一种检测H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒的方法与流程

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种同时快速检测和区分h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒的方法。

背景技术：

禽流感病毒根据对家禽致病性的不同，可以分为高致病性和低致病性禽流感病毒。其中，高致病性禽流感病毒包括h5和h7亚型的部分毒株。h9亚型禽流感病毒属于低致病性毒株。

但是，在养殖过程中发现，疫苗免疫加快了病毒变异，使得疫苗必须加快更新换代。随着病毒的进化，h5亚型禽流感病毒一直在发生较快的变异；从最初的n28、re-1到re-4、re-5，再到re-6、re-8，到最新的re-11、re-12。病毒变异是由于其血凝素基因(ha)中核苷酸的变异引起的。目前，全球h5亚型禽流感病毒共存在10个分支。我国存在或流行的分支包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支和第7分支共4个分支，均为高致病性病毒。我国现在流行的毒株与1996年最初分离的病毒a/goose/guangdong/1/1996(h5n1)的ha核苷酸同源性仅为90.6％(re-11)和91.2％(re-12)。以re-11和re-12疫苗株为代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支ha核苷酸同源性仅为88.5％。ha核苷酸的快速变异增加了以核苷酸为靶基因的检测方法的难度，导致以ha基因为靶基因的检测方法的特异性、敏感性下降，造成假阴性的结果。

h7n9病毒突变为高致病性毒株之后，对家禽业造成巨大的经济损失。其感染发病症状与h5亚型高致病性禽流感病毒极为相似，临床上难以区分。h9亚型禽流感病毒虽然属于低致病性毒株，单独感染不直接致死家禽，但跟其他病原混和感染，能增加感染家禽的死亡率。因此，检测和区分h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒对于疾病的诊断与防治具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供一种同时检测和区分h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒的快速检测方法，通过分析近年来分离到的h5亚型高致病性禽流感病毒、h7n9亚型高致病性禽流感病毒、h9亚型禽流感病毒ha基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒实时荧光定量rt-pcr核酸快速检测方法。

本发明首先提供一种用于检测h5亚型高致病性禽流感病毒的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为atggaaaaraacgtyactgt(seqidno：1)，

下游引物序列为agccatccwgcyacactrcaat(seqidno：2)；

探针序列为aagacatactggaraagacacayaayggga(seqidno：3)，

其中探针的5'端标记fam，3'端标记bhq1；

其次，本发明提供一种用于h7n9亚型高致病性禽流感病毒检测的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为agtctkctgctkgcwacaggratg(seqidno：4)，

下游引物序列为cttcccatccattttcaatgaaac(seqidno：5)；

探针序列如下：

cggamtrmdaccaaagrgaaaacggamtrmdagaggcct(seqidno：6)，

其中探针的5'端标记cy5，3'端标记bhq2；

再次，本发明提供一种用于h9亚型禽流感病毒检测的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为aacytacaaaatcctca(seqidno：7)，

下游引物序列为aatgttgcayctgcaaga(seqidno：8)；

探针序列如下：gcaatggggttygctgccttyttrttctgg(seqidno：9)，

其中探针的5'端标记hex，3'端标记bhq1；

本发明的引物组和探针用于制备使用实时荧光定量rt-pcr方法检测h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒的试剂盒；

本发明再一个方面提供一种检测h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒的方法，包括如下的步骤：

1)配置反应体系：

在聚和酶链式反应管中依次加入含dntps、mg²⁺的2×qrt-pcr反应缓冲液25μl、浓度为10μmol/l上游引物2.0μl、浓度为10μmol/l的下游引物2.0μl、浓度为10μmol/l的探针1.5μl、酶混和物2.5μl、需要检测的病毒核酸样品6.0μl；

2)反应步骤：

将步骤1)配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量pcr仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；

3)结果检测：

如果fam通道出现s型荧光曲线且ct值≤38，则判断为h5亚型高致病性禽流感病毒阳性；

如果cy5通道出现s型荧光曲线且ct值≤38，则判断为h7n9亚型高致病性禽流感病毒阳性。

如果hex通道出现s型荧光曲线且ct值≤38，则判断为h9亚型禽流感病毒阳性。

本发明所提供的h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒实时荧光rt-pcr方法具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节(易造成环境污染)，只需一台荧光pcr仪即可在一个密闭反应管中完成三种亚型禽流感病毒的检测，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。而作为禽流感诊断金标准的病毒分离方法，则需要更多的设备、更长的时间、更高的硬件要求(高致病性禽流感病毒需要在生物安全三级实验室完成)。

附图说明

图1:h5亚型禽流感病毒ha序列比对图，

图2:h7n9亚型禽流感病毒ha序列比对图，

图3:h9亚型禽流感病毒ha序列比对图，

图4:三重实时荧光定量rt-pcr方法引物探针的验证，

图5:本发明建立的实时荧光定量rt-pcr方法敏感性试验图。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明进行详细的描述。

实施例1：保守序列区域的确定及引物探针的筛选

申请人通过分子生物学方法研究了h5亚型流感病毒的不同na亚型、不同分支的ha核苷酸序列(表1)，与申请人所在实验室分离保存的h5毒株ha序列进行比对，确定其保守区域(图1)。序列比对发现，h5亚型流感病毒的ha序列在nt106–nt174区域，该区域的序列如下：

atggaaaaraacgtyactgtwacrcatgcymaagacatactggaraagacacayaaygggargctytg；

nt210–nt242区域，序列为

attgyagtgtrgcwggatggcthctyggraaycc的保守度较高；其中，r＝a或g，y＝c或t，m＝或c，w＝a或t。

表1：本发明中引物和探针设计使用到的h5病毒株信息表

按照荧光定量rt-pcr引物探针设计原则，在不同保守区域设计多对引物和探针，进行筛选，根据检出的灵敏度最终确定了用于h5亚型禽流感病毒检测的最优引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为atggaaaaraacgtyactgt(seqidno：1)，

下游引物序列为agccatccwgcyacactrcaat(seqidno：2)；

探针序列为aagacatactggaraagacacayaayggga(seqidno：3)，其中探针的5'端标记fam，3'端标记bhq1；

申请人通过分子生物学方法研究了h7n9亚型禽流感病毒强毒和弱毒的ha核苷酸序列(表1)，与申请人所在实验室分离保存的h7n9毒株ha序列进行比对，确定其保守区域(图2)。序列比对发现，h7n9亚型禽流感病毒强弱毒的ha序列在nt907–nt956区域，该区域的序列如下：

tttcagaacatwgayagcagrrcarttggaaaatgyccragatakgttaa；

nt964–nt995区域，序列为

agtctkctgctkgcwacaggratgaagaatgt；

nt1028–nt1076区域，序列为

gaggcctrtttggtgctatagcdggtttcattgaaaatggatgggaagg的保守度较高；其中，r＝a或g，y＝c或t，m＝a或c，w＝a或t，k＝g或t。

比对h7n9亚型禽流感病毒高致病性毒株与低致病性毒株的ha序列，显示高致病性毒株主要是在nt1016–nt1027区域插入了12个碱基，序列为aacggamtrmda；其中，r＝a或g，m＝a或c，d＝g，a或t。

表2：本发明中引物和探针设计使用到的h7n9病毒株信息表

按照荧光定量rt-pcr引物探针设计原则，在不同保守区域设计多对引物和探针，进行筛选，根据检出的灵敏度最终确定了用于h7n9亚型高致病性禽流感病毒检测的最优引物组和探针，其序列信息如下：

其中h7上游引物序列为agtctkctgctkgcwacaggratg(seqidno：4)，

h7下游引物序列为cttcccatccattttcaatgaaac(seqidno：5)；

探针序列为

cggamtrmdaccaaagrgaaaacggamtrmdagaggcct(seqidno：6)，其中探针的5'端标记cy5，3'端标记bhq2；

申请人通过分子生物学方法研究了h9亚型流感病毒的ha核苷酸序列(表3)，与申请人所在实验室分离保存的h9毒株ha序列进行比对，确定其保守区域(图3)。序列比对发现，h9亚型流感病毒的ha序列在nt120–nt147区域，该区域的序列如下：

cctgtgacacatgyaaagaa；

nt157–nt185区域，序列为aatggratgctrtgtgcaac；

nt1249–nt1292区域，序列为

atgatcaayrataarrttgatgaycaaatycargayatatgggc；

nt1541–nt1681区域，序列为

tcaarctggratctgarrraacytacaaaatcctcaymatttattcgactgyygcctcatcycttgydattgcaatggggttygctgccttyttrttctgggccakgtmymyygsrtcttgcagrtgcaacattwgtatat的保守度较高；其中，r＝a或g，y＝c或t，m＝或c，w＝a或t，s＝g或c，d＝g，a或t。

表3：本发明中引物和探针设计使用到的h9病毒株信息表

按照荧光定量rt-pcr引物探针设计原则，在不同保守区域设计多对引物和探针，进行筛选，根据检出的灵敏度最终确定了用于h9亚型禽流感病毒检测的最优引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为aacytacaaaatcctca(seqidno.7)，

下游引物序列为aatgttgcayctgcaaga(seqidno.8)；

探针序列为gcaatggggttygctgccttyttrttctgg(seqidno.9)，其中探针的5'端标记hex，3'端标记bhq1。

为验证上述设计的实时荧光rt-pcr引物探针，将三对引物探针配置于一个反应管中，选取实验室保存的h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒进行荧光rt-pcr检测，结果在三重实时荧光rt-pcr方法中，各自的引物探针仅能特异性地检测相对应的病毒，没有产生交叉扩增(图4)。

实施例2：建立检测方法

确立了检测反应体系和反应条件，在聚和酶链式反应管中依次加入2×rt-pcr反应缓冲液25μl(含dntps、mg²⁺)、第一步所和成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/l)、第一步所和成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/l)、第一步所和成的探针1.5μl(浓度为10μmol/l)、酶混和物(反转录酶、rna酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸6.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；然后将反应体系密闭，置于荧光定量pcr仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。如果出现s型荧光曲线且ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。

用实时荧光定量rt-pcr技术，对h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤：

第一步(和成引物)：按照本发明指定的核酸序列(即序列表中seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9)，人工和成扩增反应所需要的上下游引物和探针；

第二步(配置反应体系)：在聚和酶链式反应管中依次加入2×qrt-pcr反应缓冲液25μl(含dntps、mg²⁺)、第一步所和成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/l)、第一步所和成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/l)、第一步所和成的探针1.5μl(浓度为10μmol/l)、酶混和物(反转录酶、rna酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸6.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；

第三步(反应)：将第二步配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量pcr仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。

第四步(结果检测)：如果fam通道出现s型荧光曲线且ct值≤38，则判断为h5亚型高致病性禽流感病毒阳性；如果cy5通道出现s型荧光曲线且ct值≤38，则判断为h7n9亚型高致病性禽流感病毒阳性；如果hex通道出现s型荧光曲线且ct值≤38，则判断为h9亚型禽流感病毒阳性。

实施例3：引物和探针的效果检测

1、采用上述筛选建立的引物探针和方法对h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒进行了敏感性测试，包括如下步骤：

第一步：提取病毒rna，用微量核酸分析仪测定病毒rna含量。将rna作10倍比稀释，取6.0μl稀释后的rna模板，加入到44.0μlqrt-pcr预混液中；

第二步：采用建立的实时荧光定量rt-pcr方法进行检测，确定其灵敏度；

结果表明，本发明建立的实时荧光定量rt-pcr方法，可以检测到0.1fg的h5病毒rna模板，可以检测到0.004fgh7n9强毒rna模板，可以检测到0.01fgh9病毒rna模板(图5)。

2、对h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒实时荧光定量rt-pcr检测方法进行了特异性测试，包括如下步骤：

第一步：选取本室保存的h1-h16亚型的禽流感病毒，包括h1n1亚型、h2n2亚型、h3n2亚型、h4n4亚型、h5n1亚型、h5n2亚型、h5n3亚型、h5n6亚型、h5n8亚型、h6n8亚型、h7n9亚型、h8n6亚型、h9n2亚型、h10n8亚型、h11n2亚型、h12n2亚型、h13n1亚型、h14n4亚型、h15n1亚型、h16n1亚型。其中，h5亚型禽流感病毒，包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支、第7.2分支共4个分支的病毒株；h7n9亚型包括h7n9高致病性毒株和h7n9低致病性毒株。同时选取其他禽类病毒，包括新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒。提取rna作为模板；

第二步：采用建立的实时荧光定量rt-pcr方法进行检测，确定其特异性；

第三步：本发明建立的实时荧光定量rt-pcr方法，h5引物探针组和可以检测出第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支、第7.2分支共4个分支的h5亚型禽流感病毒，对其他亚型的禽流感病毒及其他禽类病毒均无检出；h7n9引物探针组和可以检出h7n9高致病性毒株，其他亚型的禽流感病毒(包括h7n9低致病性毒株)及其他禽类病毒均无检出；h9引物探针组和可以检测所有h9n2亚型禽流感病毒，对其他亚型的禽流感病毒及其他禽类病毒均无检出(表4)。结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

表4：本发明建立的实时荧光定量rt-pcr方法特异性试验结果表

实施例4：临床样品的应用检测。

对2014～2018年收集临床疑似h5和h7n9亚型高致病性禽流感以及h9亚型禽流感发病家禽样品100份，主要包括肺脏、肝脏、脾脏、气管、直肠等组织。取少量组织样品，剪碎后加入5～10倍体积的pbs缓冲液，进行匀浆或震荡破碎。冻融3次后，10000rpm离心5分钟，取上清备用。一部分上清直接提取rna，用上述h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒实时荧光rt-pcr核酸快速检测方法进行检测；另一部分上清接种10日龄鸡胚，进行病毒分离，比较两种方法的符和率。

结果显示：对100份临床发病组织样品进行检测，用上述h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒以及h9亚型禽流感病毒实时荧光rt-pcr核酸快速检测方法进行检测，有56份为h5病毒阳性，15份h7n9强毒阳性，18份为h9病毒阳性。病毒分离结果也显示为89份为阳性，测序结果显示rt-pcr方法与病毒分离结果一致且为对应关系，符和率100％。结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

序列表

<110>中国动物卫生与流行病学中心

<120>一种检测h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒和h9亚型禽流感病毒的方法

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