色谱组合物的制作方法

本专利申请要求2017年3月16日提交的标题为“色谱组合物”的美国临时申请62/472,342以及2017年8月10日提交的标题为“色谱组合物”的美国临时申请62/543,654的权益和优先权，这些临时申请中的每一篇的内容全文以引用方式并入本文。本技术整体涉及色谱组合物。在各种实施方案中，本发明更具体地涉及固定相组合物，所述固定相组合物包含多孔或无孔芯材料的色谱表面，所述多孔或无孔芯材料包含用于色谱分离的表面改性剂。
背景技术：
：液相色谱(lc)与质谱(ms)相结合是用于表征蛋白质的最有力的分析工具之一。实际上，对于生物医药的分析，通常依赖反相液相色谱(rplc)与ms的偶联来测量完整的质量，分析产品相关的杂质，以及测定多种产品属性-全部在单次分析中。参见例如，analyticalchemistry2016，88(17)，8673-9。与基于蛋白质的治疗剂领域非常相似，蛋白质反相色谱法已逐渐发展成越来越高分辨率的技术。用于色谱颗粒的最常用基底为二氧化硅，因为它可被操作成能够满足现代液相色谱要求的结构上刚性的高纯度组合物。通常通过硅烷键合将二氧化硅颗粒转化成蛋白质rplc材料。在这些情况下，通过使伯甲硅烷基配体诸如c4-c8烷基硅烷反应，然后进行通常使用较小硅烷(例如，三甲基硅烷)的二次封端反应来制备二氧化硅固定相。用于形成蛋白质rplc固定相的这种合成方法体现在最近可商购获得的柱技术中。参见例如，由advancedmaterialstechnology，inc提供的proteinc4。尽管具有各种颗粒和键合相技术，但仍然存在分析挑战。例如，已经发现，当通过rplc分析时，最普遍的治疗性蛋白质形态单克隆抗体(mab)通常表现出独特且有问题的色谱行为。例如，来自rplc分离的mab的峰形状和回收率通常由于二次相互作用而变复杂。参见例如，journalofseparationscience2015，38(1)，1-8。因此，用于进行mab和其他蛋白质的蛋白质rplc分离的方法通常需要使用高温和强酸性离子配对剂。遗憾的是，使用强酸性离子配对剂如tfa抑制电喷雾离子化，从而导致ms检测受损。另一方面，酸性不太强的流动相添加剂有利于更高的灵敏度，但是在酸性不太强的条件下难以实现高质量的蛋白质分离。总之，现有技术蛋白质反相分离仍具有以下缺点：不同程度的峰拖尾、基线变形、不完全的蛋白质洗脱、差回收率、高温度依赖性、低分辨率、不足的峰容量、不足的ms兼容性和/或不期望差的低ph稳定性。因此，尚未满足对解决这些类型缺陷的固定相的需求。技术实现要素：本文提供了固定相组合物，该组合物包含多孔或无孔芯材料的色谱表面，该多孔或无孔芯材料包含具有式i、ii、iii或iv的表面改性剂：或它们的组合，其中a、b、x、y、r1、r2、r3、r5和r6中的每一者如本文所定义。这些组合物表现出优于早期化学物质的优点，并且向上述许多尚未满足的需求提供解决方案。例如，在一个方面，所公开的固定相组合物在峰容量方面具有显著改善。参见例如图5a和图6b，其中本发明组合物的有效峰容量分别比在常见酸性离子配对剂三氟乙酸(tfa)和甲酸下可商购获得的对应物质高至少15％和17％。在另一方面，所公开的固定相组合物解决了涉及不完全峰洗脱和差基线质量的问题。例如，具有所公开固定相的fc/2nistmab亚单元的峰面积明显高于可商购获得的基于非苯基的对应物质。参见例如图7。继而，所得的色谱图更清洁并且更易于解释。使用本发明所公开的固定相组合物也可观察到优异的批次间重现性。参见例如图8a。在又一个方面，本发明所公开的固定相组合物在低ph(例如1至3)和高温诸如60℃或更高(例如80℃或更高)下是稳定的。参见例如图9和图10。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物在40℃至60℃诸如50℃的温度下是稳定的。参见例如图10。在这些较低温度下进行具有高回收率的蛋白质反相分离的能力提供了经由水解或其他机械途径最小化蛋白质分析物的降解的手段。本文还描述了本发明所公开的固定相组合物用于分离样品(例如蛋白质)的用途。本文还描述了一种新型多步基于苯基的硅烷化方法，以形成本发明所公开的具有改善性能的固定相组合物。本技术涉及固定相组合物，该固定相组合物包含多孔或无孔芯材料的色谱表面，该多孔或无孔芯材料包含具有式i、ii、iii或iv的表面改性剂：或它们的组合。在式i、ii、iii或iv中，x和y各自独立地为0至10的整数；a为0至5；b为0至5；r1和r2各自独立地选自(c1-c3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-c(o)nh2和羧基；r3和r4各自独立地为任选地被1至5个选自(c1-c3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-c(o)nh2和羧基的基团取代的芳基，或者r3和r4各自独立地为任选地被氰基取代的(c1-c4)烷基；r5和r6各自独立地选自氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、正丁基二甲基甲硅烷基、并且r7为氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或正丁基二甲基甲硅烷基。切割键指定表面改性剂所连接的点。该组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.3μmol/m2。上述方面、固定相组合物和方法可包括以下特征中的一者或多者。在一些实施方案中，式ii的表面改性剂具有下式：在一些实施方案中，式ii的表面改性剂具有下式：在一些实施方案中，式ii的表面改性剂具有下式：其中r5选自三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和正丁基二甲基甲硅烷基。在一些实施方案中，r5为三甲基甲硅烷基。在一些实施方案中，式ii的表面改性剂具有下式：其中r5选自在一些实施方案中，式i的表面改性剂具有下式：其中r5选自氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和正丁基二甲基甲硅烷基；并且r6选自在一些实施方案中，式i的表面改性剂具有下式：其中r5选自氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和正丁基二甲基甲硅烷基；并且r6选自在一些实施方案中，式i的表面改性剂具有下式：其中r5和r6各自独立地选自氢、多孔或无孔芯材料的表面还可包含具有式v的表面改性剂：其中r8选自三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和正丁基二甲基甲硅烷基。在一些实施方案中，r8为三甲基甲硅烷基。在一些实施方案中，每个b为0至3。每个b可为0。在一些实施方案中，每个a为0至3。每个a可为0。在一些实施方案中，其中每个x为0至4。每个x可为0。在一些实施方案中，每个y为0至4。每个y可为0。在一些实施方案中，每个r3和r4各自独立地为任选地被氰基取代的芳基或(c1-c4)烷基。每个r3可为苯基或萘基。在一些实施方案中，每个r3为苯基或萘基并且每个r4为(c1-c4)烷基。每个r3可为苯基并且每个r4为(c1-c4)烷基。在一些实施方案中，每个r7为氢或三甲基甲硅烷基。在一些实施方案中，该组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.4μmol/m2。该组合物的总苯基表面覆盖率可大于或等于5.5μmol/m2。在一些实施方案中，该组合物为多个平均粒度为约0.5μm至约20μm的颗粒的形式。材料可为整料形式。在一些实施方案中，该组合物在1至5的ph下是稳定的。该组合物在1至3的ph下可以是稳定的。在一些实施方案中，该组合物在10至14的ph下是稳定的。该组合物在高达并包括100℃的温度下可以是稳定的。在一些实施方案中，该组合物在高达并包括80℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中，该组合物为颗粒的形式。该组合物的表面积可为约0.1m2/g至约1100m2/g。在一些实施方案中，该组合物的表面积为约0.5m2/g至约500m2/g。该组合物的表面积可为约0.7m2/g至约330m2/g。该组合物的表面积可为约5m2/g至约1100m2/g。在一些实施方案中，该组合物的表面积为约10m2/g至约500m2/g。该组合物的表面积可为约15m2/g至约330m2/g。在一些实施方案中，该组合物的孔体积为约0.001cm3/g至约1.7cm3/g。该组合物的孔体积可为约0.1cm3/g至约1.7cm3/g。在一些实施方案中，该组合物的孔体积为约0.01cm3/g至约1.3cm3/g。该组合物的孔体积可为约0.15cm3/g至约1.3cm3/g。在一些实施方案中，该组合物的微孔表面积可为小于约110m2/g。该组合物的微孔表面积可为小于约105m2/g。在一些实施方案中，该组合物的微孔表面积为小于约80m2/g。该组合物的微孔表面积可为小于约50m2/g。在一些实施方案中，该组合物的平均孔径为约至约该组合物的平均孔径可为约至约在一些实施方案中，该组合物的平均孔径为约至约该组合物的平均孔径可为约至约在一些实施方案中，该组合物的平均孔径为约至约该组合物的平均孔径可为约至约在一些实施方案中，该组合物为包含色谱芯的颗粒，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.05至约0.99。该组合物可为包含色谱芯的颗粒，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.2至约0.9。在一些实施方案中，该组合物为无孔颗粒的形式。色谱柱可包含上述实施方案中任一项所述的固定相组合物。色谱柱的内径可在75微米至50mm尺寸的范围内。色谱柱长度可为20mm至300mm。本发明公开了一种用于分离一种或多种蛋白质的反相液相色谱法。该方法包括将包含一种或多种蛋白质的样品施加到上述实施方案中任一项所述的固定相组合物中。该方法还包括使用流动相将样品洗脱通过固定相组合物，并且分离所述一种或多种蛋白质。该方法可包括以下特征中的一者或多者。在一些实施方案中，流动相选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、四氢呋喃和水，或它们的组合。流动相可选自乙腈、异丙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇和水，或它们的组合。在一些实施方案中，流动相为乙腈和水的组合。流动相还可包括ph调节剂。在一些实施方案中，流动相还包含ph调节剂，ph调节剂选自三氟乙酸、甲酸、磷酸、磺酸、盐酸、高氯酸和氯乙酸。流动相还可包括三氟乙酸。在一些实施方案中，流动相的ph小于3.5。流动相的ph可小于3.0。在一些实施方案中，样品在大于或等于40℃的温度下洗脱。样品可在大于或等于60℃的温度下洗脱。在一些实施方案中，该方法包括进行紫外或荧光检测的步骤。该方法还可包括在洗脱所述样品之后进行质谱分析的步骤。在一些实施方案中，该方法包括在洗脱所述样品后进行电喷雾质谱分析的步骤。在一些实施方案中，蛋白质为单克隆抗体或其片段。本发明公开了一种用于制备包含多孔或无孔芯材料的色谱表面的固定相组合物的方法。该方法包括使二氧化硅或有机二氧化硅颗粒与三官能化苯基硅烷反应以形成第一表面改性。该方法还包括使二氧化硅或有机二氧化硅颗粒再次与单官能化苯基硅烷反应以形成第二表面改性，其中组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.3μmol/m2。该方法可包括以下特征中的一者或多者。在一些实施方案中，该方法还包括封端步骤。在一些实施方案中，该方法产生包含式i、ii、iii或iv的表面改性：或它们的组合，其中x和y各自独立地为0至10的整数；a为0至5；b为0至5；r1和r2各自独立地选自(c1-c3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-c(o)nh2和羧基；r3和r4各自独立地为任选地被1至5个选自(c1-c3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-c(o)nh2和羧基的基团取代的芳基，或者r3和r4各自独立地为任选地被氰基取代的(c1-c4)烷基；r5和r6各自独立地选自氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、正丁基二甲基甲硅烷基，并且r7为氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或正丁基二甲基甲硅烷基。切割键指定表面改性剂所连接的点，其中组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.3μmol/m2。在一些实施方案中，该组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.4μmol/m2。该组合物的总苯基表面覆盖率可大于或等于5.5μmol/m2。在一些实施方案中，在与三官能化苯基硅烷反应之前，将二氧化硅或有机二氧化硅颗粒再羟基化。附图说明图1为用于形成本发明所公开的固定相组合物的示例性方法的示意图。图2为用于形成本发明所公开的具有特定苯基甲硅烷基醚表示的固定相组合物的示例性方法的示意图。图3a-3f示出了填充在色谱柱中的本发明所公开的固定相与比较组合物用于使用0.1％(v/v)甲酸流动相和2.1mm×50mm柱的单克隆抗体(mab)样品的反相分离的用途之间的比较。图4a-4f示出了填充在色谱柱中的本发明所公开的固定相与比较组合物用于使用0.1％(v/v)三氟乙酸流动相和2.1mm×50mm柱的单克隆抗体(mab)样品的反相分离的用途之间的比较。图5a和图5b各自示出当使用用0.1％(v/v)甲酸改性的流动相时，用所例示固定相组合物和比较组合物获得的平均峰容量值，其中图5a为平均梯度时间峰容量值，并且图5b为如使用mab样品测试混合物的第一种洗脱蛋白质分析物和最后一种洗脱蛋白质分析物之间的保留时间差量计算得出的平均有效峰容量值。图6a和图6b示出当使用用0.1％(v/v)三氟乙酸改性的流动相时，用所例示固定相组合物和比较组合物获得的平均峰容量值，其中图6a为平均梯度时间峰容量值，并且图6b为如使用mab样品测试混合物的第一种洗脱蛋白质分析物和最后一种洗脱蛋白质分析物之间的保留时间差量计算得出的平均有效峰容量值。图7示出当使用用0.1％(v/v)甲酸改性的流动相时，用所例示固定相组合物和比较固定相组合物获得的fc/2nistmab亚单元的峰面积。重复测试固定相性能(n＝2根柱)。图8a-8f示出所例示固定相组合物的批次间重现性，其中图8a和图8b示出如使用0.1％(v/v)甲酸获得的mab样品的反相分离，并且图8c和图8d示出如使用0.1％(v/v)tfa流动相和填充有各种固定相的2.1mm×50mm柱获得的mab样品的反相分离；图8e和图8f示出使用mab样品测试混合物的第一种洗脱蛋白质分析物和最后一种洗脱蛋白质分析物之间的保留时间差量计算的平均有效峰容量值。图9示出所例示固定相组合物的ph稳定性。图10a-10c示出完整单克隆抗体的峰面积作为如用各种流动相系统和所例示固定相组合物获得的柱温度的函数。也提供了如用各种比较固定相组合物获得的比较数据。图11a-11c示出使用用15mm三乙醇胺和400mm六氟异丙醇改性的水/甲醇流动相体系的15-mer、20-mer、25-mer、30-mer和35-mer长度脱氧胸苷(各20pmol)样品的反相分离。以0.2ml/min流速、60℃温度、2.1mm×100mm柱和24min从19％至25％甲醇的梯度进行分离。提供如从用三种不同固定相(包括本发明的组合物)获得的色谱图测量的有效峰容量。图12a为由本发明组合物的碱式消解得到的反应产物(图12b)的电喷雾负离子模式质谱图。具体实施方式1.组合物的一般描述本文提供了固定相组合物，该组合物包含多孔或无孔芯材料的色谱表面，该多孔或无孔芯材料包含表面改性剂。在一个方面，这些固定相组合物包含多孔或无孔芯材料的色谱表面，该多孔或无孔芯材料包含具有式i、ii、iii或iv的表面改性剂：或它们的组合，其中：x和y各自独立地为0至10的整数；a为0至5；b为0至5；r1和r2各自独立地选自(c1-c3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-c(o)nh2和羧基；r3和r4各自独立地为任选地被1至5个选自(c1-c3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-c(o)nh2和羧基的基团取代的芳基，或者r3和r4各自独立地为任选地被氰基取代的(c1-c4)烷基；r5和r6各自独立地选自氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、正丁基二甲基甲硅烷基、r7为氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或正丁基二甲基甲硅烷基；并且切割键指定表面改性剂所连接的点。2.定义术语“烷基”意指具有1-6个碳原子(除非另外指明)的饱和单价直链或支链烃基，并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。“单价”意指在一个点连接到分子的其余部分。术语“芳基”是指具有总共6至15元环的单环、双环和三环芳族碳环体系。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。芳环包括例如苯基、联苯基、萘基、蒽基等。如本文所用，术语“芳基”的范围内还包括其中芳环稠合至一个或多个非芳环的基团。此类基团包括例如茚满基、苯邻二酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基、菲啶基或四氢萘基等。如在“总苯基表面覆盖率”中所用的术语“苯基表面覆盖率”是指材料诸如本发明所公开的表面改性剂所连接的固定相每单位表面积的苯基基团的量。该量可以以微摩尔/米2为单位记录，并且可通过测定材料的碳组成百分比(按重量计)和比表面积(m2/g)来计算。参见例如j.liq.chromatogr.，1，(1978)561-586和j.chromatogr.a，852，(1999)，375-381。术语“孔体积”是指存在于颗粒床内的空白空间(例如，空气体积)的总体积。微孔表面积(msa)是指直径小于或等于的孔中的表面积，通过使用barrett-joyner-halenda(bjh)分析方法从等温线的吸附段(adsorptionleg)的多点氮吸附分析确定。参见例如j.amer.chem.soc.61(1951)373。表面积是指每单位质量的总表面积。术语“色谱芯”是指被色谱表面包住的材料。色谱表面材料可以以可辨别离散或明显转变的方式沉积在色谱芯上或者结合或退火到色谱芯，或者可以以与色谱芯的表面共混产生材料梯度并且没有离散的内部芯表面的方式结合到色谱芯。在某些实施方案中，色谱表面材料可与色谱芯的材料相同或不同，并且可表现出与色谱芯不同的物理或物理化学性质，包括但不限于孔体积、表面积、平均孔径、碳含量或水解ph稳定性。术语“色谱表面”意指提供样品分离的表面。在某些方面，色谱表面是多孔的。在一些方面，色谱表面可以是颗粒、表面多孔材料或整料的表面。在某些方面，色谱表面由在色谱分离过程中组合使用的一种或多种颗粒、表面多孔材料或整料的表面构成。在某些其他方面，色谱表面是无孔的。蛋白质是指具有一条或多条氨基酸残基长链的大生物分子或大分子。蛋白质包括但不限于纤维蛋白质、球状蛋白质、膜蛋白质、免疫球蛋白、治疗性fc结构域融合蛋白质、糖蛋白、结合蛋白质、聚乙二醇化蛋白质和抗体药物偶联物。蛋白质也可指较大蛋白质前体的片段。术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、能够结合抗原(包括fab′、f′(ab)2、fv、单链抗体、双体)的抗体片段，以及包含前述物质的重组肽，只要它们表现出期望的生物活性和抗原结合特异性。术语“整料”意指填充到床层中的单个颗粒的集合，其中保持单个颗粒的形状和形态。使用将颗粒结合在一起的材料来填充颗粒。可以使用本领域公知的结合材料，例如二乙烯基苯、甲基丙烯酸酯、氨基甲酸酯、烯烃、炔烃、胺、酰胺、异氰酸酯或环氧基团的线性或交联聚合物，以及有机烷氧基硅烷、四烷氧基硅烷、聚有机烷氧基硅氧烷、聚乙氧基硅氧烷和陶瓷前体的缩合反应物。在某些实施方案中，术语“整料”还包括通过其他方法制备的杂化整料，诸如美国专利7,250,214中详述的杂化整料；由含有0-99摩尔％二氧化硅(例如，sift)的一种或多种单体的缩合制备的杂化整料；由聚结的多孔无机/有机颗粒制备的杂化整料；具有色谱增强孔几何形状的杂化整料；不具有色谱增强孔几何形状的杂化整料；具有有序孔结构的杂化整料；具有非周期孔结构的杂化整料；具有非结晶或无定形分子排序的杂化整料；具有结晶域或区域的杂化整料；具有各种不同大孔和中孔特性的杂化整料；以及各种不同纵横比的杂化整料。在某些实施方案中，术语“整料”还包括无机整料，诸如在g.guiochon/j.chromatogr.a1168(2007)101-168中描述的那些。3.示例性组合物在第一实施方案中，本文提供了固定相组合物，该组合物包含多孔或无孔芯材料的色谱表面，该多孔或无孔芯材料包含具有式i、ii、iii或iv的表面改性剂：或它们的组合，其中变量如上文所定义。在第二实施方案中，式ii的表面改性剂具有下式：其中变量如上文所定义。在第三实施方案中，式ii的表面改性剂具有下式：其中变量如上文所定义。在第四实施方案中，式ii的表面改性剂具有下式：其中r5选自三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和正丁基二甲基甲硅烷基，并且其中其余的变量如第一实施方案中所述。在一个替代方案中，式ii的表面改性剂中的r5为三甲基甲硅烷基，其中其余的变量如第一实施方案中所述。在第五实施方案中，式ii的表面改性剂具有下式：其中，r5选自并且其中其余的变量如第一实施方案中所述。在第六实施方案中，式i的表面改性剂具有下式：其中r5选自氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和正丁基二甲基甲硅烷基；并且r6选自并且其中其余的变量如第一实施方案中所述。在第七实施方案中，式i的表面改性剂具有下式：其中r5选自氢、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和正丁基二甲基甲硅烷基；并且r6选自并且其中其余的变量和特征如第一、第二、第三、第四或第五实施方案中的任一项中所述。在第八实施方案中，式i的表面改性剂具有下式：其中r5和r6各自独立地选自氢、并且其中其余的变量和特征如第一、第二、第三、第四或第五实施方案中的任一项中所述。在第九实施方案中，本文所述的固定相组合物还包含具有式v的表面改性剂：其中，r8选自三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和正丁基二甲基甲硅烷基。在一个替代方案中，式v的表面改性剂中的r8为三甲基甲硅烷基。在第十实施方案中，本文所述的任何表面改性剂中的b为0至4，其中用于表面改性剂的其余变量在第一至第九实施方案中的任一项中有所描述。在一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的b为0至3，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第九实施方案中的任一项中所描述。在另一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的b为0至2，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第九实施方案中的任一项中所描述。在又一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的b为0或1，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第九实施方案中的任一项中所描述。在又一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的b为0，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第九实施方案中的任一项中所描述。在第十一实施方案中，本文所述的任何表面改性剂中的a为0至4，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十实施方案中的任一项中所描述。在一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的a为0至3，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十实施方案中的任一项中所描述。在另一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的a为0至2，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十实施方案中的任一项中所描述。在又一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的a为0或1，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十实施方案中的任一项中所描述。在又一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的a为0，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十实施方案中的任一项中所描述。在第十二实施方案中，本文所述的任何表面改性剂中的x为0至8，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十一实施方案中的任一项中所描述。在一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的x为0至6，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十一实施方案中的任一项中所描述。在另一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的x为0至4，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十一实施方案中的任一项中所描述。在又一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的x为0至2，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十一实施方案中的任一项中所描述。在又一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的x为0，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十一实施方案中的任一项中所描述。在第十三实施方案中，本文所述的任何表面改性剂中的y为0至8，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十二实施方案中的任一项中所描述。在一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的y为0至6，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十二实施方案中的任一项中所描述。在另一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的y为0至4，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十二实施方案中的任一项中所描述。在又一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的y为0至2，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十二实施方案中的任一项中所描述。在又一个替代方案中，本文所述的任何表面改性剂中的y为0，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十二实施方案中的任一项中所描述。在第十四实施方案中，本文所述的任何表面改性剂中的r3和r4独立地为任选地被氰基取代的芳基或(c1-c4)烷基，其中用于表面改性剂的其余变量如第一至第十三实施方案中的任一项中所描述。在一个替代方案中，任何表面改性剂中的r3为苯基或萘基，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十三实施方案中的任一项中所描述。在另一个替代方案，r3为苯基或萘基，并且每个r4为本文所述的任何表面改性剂中的(c1-c4)烷基，其中用于表面改性剂的其余变量如第一至第十三实施方案中的任一项中所描述。在第十五实施方案中，本文所述的任何表面改性剂中的r7为氢或三甲基甲硅烷基，其中用于表面改性剂的其余变量如在第一至第十四实施方案中的任一项中所描述。在第十六实施方案中，本文所述的固定相组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.3μmol/m2。作为另外一种选择，本文所述的固定相组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.4μmol/m2。在另一个替代方案中，本文所述的固定相组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.5μmol/m2。在又一个替代方案中，本文所述的固定相组合物的总苯基表面覆盖率大于或等于5.6μmol/m2，例如，大于或等于5.7μmol/m2，大于或等于5.8μmol/m2，大于或等于5.9μmol/m2，并且大于或等于6.0μmol/m2。在一个方面，本文所述的固定相组合物可为多个颗粒的形式。平均粒度可为例如约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm，或约2.0μm至约3.0μm。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式。在另一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式，并且为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式。在一个方面，本文所述的固定相组合物在各种ph范围下是稳定的。例如，本发明所公开的固定相组合物在1至5的ph下是稳定的。作为另外一种选择，本发明所公开的固定相组合物在1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph和小于3的ph下是稳定的。在又一个替代方案中，本发明所公开的固定相组合物在10至14的ph下是稳定的。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；并且/或者在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的。在一个方面，本发明所公开的固定相在高温下是稳定的。例如，本发明所公开的固定相在高达并包括100℃，高达并包括90℃，高达并包括80℃，以及高达并包括70℃的温度下是稳定的。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；并且/或者在高达并包括100℃，高达并包括90℃，高达并包括80℃，以及高达并包括70℃的温度下是稳定的。在一个方面，本发明所公开的固定相在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；并且/或者在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物的表面积为约0.1m2/g至约1100m2/g，诸如约0.5m2/g至约500m2/g以及约0.7m2/g至约330m2/g。在一个替代方案中，本发明所公开的固定相组合物的表面积为约5m2/g至约1100m2/g。在一个替代方案中，表面积为约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在高达并包括100℃，高达并包括90℃，高达并包括80℃，以及高达并包括70℃的温度下是稳定的；并且/或者具有约0.1m2/g至约1100m2/g，约0.5m2/g至约500m2/g，或者约0.7m2/g至约330m2/g的表面积。在另一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在高达并包括100℃，高达并包括90℃，高达并包括80℃，以及高达并包括70℃的温度下是稳定的；并且/或者具有约5m2/g至约1100m2/g，约10m2/g至约500m2/g，或者约15m2/g至约330m2/g的表面积。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物的表面积为约0.1m2/g至约1100m2/g，诸如约0.5m2/g至约500m2/g以及约0.7m2/g至约330m2/g。在一个替代方案中，本发明所公开的固定相组合物的表面积为约5m2/g至约1100m2/g。在一个替代方案中，表面积为约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的；并且/或者具有约0.1m2/g至约1100m2/g，约0.5m2/g至约500m2/g，或者约0.7m2/g至约330m2/g的表面积。在另一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的；并且/或者具有约5m2/g至约1100m2/g，约10m2/g至约500m2/g，或者约15m2/g至约330m2/g的表面积。在一个方面，本文所述的固定相组合物的孔体积为约0.001cm3/g至约1.7cm3/g。在一个替代方案中，孔体积为约0.1cm3/g至约1.7cm3/g，约0.1cm3/g至约1.3cm3/g，或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；以及/或者约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积。在一个方面，本文所述的固定相组合物具有小于约110m2/g的微孔表面积。在一个替代方案中，微孔表面积小于约105m2/g，例如小于约80m2/g或小于约50m2/g。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在高达并包括100℃，高达并包括90℃，高达并包括80℃，以及高达并包括70℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；具有约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积；以及/或者小于约110m2/g，例如，小于约105m2/g，小于约80m2/g，或小于约50m2/g的微孔表面积。在一个方面，本文所述的固定相组合物具有小于约110m2/g的微孔表面积。在一个替代方案中，微孔表面积小于约105m2/g，例如小于约80m2/g或小于约50m2/g。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；具有约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积；以及/或者小于约110m2/g，例如，小于约105m2/g，小于约80m2/g，或小于约50m2/g的微孔表面积。在一个方面，本文所述的固定相组合物具有约至约的平均孔径。在一个方面，平均孔径为约至约例如，约至约约至约约至约或约至约在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在高达并包括100℃，高达并包括90℃，高达并包括80℃，以及高达并包括70℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；具有约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积；小于约110m2/g，小于约105m2/g，小于约80m2/g，或小于约50m2/g的微孔表面积。以及/或者约至约例如，约至约例如约至约约至约约至约或约至约的平均孔径。在一个方面，本文所述的固定相组合物具有约至约的平均孔径。在一个方面，平均孔径为约至约例如，约至约约至约约至约或约至约在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；具有约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积；小于约110m2/g，小于约105m2/g，小于约80m2/g，或小于约50m2/g的微孔表面积。以及/或者约至约例如约至约例如约至约约至约约至约或约至约的平均孔径。在一个方面，本文所述的固定相组合物包含色谱芯，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.05至约0.99。在一个替代方案中，本文所述的固定相组合物包含色谱芯，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.2至约0.9。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在高达并包括100℃，高达并包括90℃，高达并包括80℃，以及高达并包括70℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；具有约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积；小于约110m2/g，例如，小于105m2/g，小于80m2/g，或小于50m2/g的微孔表面积；约至约例如约至约例如约至约约至约约至约或约至约的平均孔径；并且/或者包含色谱芯，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.05至约0.99或约0.2至约0.9。在一个方面，本文所述的固定相组合物包含色谱芯，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.05至约0.99。在一个替代方案中，本文所述的固定相组合物包含色谱芯，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.2至约0.9。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为整料的形式；为具有约0.5μm至约20μm、约1μμm至约10μm、约1.5μμm至约5μμm或约2.0μμm至约3.0μm平均粒度的多个颗粒的形式；在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；具有约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积；小于约110m2/g，例如，小于105m2/g，小于80m2/g，或小于50m2/g的微孔表面积；约至约例如约至约例如约至约约至约约至约或约至约的平均孔径；并且/或者包含色谱芯，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.05至约0.99或约0.2至约0.9。在一个方面，本文所述的固定相组合物包含无孔颗粒。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为多个无孔颗粒的形式，这些颗粒的平均粒度为约0.5μμm至约20μm、约1μm至约10μμm、约1.5μμm至约5μμm或约2.0μμm至约3.0μμm。在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在高达并包括100℃，高达并包括90℃，高达并包括80℃，以及高达并包括70℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；具有约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积；小于约110m2/g，例如，小于105m2/g，小于80m2/g，或小于50m2/g的微孔表面积；约至约例如约至约例如约至约约至约约至约或约至约的平均孔径；并且/或者包含色谱芯，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.05至约0.99或约0.2至约0.9。在一个方面，本文所述的固定相组合物包含无孔颗粒。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为多个无孔颗粒的形式，这些颗粒的平均粒度为约0.5μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1.5μm至约5μm或约2.0μm至约3.0μm。在1至5的ph、1至4的ph、1至3的ph、小于4的ph、小于4的ph或小于3的ph下是稳定的；在40℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或50℃至55℃范围内，以及在45℃、50℃、55℃和60℃的温度下是稳定的；具有约0.1m2/g至约1100m2/g、约0.5m2/g至约500m2/g、约0.7m2/g至约330m2/g、约5m2/g至约1100m2/g、约10m2/g至约500m2/g或约15m2/g至约330m2/g的表面积；具有约0.001cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.7cm3/g、约0.1cm3/g至约1.3cm3/g或约0.15cm3/g至约1.3cm3/g的孔体积；小于约110m2/g，例如，小于105m2/g，小于80m2/g，或小于50m2/g的微孔表面积；约至约例如约至约例如约至约约至约约至约或约至约的平均孔径；并且/或者包含色谱芯，并且芯直径与颗粒直径的比率为约0.05至约0.99或约0.2至约0.9。3.示例性用途本文所述的本发明所公开的固定相组合物可用于分离一种或多种物质。因此，本公开包括各种分离设备(例如，色谱柱、毛细管和微流体装置以及用于其的系统)，包括本文所述的色谱材料。虽然下文论述了若干例示性实施例，但普通技术的实践者将会理解，本公开可设想多个不同的实施方案，包括但不限于色谱柱、设备、使用方法或试剂盒。在一个方面，采用本发明所公开组合物的柱或设备可用于高效液相色谱(hplc)、溶剂化气相色谱、超临界流体色谱、亚临界流体色谱、基于二氧化碳的色谱、亲水作用液相色谱或疏水作用液相色谱，或它们的组合。柱或设备包括外壳(该外壳具有限定具有入口和出口的室的至少一个壁)以及本文所述的固定相组合物。装置可具有预成形熔块、由互连材料形成的熔块，或不具有熔块的装置。外壳和固定相可适于高效液相色谱、溶剂化气相色谱、超临界流体色谱、亚临界流体色谱、基于二氧化碳的色谱、亲水作用液相色谱或疏水作用液相色谱，或它们的组合。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物为填充柱的形式。在一个方面，本发明所公开的固定相组合物用于反相色谱柱，诸如反相hplc柱。在一个方面，柱的内径在约75微米至约50mm尺寸的范围内。在一个方面，柱长度为约20mm至约300mm。使用本发明所公开的固定相组合物分离的样品可以是与色谱方法相容的样品。相容的样品包括但不限于小有机分子、蛋白质(例如抗体，诸如单克隆抗体或其片段)、核酸、脂质、脂肪酸、碳水化合物、聚合物等。类似地，本发明可用于分离小分子、抗体、聚合物和低聚物、糖、石油化工产品、脂质、烃、食品、鉴证材料、杀虫剂、农用化学品和生物仿制剂。在一个方面，用于分离的样品为蛋白质或蛋白质片段，诸如单克隆抗体或其片段。因此，在一个方面，本文提供了一种用于分离一种或多种蛋白质的反相液相色谱法，该方法包括将包含一种或多种蛋白质的样品施加到本发明所公开的固定相组合物中；使用流动相将所述样品洗脱通过固定相组合物；以及分离所述一种或多种蛋白质。流动相可选自本领域已知的那些，包括但不限于乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、四氢呋喃和水，或它们的组合。在一个方面，本发明所公开的分离中所用的流动相选自乙腈、异丙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇和水，或它们的组合。在另一方面，流动相为乙腈和水的组合。流动相还可包含ph调节剂。例如，流动相包含ph调节剂，ph调节剂选自三氟乙酸、甲酸、磷酸、磺酸、盐酸、高氯酸和氯乙酸。在一个方面，流动相还包含三氟乙酸。作为另外一种选择，流动相的ph可小于5，例如小于4.5，小于4.0，小于3.5或小于3.0。分离可在高温下进行。例如，样品(诸如蛋白质)可在大于或等于40℃的温度下洗脱。作为另外一种选择，样品(诸如蛋白质)在大于或等于60℃，例如大于或等于80℃的温度下洗脱。分离也可在40℃至60℃范围内的温度下(例如在蛋白质上)进行。在一个方面，本文所述的使用本发明所公开固定相组合物的分离方法还包括进行紫外或荧光检测的步骤。在另一个方面，本文所述的使用本发明所公开固定相组合物的分离方法还包括在洗脱所述样品之后进行质谱分析的步骤。在又一个方面，本文所述的使用本发明所公开固定相组合物的分离方法还包括在洗脱所述样品之后进行电喷雾质谱分析的步骤。4.制造方法已发现，多步基于苯基的硅烷化方法改善了用于分离诸如蛋白质rplc分离的二氧化硅颗粒的性能。通过这一发现以及通过该方法所得固定相组合物的施加，已有可能实现以前难以实现的改善的组合，即实现增强的峰容量、改善的蛋白质洗脱完整性、降低的峰拖尾和更清洁的基线以及如本文所述显著的低ph稳定性。图1为用于形成本文所述组合物的示例性方法的示意图。在第一步骤中，用三官能化芳基硅烷来改性二氧化硅或有机二氧化硅基底(步骤1)。在图1中，以举例的方式，r1表示任选被取代的芳基或任选被取代的烷芳基。该三官能化硅烷具有以二齿方式键合到表面，从而原位产生另外的游离硅醇基团的倾向。在该键合方法的第二步骤(步骤2)中，使用含单官能化芳基的硅烷来键合原位新形成的硅醇和可能留在基础颗粒上的任何其他硅醇。在图1中，以举例的方式，r2、r3和r4可各自独立地表示任选被取代的芳基或任选被取代的烷芳基。或者r2、r3和r4中的一者或两者可为任选被取代的烷基。最后，步骤2产物可任选地经受封端，诸如用烷基硅烷封端(三甲基或三乙基甲硅烷基封端)。在一个方面，芳基基团为任选被取代的苯基或任选被取代的烷基苯基。本文所述的多步硅烷键合方法可用于产生用于色谱分离诸如蛋白质反相色谱的许多独特的键合相。在一个方面，用具有反应性基团的三官能化芳基(例如苯基)硅烷进行步骤1反应，反应性基团包括但不限于二甲基氨基、氯、硅氮烷或甲氧基。步骤1反应可用在硅与芳基之间具有连接基的三官能化芳基(例如苯基)硅烷进行。最后，步骤1反应可用取代的芳基(例如苯基)进行。步骤2反应不同于步骤1，不同之处在于它通常用基于单官能化芳基(例如苯基)的硅烷进行。该反应也可用多种不同的反应性基团进行，这些基团包括但不限于二甲基氨基、氯、硅氮烷或甲氧基。步骤2反应可用由不同苯基内容物组成的单官能化硅烷进行，苯基内容物包括但不限于二苯基甲基、二苯基乙基、二苯基正丙基、二苯基正丁基、二苯基异丙基、二苯基叔丁基、二苯基氰基丙基、苯基二甲基、苯基二乙基、苯基二正丙基、苯基二正丁基、苯基二异丙基、苯基二叔丁基、苯基二氰基丙基、三苯基等。在任选的封端步骤中，可使用不同的硅烷试剂和反应性基团。这些基团包括但不限于二甲基氨基、氯、硅氮烷和甲氧基。封端的硅烷可引入任何范围的取代基。示例性封端取代基包括但不限于三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、正丁基二甲基甲硅烷基、氰基丙基二甲基甲硅烷基和氰基丙基二异丙基甲硅烷基。图2为本文所述的示例性方法的示意图，其中第一步骤包括与三官能化芳基(例如苯基)硅烷诸如三(二甲基氨基)苯基硅烷的反应，之后进行与单官能化芳基(例如苯基)硅烷诸如二苯基甲基(二甲基氨基)硅烷的后续反应，以及任选经由与例如六甲基二硅氮烷的反应用例如三甲基甲硅烷基基团封端。还应当理解，也可执行反向过程。例如，步骤1可包括基于单官能化芳基(例如苯基)的硅烷的反应，并且步骤2可包括基于三官能化芳基(例如苯基)的硅烷的反应，之后进行任选的封端。还应当理解，无论是先使用基于单官能化芳基(例如苯基)的硅烷，之后使用基于三官能化芳基(例如苯基)的硅烷，还是先使用基于三官能化芳基(例如苯基)的硅烷，之后使用基于单官能化芳基(例如苯基)的硅烷，所述方法均可提供具有不同连接度的产物。这部分是由于控制官能化硅烷的单一反应性基团与颗粒表面上的单个羟基之间的1∶1摩尔反应极其困难。例如，虽然在步骤1中，三官能化芳基(例如苯基)硅烷的反应具有与颗粒表面上的两个羟基基团反应以形成双齿产物的选择，但可能仅一个反应性基团与颗粒表面上的一个羟基相互作用，从而形成单个氧硅键。在这种情况下，这留下两个剩余的反应性基团，它们可能在步骤2中与一个或甚至两个单官能化芳基(例如苯基)硅烷反应以形成产物的混合物。作为另外一种选择，在步骤1中，在三官能化芳基(例如苯基)硅烷与颗粒表面上的所有可用羟基基团之间可能无法获得定量反应收率。因此，与从步骤1键合的单齿或双齿三官能化芳基(例如苯基)硅烷相反，存在步骤2中的单官能化硅烷中的一种与颗粒表面上的游离羟基直接反应的可能性。也存在其他可能性，并且这对于本领域的技术人员将是显而易见的。在一个方面，本公开因此提供了一种用于制备本文所述固定相组合物的方法，该方法包括：使二氧化硅或有机二氧化硅颗粒与三官能化芳基(例如苯基)硅烷反应以形成第一表面改性；以及使二氧化硅或有机二氧化硅颗粒再次与单官能化芳基(例如苯基)硅烷反应以形成第二表面改性。在一个方面，该方法获得的所得组合物的总芳基(例如，苯基)表面覆盖率大于或等于5.3μmol/m2，例如，大于或等于5.4μmol/m2，大于或等于5.5μmol/m2，大于或等于5.6μmol/m2，大于或等于5.7μmol/m2，大于或等于5.8μmol/m2，大于或等于5.9μmol/m2，或者大于或等于6.0μmol/m2。在一个方面，上述方法还包括封端步骤。如上所述，本发明所公开的方法产生本文所述的表面改性。因此，在一个方面，本发明所公开的方法产生包含式i、ii、iii或iv的表面改性：或它们的组合，其中变量如在第一至第十五实施方案中的任一项中所描述。通过本发明所公开的方法制备的组合物还具有如针对上述示例性组合物所述的平均粒度、整料形式、ph、温度、表面积、孔体积、微孔表面积、平均孔径以及芯直径与颗粒直径的比率中的一者或多者。在某些方面，在与三官能化苯基硅烷反应之前，将二氧化硅或有机二氧化硅颗粒再羟基化。在一个方面，在本发明所公开的方法中使用宽孔的表面多孔型二氧化硅颗粒。在一个方面，本文所述的方法提供的％c值大于衍生自芳族碳的固定相％c值的0.85％，例如大于衍生自芳族碳的固定相％c值的0.90％，或大于衍生自芳族碳的固定相％c值的0.90％。在可供选择的方法中，三官能化和单官能化芳基(例如苯基)硅烷的反应是反向的。因此，在一个方面，本公开提供了一种用于制备本文所述固定相组合物的方法，该方法包括：使二氧化硅或有机二氧化硅颗粒与单官能化芳基(例如苯基)硅烷反应以形成第一表面改性；以及使二氧化硅或有机二氧化硅颗粒再次与三官能化芳基(例如苯基)硅烷反应以形成第二表面改性。在一个方面，该方法获得的所得组合物的总芳基(例如，苯基)表面覆盖率大于或等于5.3μmol/m2，例如，大于或等于5.4μmol/m2，大于或等于5.5μmol/m2，大于或等于5.6μmol/m2，大于或等于5.7μmol/m2，大于或等于5.8μmol/m2，大于或等于5.9μmol/m2，或者大于或等于6.0μmol/m2。在一个方面，上述方法还包括封端步骤。该方法还可产生包括式i、ii、iii或iv的表面改性：或它们的组合，其中变量如在第一至第十五实施方案中的任一项中所描述。通过该反向方法制备的组合物还可具有如针对上述示例性组合物所述的平均粒度、整料形式、ph、温度、表面积、孔体积、微孔表面积、平均孔径以及芯直径与颗粒直径的比率中的一者或多者。在某些方面，可在与反向方法的单官能化苯基硅烷反应之前将二氧化硅或有机二氧化硅颗粒再羟基化。通过以下非限制性示例进一步说明了本发明的技术。示例蛋白质rplc固定相的合成和初始特性使用逐层技术由大约2μm无孔二氧化硅颗粒制备大约3μm表面多孔型颗粒。参见journalofchromatography.a2014，1357，36-52和journalofchromatography.a2011，1218(15)，1915-38。随后使用本领域技术人员熟知的技术对粗颗粒进行灰化、水热处理、煅烧和再羟基化。最终的再羟基化二氧化硅批次通过表1中的以下尺度来表征。表1通过用下文详述的硅烷化试剂处理，对三(3)份最终再羟基化的二氧化硅进行表面改性。所有试剂购自gelest公司并被直接使用。本领域技术人员将认识到存在以下供应品和供应商的等同形式，同样地，下面列出的供应商不应被解释为限制性的。表面改性程序使用以下试剂：正丁基二甲基(二甲基氨基)硅烷、二苯基甲基(二甲基氨基)硅烷、三(二甲基氨基)苯基硅烷和六甲基二硅氮烷。本发明组合物使用本文所述的基于苯基的多步硅烷化方法制备以下本发明组合物。将一部分(二十克)再羟基化二氧化硅在甲苯中浆化，通过共沸汽提干燥，用过量三(二甲基氨基)苯基硅烷处理，然后洗涤，水解，洗涤，真空干燥并通过tga和％c分析。然后将材料在甲苯中浆化，通过共沸汽提干燥，用过量二苯基甲基(二甲基氨基)硅烷处理，洗涤，真空干燥并通过tga和％c分析。然后使用本领域技术人员已知的技术将材料用六甲基二硅氮烷封端，洗涤，真空干燥，并且通过tga和％c分析。为了比较差异并利用该方法和所得组合物的优势，下文描述了使用常规基于苯基的单步硅烷化方法的比较组合物。比较组合物a将一部分(五十克)再羟基化二氧化硅在甲苯中浆化，通过共沸汽提干燥，用过量正丁基二甲基(二甲基氨基)硅烷处理，然后洗涤，真空干燥并通过tga和％c分析。然后使用本领域技术人员已知的技术将材料用六甲基二硅氮烷封端，洗涤，真空干燥，并且通过tga和％c分析。比较组合物b将一部分(五十克)再羟基化二氧化硅在甲苯中浆化，通过共沸汽提干燥，用过量二苯基甲基(二甲基氨基)硅烷处理，然后洗涤，真空干燥并通过tga和％c分析。然后使用本领域技术人员已知的技术将材料用六甲基二硅氮烷封端，洗涤，真空干燥，并且通过tga和％c分析。本发明组合物和比较组合物的碳百分比数据列于下表2中。表面覆盖率计算是基于表面改性前后碳含量的变化。替代方法除了上述程序之外，还可在进行后续单官能化硅烷键合之前用三官能化硅烷进行重复键合反应。例如，可将一部分(二十克)再羟基化二氧化硅在甲苯中浆化，通过共沸汽提干燥，用过量三(二甲基氨基)苯基硅烷处理，然后洗涤，水解，洗涤，真空干燥，然后通过tga和％c分析。然后可再次将材料在甲苯中浆化，通过共沸汽提干燥，用过量三(二甲基氨基)苯基硅烷再次处理，然后洗涤，水解，洗涤，真空干燥并通过tga和％c分析。这种再处理技术可根据需要重复地进行，并且是一种提高最终苯基表面浓度的手段。作为另外一种选择，可使用本领域技术人员熟知的其他苯基硅烷聚合技术代替重复三官能化键合步骤。这些广泛键合材料中的任何一种可接着在甲苯中浆化，通过共沸汽提干燥，用过量单官能化硅烷如二苯基甲基(二甲基氨基)硅烷处理。然后可将所得的材料洗涤，真空干燥并通过tga和％c分析。最后，也可使用本领域技术人员已知的技术将所得材料诸如用六甲基二硅氮烷封端，洗涤，真空干燥，并且通过tga和％c分析。表2覆盖率计算使用自j.liq.chromatogr.，1，(1978)561-586(参见下文)修改的公式计算配体表面覆盖率(如表2中所记录)。公式1(eq1)提供了用于计算步骤1反应产物的表面覆盖率的方法，并且公式2(eq2)提供了用于计算步骤2(eq2)反应产物的表面覆盖率的方法。可使用公式3(eq3)由所得配体覆盖率计算总苯基覆盖率。产生关于配体的分子量和它们的碳含量相对量的近似值。对于三官能化硅烷，这些值取决于硅烷如何键合到表面，以及配体是否反应形成单齿、二齿或三齿键。然而，就本文所述的表面改性而言，这些不同单齿、二齿或三齿形式之间的有效分子量和碳含量相对量的差异可忽略不计。因此，为了简化计算，假设与三官能化硅烷的反应提供二齿表面改性产物，即其中材料表面键上的两个羟基基团与来自三官能化甲硅烷基的两个反应性基团反应，以与相同的硅原子键合，例如以形成具有式ii的改性剂。为了得到总苯基表面覆盖率的精确值，在采用不同的含苯基硅烷的每个分立步骤之后，有必要测量碳百分比。下文提供了第一配体(步骤1)覆盖率、第二(步骤2)配体覆盖率和苯基表面覆盖率的示例性计算：(eq1)(eq2)其中：pcs1＝步骤1材料上的碳％pc0＝未衍生化材料上的碳％(对于二氧化硅颗粒假设等于0)pcl1＝步骤1配体中的碳％＝100*12*n1/me1s＝未衍生化材料的比表面积(m2/g)n1＝步骤1配体中的碳原子数me1＝步骤1配体的有效分子量(g/mol)pcs2＝步骤2材料上的碳％pcl2＝步骤1配体中的碳％＝100*12*n2/me2n2＝步骤2配体中的碳原子数me2＝步骤2配体的有效分子量(eq3)本发明组合物和比较组合物的基础颗粒和键合相详细信息提供于表3中。表3*spp表示表面多孔型颗粒。(50，v)表示在50％样品体积下通过coulter粒度分析测得的颗粒直径。rho被定义为颗粒的芯直径与其总直径的比率。通过汞解吸孔隙度测定法确定平均孔径。将本发明组合物和比较组合物填充到色谱柱中，并使用单克隆抗体样品的蛋白质反相色谱法评估其性能。蛋白质反相色谱法使用三种不同的单克隆抗体样品来全面评估本发明固定相组合物和比较固定相组合物的色谱性能：nistmab基准物质8671的还原ides消解样品、英夫利昔单抗的非还原ides消解样品，以及抗橘霉素鼠单克隆抗体的未掺杂(完整)样品(完整mab质量数检查标准品，部件号186006552，购自waterscorporation，milfordma)。如下制备nistmab基准物质(rm)8671的还原ides消解物：将100μg配制的nistmab基准物质(rm)8671(igg1k)加入100单位ides中并在37℃下温育30分钟。然后通过加入1mtcep和固体guhcl将所得ides消解的mab变性和还原。用于变性/还原步骤的最终缓冲组合物为大约6mguhcl、80mmtcep和10mm磷酸盐(ph7.1)。将ides消解的nistmabrm8671(1.5mg/ml)在37℃下在该缓冲液中温育1小时，然后储存在4℃直至分析。以类似的方式制备英夫利昔单抗的非还原ides消解物。将英夫利昔单抗(100μg)加入100单元ides中并在37℃下温育30分钟。然后将浓度为2mg/ml的样品储存在4℃下直至分析，而不将其变性或还原。还通过在0.1％(w/v)甲酸水溶液中重构1mg量冻干mab来制备2mg/ml完整抗橘霉素鼠单克隆抗体样品。该样品也储存在4℃直至分析。使用2.1mm×50mm柱进行还原ides片段nistmab、ides片段英夫利昔单抗和完整抗橘霉素mab的反相(rp)分离。在进行分析质量负荷和对应分析之前，通过两次重复20μg完整抗橘霉素mab的注射对所有测试柱进行调理。然后将样品以0.2ml/min的流量和80℃的温度在20min内15％至55％有机流动相的线性梯度下进行层析。经由uv检测(280nm，10hz)，然后在线esi-ms连续检测在上述分离期间洗脱的物质。用xevog2q-tof质谱仪采集质谱，该质谱仪以3.0kv的毛细管电压、120℃的源温度、450℃的去溶剂化温度和50v的样品锥孔电压操作。在500-5000m/z范围内以2hz的速率采集质谱，分辨率为大约20,000。下文提到用于这些分析的附加方法参数。图3-图10示出使用填充有不同反相色谱材料的柱获得的反相分离的比较，其细节在下文进一步论述。除色谱图之外，也计算峰容量值。对于每次分离，计算平均峰容量(pc)。此外，为了说明不同的固定相可表现出不同程度的选择性，还使用分离的最后一种洗脱物质和第一种洗脱物质之间的保留时间差值来计算有效峰容量。以下公式描述了这些计算：平均峰容量：平均有效峰容量：方法参数：系统：acquityuplch-classbio注射质量负荷：1μg柱：原型a(prototypea)，2.1mm×50mm原型b，2.1mm×50mm原型c，2.1mm×50mmwatersacquityuplcproteinbehc4300a1.7μm，2.1mm×50mmamthaloproteinc4，2.1mm×50mmagilentadvancebiorp-mabdiphenyl，2.1mm×50mm柱温：80℃uv检测：280m，10hz流动相：(a)0.1％甲酸水溶液/(b)0.1％(v/v)甲酸acn溶液或(a)0.1％三氟乙酸水溶液/(b)0.1％(v/v)三氟乙酸acn溶液除了上述方法之外，本文所述的本发明固定相组合物可与30℃至高达100℃范围内的分离温度、介于0.1mm/s和10mm/s之间的色谱速度以及由乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇或它们的组合组成的有机溶剂洗脱液一起使用。也可使用多种不同的酸性流动相添加剂，例如甲酸、三氟乙酸、七氟乙酸或它们的组合。可将这些酸以范围介于0.005％(w/v)和0.5％(w/v)之间的浓度加入含水或有机流动相中。本发明所公开固定相组合物的优异品质现在描述了本发明所公开固定相组合物相对于可商购获得对应物的优异品质/特性。应当理解，本发明所公开的组合物具有许多其他可用的特性，并且这些特性对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。因此，以下用于示例性目的，并且不是所有技术效果或本发明组合物所解决问题的详细清单。ph和温度稳定性用于蛋白质反相分离的大多数方法需要使用包含酸性离子配对剂诸如tfa或甲酸的流动相。这些强酸性流动相(ph值介于1.9和3之间)通常与高分离温度相关，从而将柱加热至介于60℃和90℃之间的温度。这确保蛋白质采用更可逆的结构构象和更可逆的吸附/解吸行为。在不抵抗酸催化水解的情况下，固定相可损失其键合相的级分，并且在用于蛋白质分离时表现出不稳定、可能恶化的层析。因此，用于蛋白质反相色谱法的理想键合相必须表现出对酸催化水解的抗性并且在高温(例如，高于60℃)下稳定。为此，使用等度测试评估各种固定相组合物对键合相的酸催化水解的抗性，其中在1.4ml/min的流速和60℃的温度下使2.1mm×50mm柱经受0.5％(v/v)含水tfa，持续约20小时。在该低ph稳定性测试中，定期注射对羟基苯甲酸甲酯样品，并监测其保持性(k′)。下文提到用于该测试的方法参数。图9示出对应于对羟基苯甲酸甲酯的保持性(k′)作为暴露于酸性应力条件的时间的函数变化的不同固定相的迹线。系统：具有bsm、tuve、sm和柱管理器模块的acquityuplc系统柱：原型a，2.1mm×50mm原型b，2.1mm×50mm原型c，2.1mm×50mmwatersacquityuplcproteinbehc41.7μm，2.1mm×50mmwatersacquityuplcbehc181.7μm，2.1mm×50mmamthaloproteinc4，2.1mm×50mmagilentadvancebiorp-mabdiphenyl，2.1mm×50mm流动相(v/v)0.5％tfa水溶液流速(ml/min)：1.4样品(μg/ml)：硫脲(25)、苯胺(525)、苯酚(300)、对羟基苯甲酸甲酯(50)进样量：2.0μl如图9所示，比较组合物a和b显示出-97％和-20％的对羟基苯甲酸甲酯保持性的变化，而本发明的组合物仅表现出-18％的变化。也就是说，具有单官能化正丁基二甲基键的比较组合物a显示出不期望差的低ph稳定性，这是与可商购获得amthaloproteinc4柱(-95％)共有的特征。同时，比较组合物b和本发明组合物均显示出显著更好的低ph稳定性。实际上，已发现它们的低ph稳定性优于可商购获得的acquityuplcproteinbehc4柱(-27％)，并且约相当于市售agilentadvancebiorp-mabdiphenyl柱(-15％)。低ph稳定性的这些差异对于柱技术提供稳定色谱性能的能力十分重要。实际上，另外的测试已表明比较组合物a和b的低ph稳定性之间的差值相当于比峰保持时间偏移和峰宽度展宽慢约4倍。值得注意的是，如下所述，除了在低ph和高温下稳定之外，本发明的组合物在峰容量、不完全峰洗脱、批次间重现性和基线特性方面也具有显著的改善。增强的峰容量通过本文所述的多步硅烷键合方法制备的键合相提供峰容量的显著改善。这些改善可例如在图3a-f和图4a-f中提供的比较数据中观察到。这些图展示了如用甲酸或tfa流动相获得的三种不同抗体样品的反相色谱图。因为它们基于还原ides消解的nistmab、ides消解的英夫利昔单抗和完整抗橘霉素mab，所以这三个样品包含25至高达150kda(如图3a-f中所标记)范围内的七种不同的基于mab的物质。这使得能够以报告其用于测定基于mab的生物治疗剂的实用性的方式来综合测量原型固定相的性能。来自这些样品的峰宽度和保留时间信息可用于严格计算原型和可商购获得柱技术的平均有效峰容量(参见上式)。在标准峰容量测量结果限定可假设上适合分离的梯度时间的峰的数目情况下，有效峰容量考虑到分离选择性，因为其基于给定分离的最后一种洗脱组分和第一种洗脱组分之间存在的经验上观察的时间窗口。因此，它是有效的峰容量，最好地说明柱与其对应键合相的分辨能力。当以此方式观察时，本发明组合物的性能是相当显著的。本发明组合物产生的甲酸有效峰容量比基于相同基础颗粒的比较组合物高至少10％。本发明组合物产生的甲酸有效峰容量也比可商购获得的对应物高17％(参见图5b)。因此，考虑到甲酸流动相的电离友好性，本发明所公开的固定相组合物非常适合lc-ms分析。然而，如图6b所示，由具有更强离子配对tfa流动相的本发明固定相组合物产生的有效峰容量也是引人注目的，因为它比其他原型高2％，并且比可商购获得的对应物高至少15％。重复测试固定相性能(n＝2根柱)。对于可商购获得的固定相，用每个所测试平行柱评估填充材料的独特批次/批量。本发明的组合物结果对应于上述批次1。峰洗脱和基线特性除了提供增强的峰容量之外，本发明固定相组合物解决了涉及不完全峰洗脱和差基线质量的问题。应注意，当用正烷基键合相(即，比较组合物a和amthaloproteinc4)进行mab亚单元的甲酸分离时，fc/2nistmab亚单元的峰面积较低，并且随后形成的部分色谱图显示高背景(图3a-f)。在这种情况下，已发现蛋白质分析物不完全洗脱为离散的色谱峰，相反蛋白质的很大一部分在分离的大部分时间内缓慢解吸。与本发明的固定相组合物类似，基于苯基的键合相似乎减轻了这种不可取的色谱行为。如图7所示，由于基于苯基的键合中的任一者，fc/2nistmab亚单元的峰面积明显更高。继而，来自这些相(包括本发明的固定相组合物)的色谱图明显更干净并且更易于解释。对于可商购获得的固定相，用每个所测试平行柱评估填充材料的独特批次/批量。本发明的组合物结果对应于如上所述的批次1。批次间重现性已发现，本发明的固定相组合物产生优异的批次间重现性。从两种不同批次的本发明固定相组合物中获得的示例性色谱数据提供于图8a-8f中。用两个批次实现的分离高度相似，从而显示基于本发明固定相组合物的未来方法的稳健性。重复测试固定相性能(n＝2根柱)。表4和5示出了图8a-8f的两个不同批次的保留时间重现性。表4表5总之，本文所述的固定相组合物提供了前所未有品质的蛋白质反相分离；在峰形状、峰容量和基线特性方面具有显著改善；为批次间可重现的；并且为ph和温度稳定的。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容以引用方式并入本文。降低的温度依赖性本发明固定相组合物的另一个有利特性是降低的温度依赖性。常规蛋白质反相分离(诸如完整单克隆抗体(mab)或其片段的分离)需要使用大于60℃的柱温，以便使分析物作为离散的色谱峰充分回收。图10a-10c提供了用本发明固定相组合物以及比较固定相中的一者获得的色谱数据。方法参数：系统：acquityuplch-classbio注射质量负荷：1μg柱：原型a，2.1mm×50mm原型b，2.1mm×50mm原型c，2.1mm×50mmwatersacquityuplcproteinbehc41.7μm，2.1mm×50mmamthaloproteinc4，2.1mm×50mmagilentadvancebiorp-mabdiphenyl，2.1mm×50mm柱温：80℃uv检测：280m，10hz流动相：(a)0.1％甲酸水溶液/(b)0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液或(a)0.1％三氟乙酸水溶液/(b)0.1％(v/v)三氟乙酸乙腈溶液或(a)0.02％三氟乙酸，0.08％甲酸(v/v)水溶液/0.02％三氟乙酸，0.08％甲酸(v/v)乙腈溶液利用这些数据，完整mab的回收显示为柱温和流动相系统的函数。在每个所测试流动相系统中，已发现本发明固定相组合物在更广泛的温度范围内产生更高的回收率。事实上，与比较组合物不同，本发明的固定相组合物能够在低至50℃的温度下产生高回收率的所分析单克隆抗体。因此，本文所述的固定相组合物使得能够在特别低的柱温下进行蛋白质反相分离。可容易利用这种能力以限制蛋白质分析物的柱上降解，该降解可通过多种机制发生，包括但不限于水解。核酸反相色谱法核酸具有增加的治疗相关性，如可见于它们作为小干扰rna的用途以及它们对最近fda批准的基因疗法的意义。在它们的分析和表征中，使用反相色谱法已变得常见。在这种分离中，采用能够离子配对的流动相添加剂(诸如乙酸三乙醇胺)以有利于保持，其实现原本是有挑战性的，因为核酸是相对亲水的并且它们具有许多重复的负电荷。在该方法的一个细微变型形式中，还可使用包含六氟异丙醇与相对较低浓度三乙醇胺的流动相体系来实现相当的分离效率以及改善的ms灵敏度。在了解需要用于核酸分析的改进方法的基础上，研究了本发明组合物在离子对反相分离中的实用性。评估色谱能力的比较例提供于图11a-11c中，其中一组15-mer至35-mer脱氧胸苷寡核苷酸在由本发明组合物的固定相组成的色谱柱，由behc181.7μm固定相组成的色谱柱或者由behc181.7μm固定相组成的色谱柱(各自可商购获自waterscorporation，milford，ma)上分离。由于后两根色谱柱表示寡核苷酸反相分离的现有技术水平，因此这是信息相当丰富的比较。在比较色谱图之后，可立即观察到，在保持性方面存在显著差异。最值得注意的是，尽管该具体实施方案基于低表面积基底(具有平均孔径的表面多孔型颗粒)这一事实，但与现有技术behc18柱相比，本发明的组合物提供显著更高的保持性。还值得注意的是，利用由本发明组合物组成的柱，该组寡聚脱氧胸苷的有效峰容量最高。虽然不限于理论，但据信由于本发明组合物特别高的苯基部分表面覆盖率，本发明组合物对于核酸分离尤其有利，这确保了在固定相和核酸分子的核碱基残基之间吸引pi-pi电子相互作用的广泛机会。因此，在一个具体实施方案中，本发明的组合物用于进行反相分离，该反相分离有利地分离核酸分子。根据以下实验参数生成对应于图11a-11c的比较例：时间(min)(ml/min)％a％b曲线初始0.29010初始24.00.27030625.00.27030626.00.290101135.00.290206本发明组合物的碱式消解和含苯基的甲硅烷基多聚体的观察在本发明的一个实施方案中，多步硅烷化产生由连接到单官能化二苯基单甲基甲硅烷基基团的三官能化单苯基甲硅烷基基团构成的表面。为确认这种新型化学组分的存在，使本发明的组合物经受碱性水解条件，通过该条件将键合相的组分释放到溶液中。虽然仅是定性的，但是从理论上说明了对这些反应产物的后续分析，以提供直接观察键合相的化学组成部分和主要组成特征的机会。在本文中，将0.50克固定相在65℃下加热2小时，同时在5.0ml体积的包含0.2％氢氧化铵的50：50乙腈/水中旋转。然后通过离心法将所得的碱性提取物作为上清液收集。然后通过负离子模式电喷雾离子化(esi)飞行时间(tof)质谱法分析包含在该碱性提取物中的反应产物。图12a呈现了代表本发明组合物的质谱。通过该分析，检测到四种主要的化学组合物。由于碱性条件足以水解任何类型的硅氧烷键，因此观察到三官能化单苯基(图12b，结构i)和单官能化二苯基单甲基(图12b，结构ii)物质主导该光谱。另外，然而，在293和351的m/z值下观察到两种其他高分子量物质。293m/z离子表示两种由硅氧烷键连接的三官能化单苯基物质(图12b，结构iii)，而351m/z离子可归属于组合的三官能化单苯基和单官能化二苯基单甲基物质(图12b，结构iv)。正是这些后面离子和相应碱式消解反应产物提供了与本发明最密切相关的结构和化学组成的证据。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容以引用方式并入本文。当前第1页12