鸡SIRT1重组蛋白基因、重组蛋白及其制备方法与应用与流程

本发明涉及基因工程领域中重组基因的原核表达和纯化方法，特别涉及一种鸡sirt1重组蛋白基因、重组蛋白及其制备方法与应用。

技术背景

sirt1作为依赖nad⁺的去乙酰化酶，可以使组蛋白和非组蛋白去乙酰化，能从蛋白质组参与蛋白的结构和功能的调节，从而改变细胞和机体的染色质结构、影响基因的表达调控和细胞代谢过程，生物学功能涉及细胞的生长周期、凋亡、代谢状态和炎症及应激反应。sirt1的功能活性连接了成细胞、机体的能量代谢和基因转录。当机体摄入过多的能量物质时，肝脏能将这些过量的能量物质转化为脂肪，并转运到脂肪组织贮存起来。长期摄入过多的能量最终会导致肥胖、脂肪肝和其他肥胖相关的代谢性疾病。目前sirt1被认为是一个治疗肥胖及相关疾病的一个重要靶点。在家禽生产中，脂肪沉积过影响动物的健康、生殖繁育、瘦肉产出率，影响饲料利用率和产蛋率下降等问题，同时脂肪成分主要来自自身肝脏的重新合成。因此，研究肝脏的脂肪代谢及其调控机制对于控制家禽的脂肪沉积极为重要。本发明利用基因工程在大肠杆菌体系中表达鸡重组蛋白sirt1，可以深入解析其分子结构和为抗体制备准备重组的抗原，为进一步研究sirt1在家禽脂类代谢中的作用提供重要的物质保证。

技术实现要素：

发明目的：本发明提供了一种鸡sirt1重组蛋白的dna分子序列；以及含有该dna分子序列的重组表达载体和转基因重组大肠杆菌。本发明还提供了一种鸡sirt1重组蛋白及其制备方法与应用。

技术方案：本发明公开的鸡sirt1重组蛋白基因，碱基序列如seqidno:1所示。

本发明还公开了含有上述鸡sirt1重组蛋白基因的重组表达载体。

本发明还公开了含有上述鸡sirt1重组蛋白基因的转基因重组大肠杆菌菌株。

上述重组表达载体通过将所述基因插入到大肠杆菌表达载体为pcoldiii中得到的表达鸡sirt1重组蛋白的dna的重组表达载体；再将所述重组表达载体转化大肠杆菌bl21中，筛选得到转基因重组大肠杆菌菌株。

上述鸡sirt1重组蛋白基因在制备鸡sirt1重组蛋白中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明所述的一种鸡sirt1重组蛋白，氨基酸序列如seqidno:2所示。

进一步的，所述鸡sirt1重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)根据鸡sirt1基因编码的氨基酸多肽序列，以减少其在大肠杆菌中的稀有密码子和减少二级结构为原则，优化得到鸡sirt1基因的cdna片段；

(2)以(1)中合成的基因片段插入大肠杆菌表达载pcoldiii，并在c端添加6个his标签，构建得到pcoldiii-gsirt1-hc重组表达载体；

(3)重组表达载体pcoldiii-gsirt1-hc转化大肠杆菌bl21，并通过amp筛选得到转基因重组大肠杆菌菌株bl21-pcoldiii-gsirt1-hc；

(4)鸡sirt1重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定。

本发明还公开了上述鸡sirt1重组蛋白在鸡畜牧生产方面的应用。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明所提供的鸡sirt1的基因dna序列能在大肠杆菌中进行可溶性重组蛋白的表达，重组蛋白的制备方法操作简便、表达量高、成本低廉，通过本发明所提供的方法，通过sirt1基因片段的优化实现、提高了其在大肠杆菌中的表达，并实现了可溶性重组蛋白的表达，通过玻璃珠研磨法和镍柱亲和一步纯化法，可得到高纯度的鸡sirt1重组蛋白。

附图说明

图1为pcoldiii-gsirt1-hc重组载体酶切检验琼脂糖电泳分析图，m为dl5000；1为ndei、xhoi双酶切的pcoldiii-gsirt1-hc重组载体；

图2为bl21-pcoldiii-gsirt1-hc重组菌的检验琼脂糖电泳分析图，m为dl2000；1为阴性对照；2-5为以不同转化子的菌液pcr产物；

图3为sirt1重组蛋白低温诱导结果的sds-page电泳分析图；

图4为iptg诱导重组蛋白的总菌蛋白的westernblot鉴定结果；

图5为超声法破碎菌体获得的sirt1重组蛋白的镍柱亲和层析结果的sds-page电泳分析图；

图6为玻璃珠研磨获得的sirt1重组蛋白的镍柱亲和层析结果的sds-page电泳分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

实施例1：构建鸡sirt1重组蛋白的重组大肠杆菌菌株及蛋白纯化方法

1.鸡sirt1基因的的表达序列的优化和合成

根据genbank数据库提供的的鸡sirt1基因(ab160952.1)的cdna和蛋白序列，进行密码子分析，发现了天然鸡sirt1基因的cds序列区存在87个大肠杆菌稀有密码子(表1)，以鸡sirt1蛋白的多肽氨基酸序列，利用同义密码子替换中87个稀有密码子合成sirt1基因的编码序列，并对基因片段结构进行优化，得到seqidno:1所示的核苷酸序列，并在5′和3′分别添加ndei和xhoi酶切位点序列，克隆入由本实验室改建的pcoldiii质粒，改建方法是：在该质粒的多克隆位点的3′端插入了“ctcgagcaccaccaccaccaccactga”序列，为重组蛋白在克隆插入时连上6个his，获得重组质粒pcoldiii-gsirt1-hc。

表1鸡sirt基因的密码子分析结果

*在大肠杆菌中的稀有密码子

pcoldiii-gsirt1-hc重组载体酶切检验琼脂糖电泳分析图如图1所示，经双酶切后产生一条2300bp左右的合成sirt1-hc条带和一条5000bp左右的质粒条带，表明合成鸡sirt1基因片段已成功插入表达载体。

2.鸡sirt1基因重组表达菌bl21-pcoldiii-gsirt1-hc的构建

首先利用ndei和xhoi酶鉴定重组质粒pcoldiii-gsirt1-hc进行酶切鉴定，并测序鉴定pcoldiii-gsirt1-hc构建正确，利用cacl2法将重组质粒转化入bl21大肠杆菌中，50μg/mld的amp抗性筛选。挑取阳性菌落，37℃培养4h后，收集50μl的菌液，100℃加热15min，12,000rpm离心3min，以此裂解菌液为模板,用pcr法进行鉴定，引物见表2，包括seqidno:3gga-sirt1-hc-102f和seqidno:4gga-sirt1-hc-678r，反应体系如下：

表2pcr引物序列

反应条件：

95℃预变性3min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。

1％琼脂糖电泳检测pcr检测结果，如图2所示，提取转化子的菌液pcr能得到与设计检测扩增片段大小一致的条带，说明pcoldiii-gsirt1-hc重组质粒成功转入bl21大肠杆菌)。

3.鸡sirt1重组蛋白的诱导

挑取pcr检测阳性菌接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃、225rpm振荡培养12h，以1:50的比例将培养菌液接种至3ml新鲜的lb培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中，37℃、225rpm振荡培养至od600约为0.4左右，置冰水中作用15min后，添加不同终浓度的iptg，在15℃、150rpm振荡培养24h，取100μl培养液，12,000rpm离心3min，弃上清，收集菌体，加入100μl1×sds上样缓冲液，100℃加热15min，12,000rpm离心3min，取上清，以10％的sds-page聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定，结果如图3所示；并用免疫印迹鉴定表达的重组蛋白，结果如图4所示；采用电转移法将sds-page分离得的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜(pvdf)，用含5％脱脂奶粉的tbst缓冲液将pvdf膜封闭过夜后，用tbst漂洗3次(每次10min)，然后在4℃条件下分别用兔抗6×his多抗(d110002，生工生物工程(上海)股份有限公，tbst以1：3000稀释)和山羊抗sirt1多抗(sc-19857，圣克鲁斯生物技术有限公司；tbst以1：250稀释)孵育过夜；再次用tbst漂洗pvdf膜后，分别用辣根过氧化物酶标记的驴抗兔和驴抗山羊的igg(d110056和d110115，生工生物工程(上海)股份有限公司；用tbst按1：20000稀释)在室温条件下孵育pvdf膜2h；tbst充分洗涤pvdf膜后，用等体积混合的beyoeclplusa液和b液混合液处理pvdf膜进行曝光。

根据图3可见，bl21-pcoldiii-gsirt1-hc重组菌在15℃、在iptg不同浓度诱导24h后，对菌体总蛋白进行检测，(m为premixedproteinmarker；1～9：iptg的浓度依次为0、0.05、0.2、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2mmol/l诱导的总菌体裂解产物。结果说明在不同浓度的iptg的作用下，重组均能产生一条分子量约在116kda的新的蛋白条带。

图4中a图是一抗为兔抗6×his多肽抗体的检测结果；b图是羊抗人sirt1多抗的检测结果。control：0mmol/l的iptg培养的总菌体；1～2：分别是0.1、1.0mmol/l的iptg诱导的总菌体。在这两种一抗的免疫印记中都在约116kda的位置得到检测条带，说明iptg诱导产生的新的蛋白条带就是所要诱导表达的鸡的sirt1重组蛋白。

4.鸡sirt1重组蛋白的纯化

按上述方法，进行重组蛋白的扩大培养，4℃，3,000g离心10min，收集菌体沉淀。按2克湿重菌体加入40ml裂解缓冲液(50mmol/l磷酸缓冲液，0.5mol/lnacl，60mmol/l咪唑，2mg/ml溶菌酶，1mmol/lpmsf，1mmol/lmgcl2，0.5％tween-20，ph7.4)的比例充分悬浮离心收集的菌体，混匀后在4℃反复震荡45min。分别采用下述2种方法从细菌内粗提可溶性重组蛋白后，用镍柱亲和层析法分别纯化重组蛋白。

(1)超声法破碎菌体提取可溶性重组蛋白

在冰水浴中，采用超声波法对上述裂解液(20ml)进行进一步破碎，在550w功率下，超声工作时间2sec，工作间隔4sec，共10min，然后在冰水浴中静置10min后重复上述超声一次。4℃、15000rpm离心45min；收集上清，并用0.45μm滤膜过滤，收集上清。

超声法破碎菌体获得的sirt1重组蛋白的镍柱亲和层析结果的sds-page电泳分析图如图5所示。重组蛋白进行可溶性诱导，超声法破菌获得可溶性重组蛋白，利用镍离子和6个his的螯合作用进行重组蛋白的一步纯化。m为premixedproteinmarker；1为0.1mmol/liptg诱导菌体的超声法裂解上清；2为穿柱液；3、4为含50mmol/l咪唑的洗涤液；5、含100mmol/l咪唑洗脱液；6为含150mmol/l咪唑洗脱液7、含200mmol/l咪唑洗脱液；8为含250mm咪唑洗脱液；8为含300mm咪唑洗脱液。结果表明，洗涤液咪唑为50mmol/l时可洗掉部分杂蛋白，提高咪唑浓度从100mmol/l至300mmol/l能有效的将目的蛋白洗脱下来，重组蛋白的纯度达到了80％以上，但是还是含有较多的杂带。

(2)玻璃珠研磨法破碎菌体提取可溶性重组蛋白

取10ml裂解液(同(1))，加入等体积的0.1mm的玻璃珠，冰水浴10min后，用磨球仪振荡5min(振幅30次/sec)，置冰水浴中静置10min，重复一次振荡研磨。4℃、15000rpm离心45min；收集上清，并用0.45μm滤膜过滤，收集上清。

图6为玻璃珠研磨获得的sirt1重组蛋白的镍柱亲和层析结果的sds-page电泳分析图。重组蛋白进行可溶性诱导，用0.1mm的玻璃珠研磨破菌获得可溶性重组蛋白，利用镍离子和6个his的螯合作用进行重组蛋白的一步优化纯化。m为premixedproteinmarker；1为0.1mmol/liptg诱导菌体的玻璃珠研磨法裂解上清；2为穿柱液；3为含50mmol/l咪唑的洗涤液；4为含100mmol/l咪唑洗脱液；5为含200mmol/l咪唑洗脱液；6为含300mmol/l咪唑洗脱液。结果表明，利用玻璃珠研磨法结合ni离子亲和层析法可以获得90％以上的重组蛋白。

序列表

<110>常熟理工学院

<120>鸡sirt1重组蛋白基因、重组蛋白及其制备方法与应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2295

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metalaaspglyglualaproleuleuargproargaspglyglypro

151015

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202530

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354045

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<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ttctgaagacggcgtttg18

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ttctggtggtggaatggtt19