一种抗氧化融合蛋白的生产方法与流程

本发明涉及抗氧化
技术领域：
，具体涉及一种抗氧化融合蛋白的生产方法。
背景技术：
：超氧化物歧化酶sod是体内对抗自由基的第一道防线，根据其活性中心结合的金属离子的不同，sod主要分为三类：铜锌超氧化物歧化酶(cu/zn-sod，也称为sod1)、铁超氧化物歧化酶(fe-sod)和锰超氧化物歧化酶(mn-sod)。其中，fe-sod主要存在于原核细胞的基质中。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢，就会产生超氧阴离子自由基，若不予以消除，会在体内产生连锁反应破坏细胞。正常情况下，体内自由基的产生和清除处于动态平衡。sod在年轻人的血液中很多，人们过了30岁以后，人体内的sod随着人体组织的老化而产生率逐渐降低。由于体内的sod随着年龄的增加而渐减，再加上环境的恶化，大量的自由基超过身体所能应付的程度，因此借助外来的补充是必需的。sod的来源极为广泛，目前已从细菌、真菌、藻类、鱼类、昆虫、植物和哺乳类动物等各种生物体分离得到。国内已开发的sod资源有：动物血液(牛、猪等)，菌类发酵(酵母菌、大肠杆菌等)，高等植物(藻类、刺梨等)等。动物提取sod的主要原料可以是各种哺乳动物血液、肝脏、脑等，然而一些人畜共患病的原因使得许多国家禁止在食品、化妆品、医疗等领域使用动物来源的sod。然而从上述来源中所提取的sod普遍存在酶活性较低、清除氧自由基的能力较差等缺点。金属硫蛋白(metallothionein，mt)，又称巯基金属结合蛋白，化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一种广泛存在于人体、动物、植物以及微生物体内的有特殊功能的蛋白质。人类mt按分子特征和分布分为四个亚群：mt1、mt2、mt3、mt4。mt1又分9个亚类，mt2又分mt-2a和mt-2b。mt1和mt2分布全身，mt3分布于脑，mt4主要分布于皮肤。具有参与体内微量元素代谢、重金属解毒、清除自由基、参与dna复制和转录，影响蛋白质和能量代谢、拮抗电离辐射、增强机体免疫力和应激保护等生物学功能。其中，清除自由基和结合金属离子是mt最重要的两项功能。当前国内对mt的研究开发虽然起步较早，但大多都集中在基因的克隆和生物学功能的探讨上，并没有大规模生产重组金属硫蛋白融合蛋白。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种抗氧化融合蛋白的生产方法，采用本发明的生产方法，能够将抗氧化融合蛋白进行大规模生产。本发明提供了一种抗氧化融合蛋白的生产方法，包括以下步骤：1)将抗氧化融合基因与载体连接后转入大肠杆菌，得到含有抗氧化融合基因的大肠杆菌；所述抗氧化融合基因是将mt基因和sod基因连接后得到；所述mt基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列；所述sod基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列；2)将所述步骤1)得到的含有抗氧化融合基因的大肠杆菌接种于含有氨苄和氯霉素的lb液体培养基中进行第一培养，得到第一培养物；所述第一培养的时间为12～16h；3)将所述步骤2)得到的第一培养物接种于含有氨苄和氯霉素的tb液体培养基中进行第二培养，得到第二培养物；所述第二培养的时间为3.5～4.5h；4)将所述步骤3)得到的第二培养物与异丙基硫代半乳糖苷、氯化锌混合后进行诱导培养，得到诱导物；5)将所述步骤4)得到的诱导物进行离心，将得到的菌体用缓冲液重悬后与t4溶菌酶混合、温育，将得到的温育物与tween20混合后进行水浴，将得到的水浴物离心，得到抗氧化融合蛋白；所述水浴的温度为60～70℃；所述水浴的时间为0.5～1.5h。优选的，所述步骤1)抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。优选的，所述步骤1)抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示。优选的，所述步骤1)抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示。优选的，所述步骤1)抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示。优选的，所述步骤2)lb液体培养基中，所述腺嘌呤核糖核苷酸的含量为90～110μg/ml，所述氯霉素的含量为30～40μg/ml。优选的，所述步骤3)tb液体培养基中，所述腺嘌呤核糖核苷酸的含量为90～110μg/ml，所述氯霉素的含量为30～40μg/ml。优选的，所述步骤4)诱导培养的时间为12～20h，所述诱导培养的温度为18～22℃。优选的，所述步骤5)温育的时间为25～35min，所述温育的温度为18～22℃。优选的，所述步骤5)水浴物离心后还包括：将得到的上清液经ni柱纯化后，得到抗氧化融合蛋白。本发明提供了一种抗氧化融合蛋白的生产方法，本发明将抗氧化融合基因转化入大肠杆菌中后进行表达，大肠杆菌经t4溶菌酶裂解后，在60～70℃下水浴0.5～1.5h，既能够裂解大肠杆菌，又能够释放抗氧化融合蛋白，并能够保证抗氧化融合蛋白的活性。本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的方法既可以裂解大部分菌体，又能够保证抗氧化融合蛋白的活性，还能够使得其它蛋白变性，适合大规模生产。附图说明图1为考马斯亮蓝检测蛋白结果。具体实施方式本发明提供了一种抗氧化融合蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将抗氧化融合基因与载体连接后转入大肠杆菌，得到含有抗氧化融合基因的大肠杆菌；所述抗氧化融合基因是将mt基因和sod基因连接后得到；所述mt基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列；所述sod基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列；2)将所述步骤1)得到的含有抗氧化融合基因的大肠杆菌接种于含有氨苄和氯霉素的lb液体培养基中进行第一培养，得到第一培养物；所述第一培养的时间为12～16h；3)将所述步骤2)得到的第一培养物接种于含有氨苄和氯霉素的tb液体培养基中进行第二培养，得到第二培养物；所述第二培养的时间为3.5～4.5h；4)将所述步骤3)得到的第二培养物与异丙基硫代半乳糖苷、氯化锌混合后进行诱导培养，得到诱导物；5)将所述步骤4)得到的诱导物进行离心，将得到的菌体用pmsf缓冲液重悬后与t4溶菌酶混合、温育，将得到的温育物与tween20混合后进行水浴，将得到的水浴物离心，得到抗氧化融合蛋白；所述水浴的温度为60～70℃；所述水浴的时间为0.5～1.5h。本发明将抗氧化融合基因与载体连接后转入大肠杆菌，得到含有抗氧化融合基因的大肠杆菌；所述抗氧化融合基因是将mt基因和sod基因连接后得到；所述mt基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列；所述sod基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列。在本发明中，所述抗氧化融合基因是将mt基因和sod基因连接后得到，所述mt基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：atggatccgaactgcagctgcgcggcgggcgatagctgcacctgcgcgggcagctgcaaatgcaaagaatgcaaatgcaccagctgcaagaaaagctgctgcagctgctgcccggtgggctgcgcgaaatgcgcgcagggctgcatttgcaaaggcgcgagcgataaatgcagctgctgcgcg。在本发明中，所述sod基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：atggcgtttgtgcaggaacctctgccttttgatccgggagcgctggaaccgtatggcatgagcgcgaaaaccctggaatttcactatggcaaacatcataaaggctatgtggataatctgaataaactgacccaggataccgaactggcggataaaagcctggaagatgtgattcgtaccacctatggggacgctgccaaggtgggcattttcaataatgcggcgcaggtgtggaatcatacctttttttggaatagcctgaaaccgggaggtggcggcgtgccgaccggggatgtggccgctcgtataaacagcgcgtttgggagctatgacgaattcaaggcgcagtttaagaatgccgcagccacccagtttggctctggctgggcgtggctggtgctggaagcgggcaccctgaaggtgaccaaaaccgcgaacgcggagaatccgcttgttcatggccaagtgccactgctgaccattgatgtgtgggaacatgcgtattatctggattatcagaatcgtcgtccggatttcatagacaattttctgaatcagctggtgaattgggattttgtggcgaaaaacttagcagcggcg。本发明对所述mt基因和sod基因连接的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明将含有抗氧化融合基因的大肠杆菌接种于含有氨苄和氯霉素的lb液体培养基中进行第一培养，得到第一培养物；所述第一培养的时间为12～16h。在本发明中，所述lb液体培养基中，所述腺嘌呤核糖核苷酸的含量优选为90～110μg/ml，更优选为100μg/ml；所述氯霉素的含量优选为30～40μg/ml，更优选为34μg/ml。本发明在所述第一培养添加腺嘌呤核糖核苷酸和氯霉素的作用是为工程菌生长提供抗性。在本发明中，所述第一培养的时间为12～16h，优选为13～15h，更优选为14h；所述培养的温度优选为37℃。本发明对所述含有抗氧化融合基因的大肠杆菌的接菌量没有特殊限定，采用常规接菌量即可。本发明将所述第一培养物接种于含有氨苄和氯霉素的tb液体培养基中进行第二培养，得到第二培养物；所述第二培养的时间为3.5～4.5h。在本发明中，所述第一培养物与tb液体培养基的体积比优选为1:100。在本发明中，所述tb液体培养基中，所述腺嘌呤核糖核苷酸的含量优选为90～110μg/ml，更优选为100μg/ml；所述氯霉素的含量优选为30～40μg/ml，更优选为34μg/ml。本发明在所述第二培养添加氨苄和氯霉素的作用是为工程菌生长提供抗性。本发明经过第二培养后，工程菌扩大培养，增加细菌数量，使大肠杆菌生长到对数生长期。在本发明中，所述第二培养的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述第二培养的温度优选为37℃。在本发明中，所述第二培养物的od值优选为0.5～1。本发明将第二培养物与异丙基硫代半乳糖苷、氯化锌混合后进行诱导培养，得到诱导物。在本发明中，所述第二培养物与异丙基硫代半乳糖苷、氯化锌混合后，所述异丙基硫代半乳糖苷的终浓度优选为0.2mm，所述氯化锌的终浓度优选为0.2mm。本发明在诱导培养中添加异丙基硫代半乳糖苷和氯化锌的作用是:iptg为诱导剂，诱导蛋白合成，氯化锌诱导产生zn-mt，所述mt为金属硫蛋白基因。在本发明中，所述诱导培养的时间优选为12～20h，更优选为13～18h，最优选为16h；所述诱导培养的温度优选为18～22℃，更优选为20℃。本发明将得到的诱导物进行离心，将得到的菌体用缓冲液重悬后与t4溶菌酶混合、温育，将得到的温育物与tween20混合后进行水浴，将得到的水浴物离心，得到抗氧化融合蛋白；所述水浴的温度为60～70℃；所述水浴的时间为0.5～1.5h。本发明对所述诱导物进行离心的离心条件没有特殊限定，采用常规离心得到菌体的条件即可。在本发明中，所述缓冲液优选包括：20mmtris，300mmnacl，1mmedta，0.5mmpmsf缓冲液。在本发明中，所述菌体用缓冲液重悬后与t4溶菌酶混合，所述t4溶菌酶的终浓度优选为0.2mg/ml。在本发明中，所述t4溶菌酶能够裂解菌体。在本发明中，所述温育的时间优选为25～35min，更优选为30min；所述温育的温度优选为18～22℃，更优选为20℃。在本发明中，所述温育物与tween20混合后，所述tween20的终质量百分含量优选为0.5％。在本发明中，所述tween20稳定蛋白质，促进大肠杆菌裂解。在本发明中国，所述水浴的温度为60～70℃，优选为65℃；所述水浴的时间为0.5～1.5h，优选为1h。在本发明中，所述水浴的温度和时间，既能够能够保留抗氧化融合蛋白的活性，又能够裂解工程菌。在本发明中，所述水浴物离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为10000rpm；所述离心的时间优选为25～35min，更优选为30min。在本发明中，所述水浴物离心后还优选包括：将得到的上清液经ni柱纯化后，得到抗氧化融合蛋白。本发明对所述ni柱纯化的条件没有特殊限定。在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示，具体如下所示：mdpncscaagdsctcagsckckeckctsckksccsccpvgcakcaqgcickgasdkcsccaggggsggggsggggsmafvqeplpfdpgalepygmsaktlefhygkhhkgyvdnlnkltqdteladksledvirttygdaakvgifnnaaqvwnhtffwnslkpggggvptgdvaarinsafgsydefkaqfknaaatqfgsgwawlvleagtlkvtktanaenplvhgqvplltidvwehayyldyqnrrpdfidnflnqlvnwdfvaknlaaahhhhhh。其中ggggsggggsggggs为连接肽，hhhhhh为his标签。在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示，具体如下所示：mdpncscaagdsctcagsckckeckctsckksccsccpvgcakcaqgcickgasdkcsccaggggsggggsggggsmafvqeplpfdpgalepygmsaktlefhygkhhkgyvdnlnkltqdteladksledvirttygdaakvgifnnaaqvwnhtffwnslkpggggvptgdvaarinsafgsydefkaqfknaaatqfgsgwawlvleagtlkvtktanaenplvhgqvplltidvwehayyldyqnrrpdfidnflnqlvnwdfvaknlaaa。其中，ggggsggggsggggs为连接肽。在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示，具体如下所示：hhhhhhmafvqeplpfdpgalepygmsaktlefhygkhhkgyvdnlnkltqdteladksledvirttygdaakvgifnnaaqvwnhtffwnslkpggggvptgdvaarinsafgsydefkaqfknaaatqfgsgwawlvleagtlkvtktanaenplvhgqvplltidvwehayyldyqnrrpdfidnflnqlvnwdfvaknlaaaggggsggggsggggsmdpncscaagdsctcagsckckeckctsckksccsccpvgcakcaqgcickgasdkcscca。其中，hhhhhh为his标签，ggggsggggsggggs为连接肽。在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示，具体如下所示：mafvqeplpfdpgalepygmsaktlefhygkhhkgyvdnlnkltqdteladksledvirttygdaakvgifnnaaqvwnhtffwnslkpggggvptgdvaarinsafgsydefkaqfknaaatqfgsgwawlvleagtlkvtktanaenplvhgqvplltidvwehayyldyqnrrpdfidnflnqlvnwdfvaknlaaaggggsggggsggggsmdpncscaagdsctcagsckckeckctsckksccsccpvgcakcaqgcickgasdkcscca。其中ggggsggggsggggs为连接肽。下面结合具体实施例对本发明所述的一种抗氧化融合蛋白的生产方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1mt-sod-his融合蛋白的生产：mt-sod-his片段的扩增：(1)以合成的mt-2a全基因序列(seqqidno.1)为模板，使用以下引物进行pcr扩增，得到mt-2a片段：pcr扩增的体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。pcr反应程序如下：95℃2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min(seqidno.7)mt-fw-2:ctttaagaaggagatatacatatggatccgaactgcagctg；(seqidno.8)mt-rev-2：cctccacttccgccaccgccgctgccgccacctcccgcgcagcagctgcatttatc。(2)以合成的fesod全基因序列(seqidno.2)为模板，使用以下引物进行pcr扩增，得到fesod片段：pcr扩增的体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。pcr反应程序如下：95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min(seqidno.9)sod-fw-2：ggcggtggcggaagtggaggcggtggcagcatggcgtttgtgcaggaac；(seqidno.10)sod-rev-2:ggatccgttatccacttttaatgatgatgatgatggtgcgccgctgctaagtttttc。(3)将上述两段pcr片段混合后，pcr预反应10个循环，反应条件如下：扩增体系：每20ul包括：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，mt-2a5μl，fesod5ul，sterilemiliqwater6.4μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。扩增程序为：95℃2minutes；95℃20s，50℃20s，72℃30s，10个循环；72℃5min。(4)以步骤(3)反应后产物为模板，引物mt-fw-2和sod-rev-2进行pcr，得到mt-sod-his片段；扩增体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。扩增程序：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。(5)mt-sod-his片段的克隆将mt-sod-his片段分别连接到载体pet15b上，转化大肠杆菌dh5a，涂布于含有100ug/mlamp的lb固体培养基平板上，37℃培养16小时，分别挑选单克隆菌落进行鉴定。鉴定为阳性克隆的dh5a经dna测序验证基因序列正确。将含有重组融合蛋白的质粒分别转化到大肠杆菌rosseta(de3)中，得到融合蛋白的表达菌株。(6)融合蛋白的表达与纯化a.融合蛋白的表达将上述融合蛋白单克隆接种到含有100ug/mlamp、34ug氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养12小时后，将培养物按照1:100比例接种到500ml含有100ug/mlamp、34ug氯霉素新鲜tb培养基中，37℃培养4h至od600达到0.8～1时，加入iptg终浓度至0.2mm，zncl2浓度至0.2mm。20℃诱导12～16h。b.菌液裂解离心收集菌体，重悬于20mmtris，300mmnacl，1mmedta，0.5nmpmsf缓冲液中，加入终浓度0.2mg/ml的t4溶菌酶，20℃温育30min，加入tween20至终浓度0.5％，混匀后，置于65℃水浴1h，加热期间搅拌数次，补加pmsf缓冲液1次，将水浴后的溶液在4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。c.ni柱纯化(1)ni柱先用含10mm咪唑的上样缓冲液平衡5倍柱体积。(2)将粗酶液通过0.45um滤膜过滤，过滤后的上清穿过平衡后的ni柱。(3)含有10mm咪唑，0.1％tritonx-114缓冲液冲洗10倍柱体积。(4)20mm咪唑冲洗5倍柱体积洗杂。(5)300mm咪唑洗脱目的蛋白，得到mt-sod-his抗氧化融合蛋白。经检测可知，抗氧化融合蛋白的纯度可达到95％以上，氨基酸序列如seqidno.3所示，具体如下：mdpncscaagdsctcagsckckeckctsckksccsccpvgcakcaqgcickgasdkcsccaggggsggggsggggsmafvqeplpfdpgalepygmsaktlefhygkhhkgyvdnlnkltqdteladksledvirttygdaakvgifnnaaqvwnhtffwnslkpggggvptgdvaarinsafgsydefkaqfknaaatqfgsgwawlvleagtlkvtktanaenplvhgqvplltidvwehayyldyqnrrpdfidnflnqlvnwdfvaknlaaahhhhhh。其中ggggsggggsggggs为连接肽，hhhhhh为his标签。实施例2mt-sod融合蛋白的生产：his-mt-sod片段的扩增：(1)以合成的mt-2a全基因序列(seqqidno.1)为模板，使用以下引物进行pcr扩增，得到mt-2a片段：pcr扩增的体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。pcr反应程序如下：95℃2min；95℃，30s，57℃，20s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min(seqidno.11)mt-fw-1:ctttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcatgagaatc；(seqidno.12)mt-rev-1：cctccacttccgccaccgccgctgccgccacctcccgcgcagcagctgcatttatc。(2)以合成的fesod全基因序列(seqidno.2)为模板，使用以下引物进行pcr扩增，得到fesod片段：pcr扩增的体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。pcr反应程序如下：95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min(seqidno.13)sod-fw-1：ggcggtggcggaagtggaggcggtggcagcatggcgtttgtgcaggaac；(seqidno.14)sod-rev-1:ggatccgttatccacttttacgccgctgctaagtttttc。(3)将上述两段pcr片段混合后，pcr预反应10个循环，反应条件如下：扩增体系：每20ul包括：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，mt-2a5μl，fesod5ul，sterilemiliqwater6.4μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。扩增程序为：95℃2min；95℃20s，50℃20s，72℃30s，10个循环；72℃5min。(4)以步骤(3)反应后产物为模板，引物mt-fw-1和sod-rev-1进行pcr，得到his-mt-sod片段；扩增体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。扩增程序：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。(5)his-mt-sod片段的克隆将his-mt-sod片段分别连接到载体pet15b上，转化大肠杆菌dh5a，涂布于含有100ug/mlamp的lb固体培养基平板上，37℃培养16小时，分别挑选单克隆菌落进行鉴定。鉴定为阳性克隆的dh5a经dna测序验证基因序列正确。将含有重组融合蛋白的质粒分别转化到大肠杆菌rosseta(de3)中，得到融合蛋白的表达菌株。(6)融合蛋白的表达与纯化a.融合蛋白的表达将上述融合蛋白单克隆接种到含有100ug/mlamp、34ug氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养12小时后，将培养物按照1:100比例接种到500ml含有100ug/mlamp、34ug氯霉素新鲜tb培养基中，37℃培养4h至od600达到0.8～1时，加入iptg终浓度至0.2mm，zncl2浓度至0.2mm。20℃诱导12～16h。b.菌液裂解离心收集菌体，重悬于20mmtris，300mmnacl，1mmedta，0.5nmpmsf缓冲液中，加入终浓度0.2mg/ml的t4溶菌酶，20℃温育30min，加入tween20至终浓度0.5％，混匀后，置于65℃水浴1h，加热期间搅拌数次，补加pmsf缓冲液1次，将水浴后的溶液在4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。c.ni柱纯化ni柱先用含10mm咪唑的上样缓冲液平衡5倍柱体积；将粗酶液通过0.45um滤膜过滤，过滤后的上清穿过平衡后的ni柱；含有10mm咪唑，0.1％tritonx-114缓冲液冲洗10倍柱体积；20mm咪唑冲洗5倍柱体积洗杂；300mm咪唑洗脱目的蛋白，得到his-mt-sod抗氧化融合蛋白。经检测可知，抗氧化融合蛋白的纯度可达到95％以上。(7)his标签的切除his-mt-sod融合蛋白的his-tag后面含有一段tev蛋白酶识别位点，可以通过tev蛋白酶作用除掉标签。ni柱纯化后的融合蛋白测得蛋白浓度后，按质量比50:1加入tev蛋白酶，即1μgtev蛋白酶作用于50μg目的蛋白。4℃酶切过夜。(8)超滤浓缩、换液及标签的清除酶切后的蛋白经过10kd超滤管浓缩至合适体积后，用脱盐柱g25换液到10mm咪唑上样缓冲液中，再次使用ni柱进行纯化，此时，被切割下的标签及未切除标签的蛋白吸附在ni柱上，无his标签的融合蛋白穿过柱子，收集穿过液，即为目的蛋白，得到mt-sod抗氧化融合蛋白。mt-sod抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示，具体如下：mdpncscaagdsctcagsckckeckctsckksccsccpvgcakcaqgcickgasdkcsccaggggsggggsggggsmafvqeplpfdpgalepygmsaktlefhygkhhkgyvdnlnkltqdteladksledvirttygdaakvgifnnaaqvwnhtffwnslkpggggvptgdvaarinsafgsydefkaqfknaaatqfgsgwawlvleagtlkvtktanaenplvhgqvplltidvwehayyldyqnrrpdfidnflnqlvnwdfvaknlaaa。其中，ggggsggggsggggs为连接肽。实施例3his-sod-mt融合蛋白的生产：his-sod-mt片段的扩增：(1)以合成的mt-2a全基因序列(seqqidno.1)为模板，使用以下引物进行pcr扩增，得到mt-2a片段：pcr扩增的体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。pcr反应程序如下：95℃2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min(seqidno.15)mt-fw-3:ggcggtggcggaagtggaggcggtggcagcatggatccgaactgcagctg；(seqidno.16)mt-rev-3：ggatccgttatccacttttacgcgcagcagctgcatttatc。(2)以合成的fesod全基因序列(seqidno.2)为模板，使用以下引物进行pcr扩增，得到fesod片段：pcr扩增的体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。pcr反应程序如下：95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min(seqidno.17)sod-fw-3：ctttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcatgagaatc；(seqidno.18)sod-rev-3:cctccacttccgccaccgccgctgccgccacctcccgccgctgctaagtttttc。(3)将上述两段pcr片段混合后，pcr预反应10个循环，反应条件如下：扩增体系：每20ul包括：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，mt-2a5μl，fesod5ul，sterilemiliqwater6.4μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。扩增程序为：95℃2minutes；95℃20s，50℃20s，72℃30s，10个循环；72℃5min。(4)以步骤(3)反应后产物为模板，引物mt-fw-2和sod-rev-2进行pcr，得到his-sod-mt片段；扩增体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。扩增程序：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。(5)his-sod-mt片段的克隆将his-sod-mt片段分别连接到载体pet15b上，转化大肠杆菌dh5a，涂布于含有100ug/mlamp的lb固体培养基平板上，37℃培养16小时，分别挑选单克隆菌落进行鉴定。鉴定为阳性克隆的dh5a经dna测序验证基因序列正确。将含有重组融合蛋白的质粒分别转化到大肠杆菌rosseta(de3)中，得到融合蛋白的表达菌株。(6)融合蛋白的表达与纯化a.融合蛋白的表达将上述融合蛋白单克隆接种到含有100ug/mlamp、34ug氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养12小时后，将培养物按照1:100比例接种到500ml含有100ug/mlamp、34ug氯霉素新鲜tb培养基中，37℃培养4h至od600达到0.8～1时，加入iptg终浓度至0.2mm，zncl2浓度至0.2mm。20℃诱导12～16h。b.菌液裂解离心收集菌体，重悬于20mmtris，300mmnacl，1mmedta，0.5nmpmsf缓冲液中，加入终浓度0.2mg/ml的t4溶菌酶，20℃温育30min，加入tween20至终浓度0.5％，混匀后，置于65℃水浴1h，加热期间搅拌数次，补加pmsf缓冲液1次，将水浴后的溶液在4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。c.ni柱纯化(1)ni柱先用含10mm咪唑的上样缓冲液平衡5倍柱体积。(2)将粗酶液通过0.45um滤膜过滤，过滤后的上清穿过平衡后的ni柱。(3)含有10mm咪唑，0.1％tritonx-114缓冲液冲洗10倍柱体积。(4)20mm咪唑冲洗5倍柱体积洗杂。(5)300mm咪唑洗脱目的蛋白，得到his-sod-mt抗氧化融合蛋白。经检测可知，抗氧化融合蛋白的纯度可达到95％以上。his-sod-mt抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示，具体序列如下：hhhhhhmafvqeplpfdpgalepygmsaktlefhygkhhkgyvdnlnkltqdteladksledvirttygdaakvgifnnaaqvwnhtffwnslkpggggvptgdvaarinsafgsydefkaqfknaaatqfgsgwawlvleagtlkvtktanaenplvhgqvplltidvwehayyldyqnrrpdfidnflnqlvnwdfvaknlaaaggggsggggsggggsmdpncscaagdsctcagsckckeckctsckksccsccpvgcakcaqgcickgasdkcscca。其中，hhhhhh为his标签，ggggsggggsggggs为连接肽。实施例4sod-mt融合蛋白的生产：sod-mt-his片段的扩增：(1)以合成的mt-2a全基因序列(seqqidno.1)为模板，使用以下引物进行pcr扩增，得到mt-2a片段：pcr扩增的体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。pcr反应程序如下：95℃2min；95℃，30s，57℃，20s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min(seqidno.19)mt-fw-4:ggcggtggcggaagtggaggcggtggcagcatggatccgaactgcagctg；(seqidno.20)mt-rev-4：ggatccgttatccacttttacgcgcagcagctgcatttatc。(2)以合成的fesod全基因序列(seqidno.2)为模板，使用以下引物进行pcr扩增，得到fesod片段：pcr扩增的体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。pcr反应程序如下：95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min(seqidno.21)sod-fw-4：ctttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcatatggcgtttgtgcaggaac；(seqidno.22)sod-rev-4:cctccacttccgccaccgccgctgccgccacctcccgccgctgctaagtttttc。(3)将上述两段pcr片段混合后，pcr预反应10个循环，反应条件如下：扩增体系：每20ul包括：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，mt-2a5μl，fesod5ul，sterilemiliqwater6.4μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。扩增程序为：95℃2min；95℃20s，50℃20s，72℃30s，10个循环；72℃5min。(4)以步骤(3)反应后产物为模板，引物mt-fw-4和sod-rev-4进行pcr，得到his-mt-sod片段；扩增体系：pfuultraiifusionbuffer2μl，dntp(10mmeach)0.4μl，fwprimer(20μm)0.4μl，revprimer(20μm)0.4μl，template0.1μl，sterilemiliqwater16.3μl，pfuultraiifusionenzyme0.4μl。扩增程序：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。(5)sod-mt-his片段的克隆将sod-mt-his片段分别连接到载体pet15b上，转化大肠杆菌dh5a，涂布于含有100ug/mlamp的lb固体培养基平板上，37℃培养16小时，分别挑选单克隆菌落进行鉴定。鉴定为阳性克隆的dh5a经dna测序验证基因序列正确。将含有重组融合蛋白的质粒分别转化到大肠杆菌rosseta(de3)中，得到融合蛋白的表达菌株。(6)融合蛋白的表达与纯化a.融合蛋白的表达将上述融合蛋白单克隆接种到含有100ug/mlamp、34ug氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养12小时后，将培养物按照1:100比例接种到500ml含有100ug/mlamp、34ug氯霉素新鲜tb培养基中，37℃培养4h至od600达到0.8～1时，加入iptg终浓度至0.2mm，zncl2浓度至0.2mm。20℃诱导12～16h。b.菌液裂解离心收集菌体，重悬于20mmtris，300mmnacl，1mmedta，0.5nmpmsf缓冲液中，加入终浓度0.2mg/ml的t4溶菌酶，20℃温育30min，加入tween20至终浓度0.5％，混匀后，置于65℃水浴1h，加热期间搅拌数次，补加pmsf缓冲液1次，将水浴后的溶液在4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。c.ni柱纯化ni柱先用含10mm咪唑的上样缓冲液平衡5倍柱体积；将粗酶液通过0.45um滤膜过滤，过滤后的上清穿过平衡后的ni柱；含有10mm咪唑，0.1％tritonx-114缓冲液冲洗10倍柱体积；20mm咪唑冲洗5倍柱体积洗杂；300mm咪唑洗脱目的蛋白，得到sod-mt-his抗氧化融合蛋白。经检测可知，抗氧化融合蛋白的纯度可达到95％以上。(7)his标签的切除sod-mt-his融合蛋白的his-tag后面含有一段tev蛋白酶识别位点，可以通过tev蛋白酶作用除掉标签。ni柱纯化后的融合蛋白测得蛋白浓度后，按质量比50:1加入tev蛋白酶，即1μgtev蛋白酶作用于50μg目的蛋白。4℃酶切过夜。(8)超滤浓缩、换液及标签的清除酶切后的蛋白经过10kd超滤管浓缩至合适体积后，用脱盐柱g25换液到10mm咪唑上样缓冲液中，再次使用ni柱进行纯化，此时，被切割下的标签及未切除标签的蛋白吸附在ni柱上，无his标签的融合蛋白穿过柱子，收集穿过液，即为目的蛋白，得到sod-mt抗氧化融合蛋白。sod-mt抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示，具体如下：mafvqeplpfdpgalepygmsaktlefhygkhhkgyvdnlnkltqdteladksledvirttygdaakvgifnnaaqvwnhtffwnslkpggggvptgdvaarinsafgsydefkaqfknaaatqfgsgwawlvleagtlkvtktanaenplvhgqvplltidvwehayyldyqnrrpdfidnflnqlvnwdfvaknlaaaggggsggggsggggsmdpncscaagdsctcagsckckeckctsckksccsccpvgcakcaqgcickgasdkcscca。其中ggggsggggsggggs为连接肽。实施例5将本发明实施例1～2得到的抗氧化融合蛋白和采用常规方法(菌不经过加热，采用超声或者高压进行破碎)得到的抗氧化蛋白进行测酶活，以sod蛋白为对照。结果见表1。表1酶活结果常规方法纯化u/mg工业化纯化u/mgsod3634mt-sod4645mt-sod-his4646从表1中可以得出，采用本发明的生产方法生产的抗氧化融合蛋白与采用常规方法得到的抗氧化活性蛋白的酶活差异不大，与对照相比，差异显著。对比例1在b.菌液裂解中，离心收集菌体，重悬于20mmtris，300mmnacl，1mmedta，0.5nmpmsf缓冲液中，加入终浓度0.2mg/ml的t4溶菌酶，20℃温育30min，加入tween20至终浓度0.5％，混匀后，置于70、90℃水浴20min、30min、40min、1h、3h和4h，加热期间搅拌数次，补加pmsf缓冲液1次，将水浴后的溶液在4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。其余条件与实施例2中的条件相同，检测蛋白的酶活。以sod蛋白为对照，结果见表2和图1。表2酶活结果从表2和图1中可以得出，70℃时蛋白保留大部分活性，并且可以使大部分细菌裂解，但是使用的温度较高；90℃时。蛋白的活性丧失太多。因此本发明根据实验经验，将水浴温度设置为65℃，既可以刺激菌体裂解，还使其它蛋白变性。由以上实施例和对比例可以得出，采用本发明提供的方法既可以裂解大部分菌体，又能够保证抗氧化融合蛋白的活性，还能够使得其它蛋白变性，适合大规模生产。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>许昌佰柯蛋白与基因工程研究院有限公司<120>一种抗氧化融合蛋白的生产方法<160>22<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>183<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atggatccgaactgcagctgcgcggcgggcgatagctgcacctgcgcgggcagctgcaaa60tgcaaagaatgcaaatgcaccagctgcaagaaaagctgctgcagctgctgcccggtgggc120tgcgcgaaatgcgcgcagggctgcatttgcaaaggcgcgagcgataaatgcagctgctgc180gcg183<210>2<211>600<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atggcgtttgtgcaggaacctctgccttttgatccgggagcgctggaaccgtatggcatg60agcgcgaaaaccctggaatttcactatggcaaacatcataaaggctatgtggataatctg120aataaactgacccaggataccgaactggcggataaaagcctggaagatgtgattcgtacc180acctatggggacgctgccaaggtgggcattttcaataatgcggcgcaggtgtggaatcat240acctttttttggaatagcctgaaaccgggaggtggcggcgtgccgaccggggatgtggcc300gctcgtataaacagcgcgtttgggagctatgacgaattcaaggcgcagtttaagaatgcc360gcagccacccagtttggctctggctgggcgtggctggtgctggaagcgggcaccctgaag420gtgaccaaaaccgcgaacgcggagaatccgcttgttcatggccaagtgccactgctgacc480attgatgtgtgggaacatgcgtattatctggattatcagaatcgtcgtccggatttcata540gacaattttctgaatcagctggtgaattgggattttgtggcgaaaaacttagcagcggcg600<210>3<211>282<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metaspproasncyssercysalaalaglyaspsercysthrcysala151015glysercyslyscyslysglucyslyscysthrsercyslyslysser202530cyscyssercyscysprovalglycysalalyscysalaglnglycys354045ilecyslysglyalaserasplyscyssercyscysalaglyglygly505560glyserglyglyglyglyserglyglyglyglysermetalapheval65707580glngluproleupropheaspproglyalaleugluprotyrglymet859095seralalysthrleugluphehistyrglylyshishislysglytyr100105110valaspasnleuasnlysleuthrglnaspthrgluleualaasplys115120125serleugluaspvalileargthrthrtyrglyaspalaalalysval130135140glyilepheasnasnalaalaglnvaltrpasnhisthrphephetrp145150155160asnserleulysproglyglyglyglyvalprothrglyaspvalala165170175alaargileasnseralapheglysertyraspgluphelysalagln180185190phelysasnalaalaalathrglnpheglyserglytrpalatrpleu195200205valleuglualaglythrleulysvalthrlysthralaasnalaglu210215220asnproleuvalhisglyglnvalproleuleuthrileaspvaltrp225230235240gluhisalatyrtyrleuasptyrglnasnargargproasppheile245250255aspasnpheleuasnglnleuvalasntrpaspphevalalalysasn260265270leualaalaalahishishishishishis275280<210>4<211>276<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4metaspproasncyssercysalaalaglyaspsercysthrcysala151015glysercyslyscyslysglucyslyscysthrsercyslyslysser202530cyscyssercyscysprovalglycysalalyscysalaglnglycys354045ilecyslysglyalaserasplyscyssercyscysalaglyglygly505560glyserglyglyglyglyserglyglyglyglysermetalapheval65707580glngluproleupropheaspproglyalaleugluprotyrglymet859095seralalysthrleugluphehistyrglylyshishislysglytyr100105110valaspasnleuasnlysleuthrglnaspthrgluleualaasplys115120125serleugluaspvalileargthrthrtyrglyaspalaalalysval130135140glyilepheasnasnalaalaglnvaltrpasnhisthrphephetrp145150155160asnserleulysproglyglyglyglyvalprothrglyaspvalala165170175alaargileasnseralapheglysertyraspgluphelysalagln180185190phelysasnalaalaalathrglnpheglyserglytrpalatrpleu195200205valleuglualaglythrleulysvalthrlysthralaasnalaglu210215220asnproleuvalhisglyglnvalproleuleuthrileaspvaltrp225230235240gluhisalatyrtyrleuasptyrglnasnargargproasppheile245250255aspasnpheleuasnglnleuvalasntrpaspphevalalalysasn260265270leualaalaala275<210>5<211>282<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5hishishishishishismetalaphevalglngluproleuprophe151015aspproglyalaleugluprotyrglymetseralalysthrleuglu202530phehistyrglylyshishislysglytyrvalaspasnleuasnlys354045leuthrglnaspthrgluleualaasplysserleugluaspvalile505560argthrthrtyrglyaspalaalalysvalglyilepheasnasnala65707580alaglnvaltrpasnhisthrphephetrpasnserleulysprogly859095glyglyglyvalprothrglyaspvalalaalaargileasnserala100105110pheglysertyraspgluphelysalaglnphelysasnalaalaala115120125thrglnpheglyserglytrpalatrpleuvalleuglualaglythr130135140leulysvalthrlysthralaasnalagluasnproleuvalhisgly145150155160glnvalproleuleuthrileaspvaltrpgluhisalatyrtyrleu165170175asptyrglnasnargargproasppheileaspasnpheleuasngln180185190leuvalasntrpaspphevalalalysasnleualaalaalaglygly195200205glyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysermetasppro210215220asncyssercysalaalaglyaspsercysthrcysalaglysercys225230235240lyscyslysglucyslyscysthrsercyslyslyssercyscysser245250255cyscysprovalglycysalalyscysalaglnglycysilecyslys260265270glyalaserasplyscyssercyscysala275280<210>6<211>276<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6metalaphevalglngluproleupropheaspproglyalaleuglu151015protyrglymetseralalysthrleugluphehistyrglylyshis202530hislysglytyrvalaspasnleuasnlysleuthrglnaspthrglu354045leualaasplysserleugluaspvalileargthrthrtyrglyasp505560alaalalysvalglyilepheasnasnalaalaglnvaltrpasnhis65707580thrphephetrpasnserleulysproglyglyglyglyvalprothr859095glyaspvalalaalaargileasnseralapheglysertyraspglu100105110phelysalaglnphelysasnalaalaalathrglnpheglysergly115120125trpalatrpleuvalleuglualaglythrleulysvalthrlysthr130135140alaasnalagluasnproleuvalhisglyglnvalproleuleuthr145150155160ileaspvaltrpgluhisalatyrtyrleuasptyrglnasnargarg165170175proasppheileaspasnpheleuasnglnleuvalasntrpaspphe180185190valalalysasnleualaalaalaglyglyglyglyserglyglygly195200205glyserglyglyglyglysermetaspproasncyssercysalaala210215220glyaspsercysthrcysalaglysercyslyscyslysglucyslys225230235240cysthrsercyslyslyssercyscyssercyscysprovalglycys245250255alalyscysalaglnglycysilecyslysglyalaserasplyscys260265270sercyscysala275<210>7<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctttaagaaggagatatacatatggatccgaactgcagctg41<210>8<211>56<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cctccacttccgccaccgccgctgccgccacctcccgcgcagcagctgcatttatc56<210>9<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ggcggtggcggaagtggaggcggtggcagcatggcgtttgtgcaggaac49<210>10<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ggatccgttatccacttttaatgatgatgatgatggtgcgccgctgctaagtttttc57<210>11<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ctttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcatgagaatc49<210>12<211>56<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cctccacttccgccaccgccgctgccgccacctcccgcgcagcagctgcatttatc56<210>13<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggcggtggcggaagtggaggcggtggcagcatggcgtttgtgcaggaac49<210>14<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ggatccgttatccacttttacgccgctgctaagtttttc39<210>15<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ggcggtggcggaagtggaggcggtggcagcatggatccgaactgcagctg50<210>16<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ggatccgttatccacttttacgcgcagcagctgcatttatc41<210>17<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17ctttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcatgagaatc49<210>18<211>54<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18cctccacttccgccaccgccgctgccgccacctcccgccgctgctaagtttttc54<210>19<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19ggcggtggcggaagtggaggcggtggcagcatggatccgaactgcagctg50<210>20<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ggatccgttatccacttttacgcgcagcagctgcatttatc41<210>21<211>61<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21ctttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcatatggcgtttgtgcaggaa60c61<210>22<211>54<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22cctccacttccgccaccgccgctgccgccacctcccgccgctgctaagtttttc54当前第1页12