述方法可以被改良用于成纤维细胞专用。
本公开涵盖在治疗使用前活化成纤维细胞的用途，包括施用一种或多种充当成纤维细胞的“再生辅剂”的生物活性物质。在制剂中的细胞当以培养单层生长时可以表现出典型的成纤维细胞形态。具体地，细胞可以表现出细长的、纺锤形或纺锤体外观，具有狭长的突起，或细胞可以看上去为可以具有细胞质前缘的较大的扁平的星形细胞。还可以观察到这些形态的混合体。细胞可以表达正常成纤维细胞特有的一种或多种蛋白，包括例如，成纤维细胞特异性标志物cd90(thy-1),一种35kda细胞表面糖蛋白，以及细胞外基质蛋白胶原蛋白。在具体实施方案中，成纤维细胞剂型可以是自体的、同种异体的或异种的细胞治疗产品，其包含成纤维细胞悬液，包括例如，使用标准组织培养程序从皮肤生长的成纤维细胞悬液。
iii.细胞收获、培养和扩增技术的实施例
在某些实施方案中，任意类型的成纤维细胞被用于再生的方法中，并且在用于这些方法的制剂(或作为一部分)中，成纤维细胞可以使用特定的技术收获、培养和扩增。
在一个实施方案中，在本公开中使用的成纤维细胞通过从受体自身皮肤(在自体制剂的情况下)的活检组织，或一个或多个健康供体的皮肤(对于同种异体制剂)长出而生成，或可以采用其组合。在一些实施方案中，使用来自年轻供体的成纤维细胞，尽管在其他情况下，成纤维细胞不来自年轻供体，并且可以是成年的，包括例如，中年的。在另一个实施方案中，成纤维细胞用编码一种或多种基因产物的多核苷酸转染，例如，以允许增强生长和克服海弗利克极限(hayflicklimit)。
在获得细胞后，可以使用标准细胞培养技术在培养中进行扩增。皮肤组织(真皮和表皮层)可以从受试者的耳廓后区域取活检获得，尽管它们可以来自其他区域，诸如乳房或胃部区域。在一个实施方案中，起始材料包括使用标准无菌操作采集的多个(诸如两个、三个、四个或更多个)3-mm钻孔皮肤活检标本。由个体采集活检标本并置于包含标准培养基的容器(诸如小瓶)中，所述标准培养基诸如包含无菌磷酸缓冲盐水(pbs)。在适宜的条件下将活检标本转移到生产设备。在一个实施方案中，在到达生产设备后，检查活检标本，验收合格后，直接转移到生产区。在工序开始后，然后在酶消化之前洗涤活检组织。洗涤后，加入释放酶消化酶溶液(liberasedigestiveenzymesolution)，无需切碎，将活检组织孵育持续合适的时间，并且使用合适的温度，诸如在37.0±2℃持续1小时。活检组织消化的时间是可以影响培养细胞的活力和生长速率的工艺参数，并且可以常规地优化。所述工序的实例如下：可以使用释放酶，所述释放酶是由lonzawalkersville,inc.(walkersville,md.)配制获得的以及由rochediagnosticscorp.(indianapolis,ind.)未经配制获得的胶原酶/蛋白酶混合物。备选地，可以使用其他市售的胶原酶，诸如servacollagenasenb6(helidelburg,德国)。在消化后，加入初始生长培养基(imdm,ga,10％胎牛血清(fbs))以中和酶，通过离心沉淀细胞，并将细胞重新悬浮于5.0ml初始生长培养基。备选地，不进行离心，通过仅添加初始生长培养基而发生酶的完全灭活。加入初始生长培养基，然后将细胞悬液接种至t-175细胞培养瓶用于起始细胞生长和扩增。可以使用t-75、t-150、t-185或t-225培养瓶代替t-75培养瓶。细胞在37±2.0℃，利用5.0±1.0％co2孵育，每3-5天加料以新鲜的完全生长培养基。在工序中的所有加料通过移除一半完全生长培养基并用新鲜培养基替换相同体积来进行。备选地，可以进行完全的加料。在传代之前细胞不应当在t-175培养瓶中保持超过30天。在整个工序期间监测汇合以确保在培养分瓶期间足够的接种密度。当在t-175培养瓶中细胞汇合大于或等于40％时，通过移除消耗过的培养基、洗涤细胞并用胰蛋白酶-edta处理以将培养瓶中的贴壁细胞释放到溶液中来将它们传代。然后细胞用胰蛋白酶消化并接种到t-500培养瓶中用于继续细胞扩增。备选地，可以使用一个或两个t-300培养瓶、一层细胞培养容器(cellstack)(1cs)、一层cellfactory(1cf)或两层细胞培养容器(2cs)来代替t-500培养瓶。在每次传代时和收获前评估形态，以监控整个工序过程中的培养纯度。通过将所观察的样品与用于形态学检验细胞培养物的肉眼标准进行比较来评估形态。细胞当以培养单层生长时表现出典型的成纤维细胞形态。细胞可以表现出细长的、纺锤形或纺锤体外观，具有狭长的突起，或看上去为可以具有细胞质前缘的较大的扁平的星形细胞。也可以观察到这些形态的混合物。在汇合较少的区域中的成纤维细胞可以形成类似的形状，但方向随机。还评估细胞培养物中角质细胞的存在。角质细胞看上去是不规则的圆形，并且在较高的汇合程度下，它们看上去组织成鹅卵石状。在较低的汇合程度下，可观察到角质细胞为小的集落。细胞在37±2.0℃利用5.0.+-.1.0％co2孵育，并每3-5天在t-500培养瓶和每5-7天在10层细胞培养容器(10cs)中传代。在传代前细胞不应当在t-500培养瓶中保持超过10天。用于散装原料药安全性的质量控制(qc)出厂检验包括无菌和内毒素测试。当在t-500培养瓶中的细胞汇合度为95％时，将细胞传代至10cs培养容器。备选地，可以使用两个5层cellstacks(5cs)或10层cellfactory(10cf)代替10cs。向10cs的传代通过下述步骤进行：移除消耗过的培养基，洗涤细胞，并用胰蛋白酶-edta处理从而将培养瓶中的贴壁细胞释放到溶液中。然后将细胞转移到10cs。加入额外的完全培养基以中和胰蛋白酶，并将来自t-500培养瓶的细胞吸取到含有新鲜完全培养基的2l瓶。将该2l瓶的内容物转移到10cs中并在所有层上接种。然后细胞在37±2.0℃利用5.0±1.0％co2孵育，并且每5-7天加入新鲜完全培养基。在传代前细胞不应当在10cs中保持超过20天。在一个实施方案中，通过将扩增的成纤维细胞在无蛋白培养基中孵育一段时间，使得传代的真皮成纤维细胞基本上不含有培养基中存在的免疫原性蛋白质。初次收获，当10cs中的细胞汇合度为95％以上时，收获细胞。通过移除消耗过的培养基，洗涤细胞，用胰蛋白酶-edta处理从而将贴壁细胞释放到溶液中，并添加额外的完全培养基以中和胰蛋白酶来进行收获。通过离心收集细胞，重新悬浮，并进行工序内qc测试以确定总活细胞计数和细胞活力。
在一些实施方案中，当在接收到来自初步10cs收获的细胞计数结果后需要大量细胞时，在多个多层细胞培养容器(至多4个10cs)中进行附加传代。对于附加传代，将来自初步收获的细胞加入至2l含有新鲜完全生长培养基的培养基瓶中。将重新悬浮的细胞加入至多个多层细胞培养容器并在37±2.0℃利用5.0.+-.1.0％co2孵育。如上所述向多层细胞容器加料并收获，不同之处为在细胞收获之前细胞汇合度必须为80％或更高。收获程序与上面对初步收获所述相同。收集来自细胞和消耗过的培养基的支原体样品，并如上面对初步收获所述进行细胞计数和活力确定。该方法通过避免从动物来源的试剂引入免疫原性蛋白而减少了或消除了免疫原性蛋白。为了减少工序残留物，在无蛋白冷冻培养基中低温保存细胞，然后解冻，并在制备最终的注射液之前洗涤以进一步减少剩余的残留物。如果在来自附加传代的细胞的收获和低温保存完成后需要附加的原料药，则将冷冻的原料药的等分试样—冻存管解冻并用来接种5cs或10cs培养容器。备选地，可以用一个4层cellfactory(4cf)、两个4cf、或两个5cs来代替一个5cs或10cs。将细胞的冷冻的冻存管解冻，洗涤，加入至含有新鲜完全生长培养基的2l培养基瓶中并如上所述培养、收获和低温保存。加入细胞悬液。在细胞收获前细胞汇合度必须为80％或更高。
在完成培养扩增后，收获细胞并洗涤，然后配制为含有1.0-2.7x107个细胞/ml，目标为2.2x107个细胞/ml。备选地，目标可以在适应于不同的适应症剂量的配制范围内调整。原料药由悬浮在冷冻保存培养基中的有活力的自体人成纤维细胞群组成，所述冷冻保存培养基由iscove改良的杜尔伯克培养基(imdm)和profreeze-cdm.tm.(lonza,walkerville,md.)加7.5％二甲基亚砜(dmso)组成。备选地，可以使用较低的dmso浓度来代替7.5％，或cryostor.tm.cs5或cryostor.tm.cs10(biolifesolutions,bothell,wash.)可以用来代替imdm/profreeze/dmso。除了细胞计数和活力，进行原料药的纯度/身份测定，并且必须确认悬液含有98％或更多的成纤维细胞。常见的细胞污染物包括角质细胞。纯度/身份测定采用荧光标记的针对cd90和cd104(分别是成纤维细胞和角质细胞的细胞表面标志物)的抗体以量化成纤维细胞群的纯度百分比。cd90(thy-1)是35kda细胞表面糖蛋白。已经显示针对cd90蛋白的抗体表现出对人成纤维细胞的高度特异性。cd104,即整合素β4链，是205kda跨膜糖蛋白，其与整合素α6链(cd49f)缔合形成α6/β4复合物。此复合物已经显示充当角质细胞的分子标志物(adams和watt1991)。
针对cd104蛋白的抗体与100％的人角质细胞结合。通过将样品与viacount染料试剂孵育并使用guavapca系统分析样品来确定细胞计数和活力。该试剂由膜渗透性染料和膜不渗透性染料这两种染料组成，膜渗透性染色所有有核细胞，膜不渗透性染料仅染色损伤或死亡的细胞。这种染料组合的使用能够使guavapca系统评估样品中存在的细胞的总数目，并且确定哪些细胞是有活力的、凋亡的或死亡的。该方法被定制开发专门用于确定培养的自体成纤维细胞的纯度/身份。备选地，细胞可以从t-175培养瓶(或替代品)或t-500培养瓶(或替代品)传代到含有作为细胞生长表面的微载体的转瓶。微载体是小的珠状结构，其用作悬浮培养中的贴壁细胞的生长表面。它们被设计为以小的体积产生大的细胞产量。在此装置中，将体积为50ml-300ml的完全生长培养基加入到500ml、1l或2l无菌的一次性转瓶中。将无菌的微载体加入到转瓶中。使培养物保持静止或将培养物置于搅拌台上以低rpm(15-30rrm)在37±2.0℃利用5.0±1.0％co2孵箱保持短时间(1-24小时)以允许细胞贴附在载体上。在贴壁期后，增加旋转台的速度(30-120rpm)。每1-5天或当通过颜色改变看上去培养基被消耗时对细胞供给新鲜的完全生长培养基。通过对微载体取样、分离细胞并进行细胞计数和活力分析，定期收集细胞。每个载体的细胞浓度用来确定何时扩大培养规模。当生产了足够的细胞时，用pbs洗涤细胞并使用胰蛋白酶-edta从微载体收获细胞，并以更大量的微载体和更高体积的完全生长培养基(300ml-2l)将细胞接种回转瓶。备选地，可以向含有已有微载体培养物的转瓶中直接加入额外的微载体和完全生长培养基，允许细胞的直接珠-珠转移，无需使用胰蛋白酶消化和再接种。备选地，如果从初始的t-175或t-500培养瓶中产生了足够的细胞，则可以将细胞直接接种到扩大量的微载体。在贴壁期后，增加旋转台的速度(30-120rpm)。每1-5天或当通过颜色改变看上去培养基被消耗时对细胞供给新鲜的完全生长培养基。当浓度达到目标适应症所需的细胞计数时，用pbs洗涤细胞，并使用胰蛋白酶-edta收获细胞。在一次性旋转瓶内使用的微载体可以由聚合混合物诸如bionoc
在另一个实施方案中，细胞在聚合混合物2d微载体诸如bionocii.rtm.和
备选地，ace系统可以是包括一次性组件的按比例缩小的、单批单元形式，所述一次性组件由细胞生长表面、输送管道、培养基和试剂以及永久性基座组成，所述永久性基座容纳用于加热/冷却、培养基转移和执行自动化编程循环的机器部件和计算机处理能力。一旦接收，每个无菌辐照的ace一次性单元将从其包装上解开并且通过悬挂预先填充的袋子并经由无菌连接器将所述袋子连接到已有管道来负载培养基和试剂。在具体实施方案中，该过程如下继续进行：a)在生物安全柜(bsc)内，已经被酶消化的来自活检的细胞悬液被引入到“预生长室”(细胞塔顶部上的小单元)中，预生长室已经填充以含有抗生素的初始生长培养基。从bsc,一次性物品将被转移到已经就位的永久性ace单元；b)在约3天后，预生长室内的细胞被胰蛋白酶消化，并被引入至细胞塔本身中，细胞塔预先填充以完全生长培养基。在此，由co2注射引起的“鼓泡作用”迫使培养基以细胞螺旋向下并且以均匀分布的方式沉降在培养皿的表面上的速率循环；c)持续约7天，使细胞繁殖。此时，将检查汇合情况(在撰写时未知的方法)以验证培养物正在生长。在此时，完全生长培养基还将用新鲜的完全生长培养基更换。cgm将每7天更换一次持续3-4周。在培养期结束时，再次检查汇合以确认生长充分足以能够产生所需量的细胞用于目标治疗；d)如果培养物充分汇合，则将其收获。消耗过的培养基(上清液)从容器中排出。然后将pbs泵送至容器(以从细胞清洗掉培养基、fbs)中并几乎立即排出。将胰蛋白酶-edta泵送到容器中以使细胞脱离生长表面。从旋转分离器，细胞将传送到内置自动化细胞计数装置或采集样品经由实验室分析用于细胞计数和活力测试。一旦细胞的具体数目进行了计数，并且达到了适宜的细胞浓度，则将收获的细胞传送到收集瓶，收集瓶可以被移除以将样品等分用于低温冷冻。
在另一个实施方案中，对于整个过程或一部分过程，可以使用自动化机器人系统来执行细胞加料、传代和收获。可以在消化后直接将细胞引入至机器人装置中并接种到t-175培养瓶(或替代品)中。该装置可以具有孵育细胞、执行细胞计数和活力分析以及执行加料和向较大培养容器转移的能力。该系统还可以具有计算机化编目功能以追踪单个批次。可以使用现有的技术或定制的系统用于机器人选择方案。
获得成纤维细胞的团体可以是或不是操作成纤维细胞以使它们增强和/或将它们递送到个体的团体。
iv.成纤维细胞及其操作的实施例
在获得并制备成纤维细胞后，在递送到需要成纤维细胞的个体之前，可以对成纤维细胞进行操作，包括增强可用于治疗目的的一种或多种活性。在一些实例中，成纤维细胞在递送到需要其的个体之前(和/或期间)暴露于一种或多种生物活性剂和/或条件，并且在一些实例中在递送之前(和/或期间)暴露于一种或多种生物活性剂和/或条件可以在培养步骤期间发生或不发生。
在一个实施方案中，成纤维细胞通过与包含生物活性剂的组合物或组合物的混合物接触预先被激活，所述生物活性剂是至少一种生长因子，并且所述生长因子可以选自由下列各项组成的组：转化生长因子(tgf)、成纤维细胞生长因子(fgf),血小板衍生生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子(igf)、血小板衍生内皮生长因子(pdegf)、血小板衍生血管生成因子(pdaf)、血小板因子4(pf-4)、肝细胞生长因子(hgf)及其组合。在某些实例中，生长因子是转化生长因子(tgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)及其组合。在具体实例中，生长因子选自由下列各项组成的组：转化生长因子β(tgf-β)、血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)及其组合。在本公开的另一实施方案中，与成纤维细胞的递送同时，或随后，将包含生长因子的组合物递送到个体。在某些实施方案中，递送可以通过注射进行。成纤维细胞可以关于接受的个体来说是自体的、同种异体的或异种的。在一些实施方案中，血小板血浆组合物与成纤维细胞一起施用或在成纤维细胞的施用后施用，并且所述血小板血浆组合物可以包含血小板和血浆，基本上由血小板和血浆组成或由血小板和血浆组成，并且可以来源于骨髓和/或外周血。本公开可以使用来自这些来源中的任一种或两者的血小板血浆组合物，并且任一种血小板血浆组合物可以根据需要用来再生髓核或纤维环或两者。此外，血小板血浆组合物可以与浓缩骨髓(bmac)一起使用或不与浓缩骨髓(bmac)一起使用。作为实例，当插入到纤维环中时，可以使用0.05-2.0cc血小板血浆组合物，并且当插入到髓核中时，可以使用0.05-3.0cc血小板血浆组合物。血小板是无核血细胞，如上所述，它们可以存在于骨髓和外周血中。
在本公开的各个实施方案中，血小板血浆组合物可以通过离心将血小板从全血和/或骨髓中分离而获得，例如分离成三层：(1)富血小板血浆；(2)贫血小板血浆；和(3)纤维蛋白原。当使用来自一层的血小板时，例如，来自血液的富血小板血浆(prp)，可以使用全血小板或可以提取它们的内容物，并可以例如使用凝血酶和/或氯化钙通过细胞膜裂解程序浓缩成血小板裂解液。当选择是否使用全血小板或血小板裂解物时，可以考虑期望再生和/或组织愈合(其可以包括在突出的或撕裂的椎间盘没有再生或愈合的情况下瘢痕组织的形成)的速率。在一些实施方案中，裂解物将比prp(或来自骨髓的贫血小板血浆)作用更迅速。值得注意的是，来源于骨髓的贫血小板血浆的血小板浓度比来自血液的富血小板血浆高，也称作贫/富血小板血浆("pp/rp"或"ppp")。pp/rp或ppp可以用来指来源于骨髓的贫血小板血浆，并且在一些实施方案中，优选使用pp/rp或使用prp作为用于椎间盘再生的组合物的一部分。(按照惯例，缩写prp仅指来源于外周血的组合物,并且ppp(或pp/rp)是指来源于骨髓的组合物)。在各个实施方案中，血小板血浆组合物可以是裂解物的形式或可以不是裂解物的形式，其可以具有下列功能中的一种或多种：(1)释放/提供生长因子和/或细胞因子用于组织再生；(2)减轻炎症；(3)吸引/动员细胞信号传导；(4)通过成纤维细胞生长因子(fgf)启动受损纤维环的成纤维细胞修复；(5)稳定椎间盘纤维环；(6)修复纤维环椎间盘撕裂；(7)刺激椎间盘的血管再形成；和(8)刺激干细胞激活。在一些实施方案中，通过将血小板疗法与干细胞组合，就减少背痛而言可以存在协同作用。在任何情况下，个体可以曾经接受，正在接受，或将接受一种或多种任意类型的止痛药。
在其中使用裂解物的一些实施方案中，一种或多种细胞因子可以浓缩以便优化它们的功能能力。浓缩可以以两步实现。第一步，可以获得血液并将其浓缩至为浓缩前体积的5-15％的体积。可以使用的装置包括但不限于血液滤器或血液浓缩器。例如，60cc血液可以被浓缩至6cc。下一步，可以将浓缩的血液过滤以移除水。此过滤步骤可以将体积进一步减少至过滤前体积的33％-67％(例如，约50％)。因此，作为实例，对于6cc的浓缩产物，可以滤出水使得获得约3cc的产物。当从血液获得富血小板血浆、贫血小板血浆和纤维蛋白原时，它们可以例如通过抽取20-500cc外周血、40-250cc外周血或60-100cc外周血来获得。应当抽取的血液量将取决于已经退化的椎间盘的数目和椎间盘的尺寸。本领域普通技术人员要理解的是，典型的椎间盘的体积为2-5cc或3-4cc。在一个具体实施方案中，成纤维细胞与激活的prp一起处理或施用。可以根据美国专利号9,011,929使用生成激活的prp的方法，该专利的全部内容通过引用并入本文，且该专利基本上描述了：从全血中分离prp，其中所述分离步骤进一步包括下列的步骤：从动物或患者采集10ml全血至含有3.2％柠檬酸钠的真空测试管，并初步将采集的全血以1,750-1,900g离心3-5分钟；收集从所述离心获得的包含具有白膜层的血浆层的上清液；将收集到的上清液通过钝针头转移到新的真空测试管，第二次将收集到的上清液以4,500-5,000g离心4-6分钟；以及通过另一钝针头收集浓缩在底层的prp；通过三通连接器将由分离步骤收集的1mlprp与浓度为0.30-0.55mg/ml的氯化钙溶液混合；以及将prp与氯化钙溶液的混合物与i型胶原蛋白混合，其中将prp与氯化钙溶液的混合物与i型胶原蛋白混合的混合步骤进一步包括以下步骤：在混合前将i型胶原蛋白在室温下静置15-30分钟；以及通过另一个三通连接器将prp与氯化钙溶液的混合物与浓度为20-50mg/ml的i型胶原蛋白在不透明相中混合4次。在一些实施方案中，成纤维细胞的施用与生物相容性聚合物以及生长因子或prp或血小板凝胶一起进行。
在一个实施方案中，从经筛选的供体中使用如上所述的类似方法获得同种异体的成纤维细胞。在此实施方案中，经筛选的供体提供用于扩增成纤维细胞和生成主细胞库(mcb)的组织。在对mcb进行适宜的测试后，从主细胞库扩增的细胞用来建立工作细胞库(wcb),接着工作细胞库被扩增以制造用于配制同种异体局部用产品的条件培养基。重编程细胞拥有正常的核型，在体外分化成搏动的心肌细胞并且在体内分化成所有三个胚层的代表物。人真皮成纤维细胞的表达多能性标志物ssea3的亚群证明了ipsc生成效率增加，如bryne等人,plosone,4(9):e7118(2009)所述。ssea3-阳性的群和ssea3-阴性的群用相同的逆转录病毒载体在相同的实验条件下转导，并且接种到失活的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)上。在标准的hesc条件下培养3周后，由三个独立的hesc生物学家对ipsc集落形成进行双盲分析来检验培养板。挑取具有ipsc形态的集落并扩增。利用转导的ssea3-阴性细胞进行的所有三个生物学重复实验形成了许多大的背景集落(每个重复实验10-27个)，但没有出现ipsc集落；相反，利用转导的ssea3-阳性细胞进行的所有三个生物学重复实验均导致形成ipsc集落(每个重复实验4-5个)但大的背景集落非常少(每个重复实验0-1个)。对来源于ipsc-样集落的细胞系的进一步表征显示它们具有hesc-样形态，生长为具有大的核质比率、明确的边界和清晰的核仁的扁平集落。当进一步扩增和表征5个细胞系时，所有细胞系都证明有由hesc表达的关键性多能性标志物的表达，所述标志物包括碱性磷酸酶、nanog、ssea3、ssea4、tra160和tra181。ssea3-选择的ipsc还证明有正常的雄性核型(46,xy)、在体外分化成有功能的搏动的心肌细胞和在体内分化成所有三个胚层的代表物的能力。因为观察到从转导的ssea3-阴性细胞没有ipsc集落形成或谱系衍生，因此这证明相对于表达ssea3的细胞这些细胞具有显著较低的重编程的潜力或甚至没有重编程的潜力。另外，与对照衍生率相比，对强力表达ssea3的原代成纤维细胞的10倍富集产生了显著更高(增加8倍)的ipsc谱系衍生效率(p<0.05)。ssea3-阳性细胞看上去与ssea3-阴性成纤维细胞在形态学上难以区分；此外，ssea3抗原的表达不被认为是其他细胞类型诸如间充质干细胞或表皮成体干细胞的标志物。
在本公开的一个实施方案中，富血小板血浆用来激活表达ssea3的细胞的稀少亚群，所述亚群存在于成人皮肤的真皮中并且可以相应地进行分离。这些表达ssea3的细胞响应于损伤经历显著的细胞数目增加，表明其在再生中的作用。这些表达ssea3的再生相关(sera)细胞通过原代细胞培养得到，通过荧光激活细胞分选(facs)纯化并表征。sera细胞证明有最类似于骨髓和脂肪来源的间充质细胞(msc)的全局转录状态以及表达最高的共表达cd105的ssea3表达细胞。然而，这些细胞不能分化成脂肪细胞、成骨细胞或软骨细胞。
治疗患有下腰痛的个体可以通过本公开的一个实施方案来实现，诸如通过施用已经被遗传修饰以上调血管生成刺激物的表达或抗炎活性的成纤维细胞。本领域中已知基因可以通过众多方式被引入，包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、α-病毒、慢病毒、库京病毒，或hsv载体，脂质体、纳米粒子介导的以及电穿孔和睡美人转座子(sleepingbeautytransposon)。可以被转染的具有血管生成刺激功能的基因包括但不限于：vegf、fgf-1、fgf-2、fgf-4、egf、hgf及其组合。另外地，与血管生成级联的表达上调相关的转录因子也可以转染到用于治疗下腰痛的细胞中，包括：hif-1α、hif-2、net、nf-kb或其组合。可以使用抑制炎症的基因，诸如：例如，tgf-a、tgf-b、il-4、il-10、il-13、il-20、血小板反应蛋白或其组合。还可以利用转染用于以基本上阻断抑制血管生成的基因的转录或翻译的方式实施基因操作手段。反义寡核苷酸、核酶或小干扰rna可以被转染到用于治疗下腰痛的细胞中以便阻断抗血管生成蛋白的表达，所述抗血管生成蛋白诸如：例如，癌抑素、ip-10、kringle1-5、和胶原蛋白xviii/内皮抑素。另外，可以使用基因抑制技术来阻断用于治疗下腰痛的细胞表达炎性蛋白的能力，所述炎性蛋白包括：il-1、tnf-α、il-2、il-6、il-8、il-9、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、il-27、ifn-α、ifn-β和ifn-γ。使用不仅所述的基因手段而且使用诱骗寡核苷酸(decoyoligonucleotide)也可以基本上阻断与炎症相关的全局作用转录因子。用于阻断的合适的转录因子包括nf-kb复合物的各种亚基，诸如p55、和/或p60，stat家族成员，特别是stat1、stat5、stat4，以及干扰素调节因子家族成员诸如例如，irf-1、ifr-3和ifr-8。增强可用于治疗背痛的细胞的血管生成刺激能力可以通过在限氧的条件下培养来进行。本领域中已知，通常干细胞，以及特别是具有血管生成促进活性的干细胞往往驻留于骨髓的缺氧生态位。当干细胞分化成更成熟的后代时，它们进行性地迁移到骨髓的具有更高氧张力的区域[40]。在研究中使用组织培养中的这个重要变量，证明使用低至1.5％的氧张力在缺氧条件下获得了能够完全造血重建的人cd34干细胞的增强扩增。在缺氧条件下的强力扩增(与正常氧张力相比高5.8倍)归因于对hif-1依赖性生长因子的缺氧诱导，所述hif-1依赖性生长因子诸如vegf,其当在受控条件下释放时是强力的血管生成刺激物[41]。因此，对用于治疗背痛的细胞的培养可以在0.5％-4％,诸如1％-3％以及包括1.5％-1.9％的范围内的氧的条件下进行。缺氧培养不限于降低氧张力，还可以包括施用在组织培养过程期间抑制氧摄取或与氧摄取竞争的分子。另外，在本公开的实施方案中，通过诱导一种或多种导致hif-1转录因子上调的作用剂来诱导缺氧。
在其中成纤维细胞暴露于缺氧的实施方案中，在具体实施方案中，氧含量可以为0.1％-5％、0.1％-4％、0.1％-3％、0.1％-2％、0.1％-1％、0.1％-0.75％、0.1％-0.5％、0.1％-0.25％、0.2％-5％、0.2％-4％、0.2％-3％、0.2％-2％、0.2％-1％、0.2％-0.75％、0.2％-0.5％、0.5％-5％、0.5％-4％、0.5％-3％、0.5％-2％、0.5％-1％、0.5％-0.75％、0.75％-5％、0.75％-4％、0.75％-3％、0.75％-2％、0.75％-1％、1％-5％、1％-4％、1％-3％、1％-2％、2％-5％、2％-4％、2％-3％、3％-5％、3％-4％或4％-5％％氧。细胞暴露于缺氧条件的持续时间，包括具有(但不限于)这些代表性的氧含量，可以为30分钟(min)-3天、30分钟-2天、30分钟-1天、30分钟-12小时(hrs)、30分钟-8小时、30分钟-6小时、30分钟-4小时、30分钟-2小时、30分钟-1小时(hr)、1小时-3天、1小时-2天、1小时-1天、1-12小时、1-8小时、1-6小时、1-4小时、1-2小时、2小时-3天、2小时-2天、2小时-1天、2小时-12小时、2-10小时、2-8小时、2-6小时、2-4小时、2-3小时、6小时-3天、6小时-2天、6小时-1天、6-12小时、6-8小时、8小时-3天、8小时-2天、8小时-1天、8-16小时、8-12小时、8-10小时、12小时-3天、12小时-2天、12小时-1天、12-18小时、12-14小时、1-3天或1-2天的持续时间，这些持续时间仅作为实例。
在各种培养程序后，在具体实施方案中，在临床条件下使用之前，可以测试生成的细胞的血管生成活性和/或抗炎活性。测试可以通过本领域技术人员已知的各种手段来进行。就评估血管生成潜力而言，手段包括，但不限于：a)使用人脐静脉内皮细胞或其他内皮细胞群评估在体外支持内皮细胞增殖的能力(对增殖的评估可以使用氚化胸腺嘧啶核苷掺入或通过肉眼计数所述增殖的内皮细胞来进行。可以使用活力染料诸如mtt或其他市售的指示剂)；b)支持在皮下植入的基质中形成索状结构的能力(基质可以包括例如，基质胶或纤维蛋白凝胶，其负载以如上所述生成的细胞并被皮下植入到动物中。动物可以是免疫缺陷小鼠诸如scid或裸鼠以便消除免疫学差异。在植入后，对内皮索的形成可以通过肉眼或通过显微镜评估。为了区分刺激血管生成的细胞与对刺激血管生成的所述细胞响应的宿主细胞，可以使用种属特异性标志物)；c)在鸡胚尿囊膜测定中发生的加速血管生成的能力(细胞可以直接或经由基质植入到第9天胚胎上的鸡尿囊膜中，并培养约2天的时间。血管生成的可视化可以使用活体显微镜(invivomicroscopy)执行)；和/或d)在上述后肢缺血模型中刺激新血管生成的能力。
还可以进行对生成或分离用于潜在临床应用的成纤维细胞的抗炎能力的评估。大量方法是本领域中已知的，例如，它们可以包括评估推定的抗炎成纤维细胞从而在体外调整免疫参数。推定的抗炎成纤维细胞可以与免疫细胞以各种比率共培养。免疫细胞可以用激活性刺激物刺激。推定的抗炎细胞以剂量依赖方式抑制炎性细胞因子产生或增加抗炎细胞因子产生的能力可以用作评估抗炎活性的输出系统。其他的输出参数可以包括：增殖、细胞毒活性、炎性介质的产生或与激活相关的表面标志物的上调。被评估的细胞因子可以包括：il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、tnf、ifn和/或rankl。特异性免疫细胞可以新鲜分离或可以是永生化细胞系。免疫细胞可以是：t细胞、b细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、天然杀伤细胞、天然杀伤t细胞、γδ-t细胞或其组合。免疫刺激物可以包括抗体、配体、蛋白或其他细胞。实例包括：针对t细胞受体的交联抗体，针对共刺激分子诸如cd28的交联抗体，针对激活相关分子诸如cd69的交联抗体或针对刺激性细胞因子诸如il-2的受体的交联抗体。炎性刺激物的其他实例可以包括与同种异体刺激细胞共培养，诸如在混合淋巴细胞反应中，或可以包括用非特异性激活物诸如凝集素刺激。具体的凝集素可以包括刀豆素-a、植物凝集素或小麦胚芽凝集素。其他非特异性刺激物可以是toll样受体通路的激活物，诸如脂多糖、cpgdna基序或细菌膜级分。上面两个段落中所述的方法仅作为实例显示，这些实例可以在进入临床应用前用来确定如本发明所述生成的细胞群是否能够产生所需的血管生成刺激或抗炎效应。这些实例仅提供作为指南，本领域技术人员可以使用常规试验对其进行优化。
对于本文提供的本公开的任何实施方案，在一些情况下，用于治疗下腰痛的细胞可以被低温保存用于后续使用，以及用于运输。本领域技术人员知晓大量的细胞低温保存的方法。典型地，细胞可以经低温保护过程进行处理，然后被冷冻保存直至需要为止。一旦需要，细胞需要用于复苏的专业处理并洗涤以清除低温保存剂，所述低温保存剂可能对细胞功能有有害作用。一般来说，低温保存需要注意三个主要的方面，它们是：1)低温保护剂，2)控制冷冻速率，和3)将要保存细胞的温度。低温保护剂是本领域技术人员熟知的，并且可以包括但不限于，例如，二甲基亚砜(dmso)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、i-赤藓糖醇、d-核糖醇、d-甘露醇、d-山梨醇、i-肌醇、d-乳糖或如美国专利号6,461,645(其全部内容通过引用并入本文)中所述的氯化胆碱。一些技术人员采用的低温保存细胞的方法包括在允许dmso自由地渗透细胞并且保护细胞内细胞器的条件下处于不会对细胞产生瞬时细胞毒性的浓度的dmso；dmso与水混合，防止由冰晶形成所引起的细胞损伤。按体积以20-25％的浓度加入血浆可以增加dmso的保护效应。在加入dmso后，细胞应当保持在低于4℃的温度，从而防止dmso-介导的损害。实际上诱导细胞处于生命暂停状态的方法涉及利用各种各样的冷却规程。尽管细胞类型、冷冻试剂和细胞浓度在确定冷却方法中是重要的变量，但一般公认的是受控的、稳定的冷却速率是最适的。在本领域中已知有大量的装置和设备能够降低细胞的温度用于最适低温保存。一种这样的设备是由热电公司(thermoelectroncorporation)制造的thermoelectrocryomedfreezertm。细胞还可以冷冻在由百特(baxter)制造的cryocytetm容器中。低温保存的一个实例如下：使用isolexsystemtm根据生产厂商(百特)的说明书从脐带血分离2x106个cd34细胞/ml。细胞在含有10％dmso和20％血浆的dmem培养基中孵育。以1摄氏度/分钟从0摄氏度冷却至-80摄氏度。当细胞需要使用时，将它们在保持于37摄氏度的水浴中迅速解冻，并在解冻后立即冷却。迅速用缓冲液或含有生长因子的溶液洗涤细胞。如果需要，然后经纯化的细胞可以用于扩增。如果需要，还可以准备储存细胞的信息的数据库(诸如供体、细胞起源类型、细胞标志物等)。
在某些实施方案中，成纤维细胞可以从组织得到，所述组织包括，例如，皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺、脑、脂肪组织、包皮、胎盘和/或脐带。在具体实施方案中，成纤维细胞是胎盘的、胎儿的、新生儿的、成人的成纤维细胞或其组合。
向个体施用细胞的次数将至少部分地取决于本文所述的因素并且可以使用本领域中的常规方法来优化。在具体的实施方案中，需要单次施用。在其他实施方案中，需要多次施用细胞。应当理解的是该系统受制于许多变量，诸如个体的特定需求(其可以随着时间和环境而改变)，由于细胞或单个细胞活性的损失导致细胞活性的损失的速率，等等。因此，期望可以监测每个个体的适宜剂量，并且监测个体的这种实践在本领域中是常规的。
在一些实施方案中，使细胞接受一种或多种培养基组合物，所述组合物包含下列，由下列组成，或基本上由下列组成：洛斯维帕克纪念研究所(roswellparkmemorialinstitute)(rpmi-1640)、dublecco's改良必需培养基(dublecco'smodifiedessentialmedia)(dmem)、eagle's改良必需培养基(eagle'smodifiedessentialmedia)(emem)、optimem、iscove's培养基或其组合。
在特定情况中，成纤维细胞被重组操作以编码ssea3、vegf、fgf-1、fgf-2、fgf-4、egf、hgf、hif-1α、hif-2、net、nf-kb、tgf-a、tgf-b、il-4、il-10、il-13、il-20、血小板反应蛋白、癌抑素、ip-10、kringle1-5、xviii型胶原蛋白/内皮抑素、il-1、tnf-α、il-2、il-6、il-8、il-9、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、il-27、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、p55、p60、stat1、stat5、stat4、irf-1、ifr-3、ifr-8或其组合。在其中采用重组技术的情况下，操作一种或多种类型的成纤维细胞以装入一个或多个表达载体，每个表达载体编码一种或多种目的基因产物。重组表达载体可以作为一个或多个dna分子或构建体引入，其中可以存在至少一个标志物，所述标志物将允许选择含有所述载体的宿主细胞。所述载体可以以常规方式制备，其中基因和调控区可以被分离，视情况而定，连接，在适宜的克隆宿主中克隆，并通过测序或其他方便的手段分析。特别地，使用pcr，包含所有或部分的功能单元的单个片段可以被分离，其中在一些情况下，可以视情况而使用“引物修复”、连接、体外诱变等，引入一个或多个突变。一旦完成并被证明具有适宜的序列，然后可以通过任何方便的手段将载体引入到宿主细胞中。构建体可以被整合和包装到非复制性缺陷性病毒基因组如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)或包含逆转录病毒载体的其他病毒中用于感染或转导到细胞中。如果需要的话，所述载体可以包含用于转染的病毒序列。备选地，构建体可以通过融合、电穿孔、基因枪法、转染、脂染或类似方式引入。宿主细胞可以在引入载体之前在培养中生长和扩增，接着进行适当的处理用于载体的引入和载体的整合。然后扩增细胞，并借助于构建体中存在的标志物进行筛选。可以成功使用的各种标志物包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。
本文所述的任意基因或基因产物，或其活性部分，可以被克隆到包含一个或多个能够在细胞中表达的启动子序列的哺乳动物表达构建体中，所述启动子诸如cmv启动子[artuc等人,exp.dermatol.1995,4:317-21]。合适的构建体的实例包括，但不限于pcdna3、pcdna3.1(+/-)、pgl3、pzeosv2(+/-)、pdisplay、pef/myc/cyto、pcmv/myc/cyto，它们每一个都是市售的，或能够在人包皮细胞中调控多核苷酸表达的psh表达载体[ventura和villa,1993,biochem.biophys.commun.192:867-9]。逆转录病毒载体和包装系统的实例为由clontech(sandiego,calif.,usa)销售的那些，包括retro-x载体plncx和plxsn,其允许克隆至多克隆位点中，并且由cmv启动子转录转基因。还包括来源于mo-mulv的载体诸如pbabe，其中由5'ltr启动子转录转基因。在完成质粒转染后，通过允许从组织培养板脱离的手段收获成纤维细胞，例如，通过胰蛋白酶消化并转移到6孔板(nunc,denmark)或24孔板(nunc)中用于增殖。转染后约3天，将细胞培养基更换为允许修饰的成纤维细胞增殖和扩增的培养基。一个实例是neurobasala(nba)增殖培养基，其包含neurobasal-a(invitrogen)、1％d-葡萄糖(sigmaaldrich)、1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺(invitrogen)、2％含视黄酸的b27补充剂(invitrogen)、0.2％egf(peprotech,usa)、0.08％fgf-2(peprotech)、0.2％肝素(sigmaaldrich,usa)和浓度达1□m的丙戊酸(sigma-aldrich)。然后每周更换培养基三次，定期将细胞重新接种(例如，2-8次至多达最大每周一次重新接种，当集落开始形成时变得更规律一些)以去除非重编程细胞直至达到遍布的集落形成为止。
在一些情况下，一种或多种作用剂可以引入至细胞中作为用于瞬时表达的rna分子。rna可以通过各种手段递送至任意细胞，包括本公开的任意的修饰细胞，所述手段包括例如，微注射、电穿孔和脂质介导的转染。在特定的方面，将载体引入至细胞中可以经由转座子发生。应用的合成转座子的实例是包含表达盒的睡美人转座子，所述表达盒包含其血管生成剂基因。备选地，可以具有用于同源重组的靶位点，其中需要使用本领域中已知用于同源重组的材料和方法将载体整合在特定的位点处。对于同源重组，可以使用omega或o-载体。参见，例如，thomas和capecchi,1987；mansour等人,1988；和joyner等人,1989。
载体可以作为编码至少一种作用剂(包括一种或多种肿瘤抑制剂或其功能片段)的单一dna分子和任选的另一多核苷酸(诸如基因)，或具有一个或多个多核苷酸(诸如基因)的不同的dna分子引入。载体可以同时地或连续地引入，每个载体具有相同的或不同的标志物。在一个说明性实施例中，一个载体包含处于特定的调控序列的控制下的一种或多种作用剂(诸如一种或多种血管生成剂)。
包含有用元件诸如用于在原核细胞或真核细胞等中表达的细菌或酵母复制起始点、可选择和/或可扩增标志物、启动子/增强子元件(其可以用来制备载体dna的储备液并用于执行转染)的载体在本领域中是熟知的，并且许多是市售的。
在某些实施方案中，考虑rna或蛋白质序列可以与其他选择的rna或蛋白质序列在相同的宿主细胞中共表达。共表达可以通过用两个或更多个截然不同的重组载体共同转染宿主细胞来实现。备选地，可以构建单一重组载体以包含多个不同的rna编码区，然后其可以在用单一载体转染的宿主细胞中表达。
在一些情况下，杀死修饰细胞可能是合乎需要的，诸如当目的是终止治疗，细胞变成肿瘤细胞，其中在细胞存在后缺少所述细胞是目标的研究，和/或另一事件。为此目的，可以提供某些基因产物的表达，在此情况下可以在受控的条件下杀死修饰细胞，诸如自杀基因。自杀基因在本领域中是已知的，例如，icaspase9系统，其中修饰形式的caspase9可用小分子(例如，ap1903)二聚化。参见，例如，straathof等人,blood105:4247-4254(2005)。
实施例
给出下面的实施例以便更充分地说明本发明的优选实施方案。然而，它们不能被理解为限制本发明的广泛范围。
实施例1
用富血小板血浆培养增强成纤维细胞的免疫抑制性标志物pd-1l表达
成纤维细胞用富血小板血浆(prp)培养以产生用于治疗用途的增强的成纤维细胞。包皮成纤维细胞、人骨髓msc和人脂肪msc获自atcc并在含有10％胎牛血清的dmem培养基中以图1中所示的prp浓度培养，所述prp由健康供体产生。将细胞培养48小时。使用pd-抗pdl1-pe或同种型对照(bectondickenson,franklinlakes,nj)按照生产厂商的说明书进行染色。使用活/死的可固定近红外染料(invitrogen)来排除死细胞。将门控的活细胞的荧光量化为平均荧光强度(mfi)。如图1中所见，只在成纤维细胞中观察到pd-l1表达的增加。
实施例2
用富血小板血浆培养增强成纤维细胞抑制t细胞活化的能力
成纤维细胞用prp培养以产生用于治疗用途的增强的成纤维细胞。包皮成纤维细胞、人骨髓msc和人脂肪msc获自atcc并在含有10％胎牛血清的dmem培养基中以下述浓度的由健康供体生成的富血小板血浆(prp)培养。将细胞培养48小时。随后细胞接种以用0.5微克/毫升的植物凝集素刺激的同种异体外周血单核细胞。细胞共培养72小时，在培养的最后12小时加入1微居里氚化胸腺嘧啶核苷。通过闪烁计数评估增殖。如所观察到的那样，prp的加入唯一地增强了成纤维细胞的免疫抑制活性。
实施例3
用富血小板血浆培养增强成纤维细胞抑制t细胞产生γ干扰素的能力
成纤维细胞用富血小板血浆(prp)培养以产生用于治疗用途的增强的成纤维细胞。包皮成纤维细胞、人骨髓msc和人脂肪msc获自atcc并在含有10％胎牛血清的dmem培养基中以下述浓度的由健康供体生成的富血小板血浆(prp)培养。将细胞培养48小时。随后细胞接种以用0.5微克/毫升的植物凝集素刺激的同种异体外周血单核细胞。细胞共培养48小时，并通过elisa评估γ干扰素的产生。如所观察到的那样，唯独在经prp处理的成纤维细胞中观察到γ干扰素产生减少。
参考文献
在本说明书中提到的所有专利和出版物指示本发明所属领域中的技术人员的水平。本文中的所有专利和出版物通过引入并入，其程度如同每一篇出版物被具体和单独地指明其全部内容通过引用并入一样。
专利
美国专利号5,165,928
美国专利号5,585,007
美国专利号5,599,558
美国专利号5,614,204
美国专利号6,010,627
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美国专利号6,303,112
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尽管本公开及其优点已经进行了详细描述，但应当理解的是在不偏离由附带的权利要求所限定的设计的精神和范围的前提下可以做出各种各样的改变、置换和改动。而且，本申请的范围不意在限于说明书中所述的过程、机器、制造、物质组合物、手段、方法和步骤的特定实施方案。如本领域普通技术人员很容易从本公开理解的那样，根据本公开可以利用与本文所述的相应实施方案基本上执行相同的功能或基本上实现相同的结果的过程、机器、制造、物质组合物、手段、方法或步骤，无论是目前已有的还是以后待开发的。因此，附带的权利要求意在包括在其范围内的此类方法、机器、制造、物质组合物、手段、方法或步骤。
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