本发明属于天然化合物合成领域，具体涉及一种通过基因工程手段人工获得的葡萄糖苷酶突变体、以及酶催化合成人参皂苷rh2的方法。
背景技术：
人参历史悠久，作为一种传统名贵中药，具有优良的药用价值。人参主要活性成分为人参皂苷，包括三种类型，分别为：原人参二醇类皂苷(protopanaxadioltypeginsenoside，ppd)、原人参三醇类皂苷(protopanaxatrioltypeginsenoside，ppt)和人参皂苷ro。人参中绝大部分皂苷是rb1、rb2、rc、rd、re和rg1人参皂苷。其中稀有人参皂苷rh2在自然界含量极少。人参皂苷rh2是一种新近发现的抗肿瘤、抗转移的天然植物成分，是配合放疗、化疗增效减毒的首选药物，作为新型抗癌强身保健品深受市场欢迎。
人参皂苷的化学结构通式为：
其种类及结构特征如表1所示。
表1人参皂苷的种类及结构特征
注：glu：葡萄糖；araf：阿拉伯呋喃糖；arap：阿拉伯吡喃糖；rha：鼠李糖
现有技术中存在许多制备人参皂苷rh2的方法，如cn102352402b公开了从参根中提取含有人参自身皂苷酶和其它水溶性物质的提取物，与原人参二元醇类皂苷反应制备rh2混合皂苷。cn101565694a公开了利用三七人参皂苷酶转化三七皂苷为活性更高的rg3、ck、rh2次生皂苷和苷元。cn101385519a公开了利用一种皂苷酶活性高的谷物芽产生的酶液，与人参粉或人参总皂苷或人参皂苷rb1混合，在40-50℃搅拌反应10-24小时，产生含f2、rg3、ck、rh2等人参皂苷。还有些方法需使用全细胞进行反应，不利于酶和底物的充分接触，从而会影响转化率，造成反应选择性低，rh2产量低、纯度低；如cn1105781c专利，利用β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷得到少量的人参皂苷rh2，转化率低，造成反应选择性低，rh2产量低、纯度低。可见，现有常见的人参皂苷rh2的制备方法，存在许多缺点，如选择性低，rh2含量低不能制备高纯物，工艺粗糙，不适宜放大生产等。
技术实现要素：
为了解决上述存在的问题，本发明对野生型葡萄糖苷酶进行突变，获得酶活性大大提高、人参皂苷rh2转化率大大提高的葡萄糖苷酶突变体。
本发明的目的之一在于提供葡萄糖苷酶突变体。
本发明的另一目的在于提供葡萄糖苷酶突变体的应用。
本发明的另一目的在于提供葡萄糖苷酶突变体的人参皂苷rh2的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种酶催化合成人参皂苷rh2的方法，以人参皂苷rg3为底物，在葡萄糖苷酶的催化下，反应生成人参皂苷rh2；所述葡萄糖苷酶来源于terrabacterginsenosidimutans；催化反应的温度为25～50℃；
催化反应体系中人参皂苷rg3的浓度为1％～5％w/v，葡萄糖苷酶用量为底物人参皂苷rg3重量的0.01～0.06倍，余量为水或磷酸盐缓冲液，以及用于溶解人参皂苷rg3的助溶剂；
所述催化反应体系的ph值为6.5～9.5。
进一步的，所述葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seqidno2所示，或者为seqidno2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：
将第71和72位的谷氨酸e、缬氨酸v分别突变为苏氨酸t、谷氨酸e；
将第92位的谷氨酰胺q突变为组氨酸h；
将第109和114位的丝氨酸s、脯氨酸p分别突变为丙氨酸a、甘氨酸g；
将第135位的脯氨酸p突变为丙氨酸a；
将第168位的苯丙氨酸f突变为酪氨酸y；
将第240位的谷氨酰胺q突变为谷氨酸e；
将第344位的赖氨酸k突变为精氨酸r；
将第412和416位的谷氨酸e、天冬氨酸d分别突变为天冬氨酸d、谷氨酸e；
将第469位的酪氨酸y突变为苯丙氨酸f。
进一步的，所述人参皂苷rg3的助溶剂选自甲醇、乙醇、1％～20％v/v的dmso中的至少一种。
更进一步的，所述人参皂苷rg3的助溶剂为1％～20％v/v的dmso。
进一步的，所述催化反应的时间为4～12h。
进一步的，所述磷酸盐缓冲液为ph7.2～7.8的0.08～0.12m磷酸盐缓冲液。
进一步的，人参皂苷rg3需先溶解于助溶剂中，再缓慢加入葡萄糖苷酶中，边加入边搅拌。缓慢加入可避免溶于助溶剂中的rg3形成粘稠状的液体，从而导致搅拌子无法转动。在上述三种助溶剂中，以dmso出现此类现象的程度最低，另两种溶剂更容易出现这种现象。
进一步的，所述葡萄糖苷酶以酶粉或酶液形式加入。
进一步的，所述酶液是将菌体用磷酸缓冲液超声波破胞、离心取上清得到。
葡萄糖苷酶突变体，由seqidno2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：
将第71和72位的谷氨酸e、缬氨酸v分别突变为苏氨酸t、谷氨酸e；
将第92位的谷氨酰胺q突变为组氨酸h；
将第109和114位的丝氨酸s、脯氨酸p分别突变为丙氨酸a、甘氨酸g；
将第135位的脯氨酸p突变为丙氨酸a；
将第168位的苯丙氨酸f突变为酪氨酸y；
将第240位的谷氨酰胺q突变为谷氨酸e；
将第344位的赖氨酸k突变为精氨酸r；
将第412和416位的谷氨酸e、天冬氨酸d分别突变为天冬氨酸d、谷氨酸e；
将第469位的酪氨酸y突变为苯丙氨酸f。
进一步的，葡萄糖苷酶突变体由seqidno1所示核苷酸序列经以下至少一种突变情况所得：
将第211～216位的碱基序列gaggtg突变为acggag；
将第274～276位的碱基序列cag突变为cac；
将第325～327位和340～342位的碱基序列agc、ccg分别突变为gcc、ggt；
将第403～405位的碱基序列ccg突变为ggc；
将第502～504位的碱基序列ttc突变为tac；
将第718～720位的碱基序列caa突变为gaa；
将第1030～1032位的碱基序列cgg突变为aag；
将第1234～1236位和1246～1248位的碱基序列gag、gat分别突变为gac、gag；
将第1405～1407位的碱基序列tat突变为ttt。
上述任一项所述的葡萄糖苷酶突变体在制备人参皂苷rh2中的应用。
进一步的，上述应用中以人参皂苷rg3为底物。
本发明的有益效果是：
(1)本发明来源于terrabacterginsenosidimutans的葡萄糖苷酶及其突变体酶活对底物rg3转化成rh2的转化率达95.89％以上，转化率大大提高，反应选择性高，副产物少，rh2含量高，可用于制备高纯rh2，有利于进一步通过酶法工业化生产人参皂苷rh2。
(2)本发明生产人参皂苷rh2的工艺简单，反应选择性高，副产物少，本发明葡萄糖苷酶及其突变体经大肠杆菌发酵易得，生产成本和产品质量优于化学法，适合工业化生产。反应条件温和，属于环境友好型生产工艺，符合国家推广的绿色环保工业标准。
(3)本发明方法中采用催化反应温度25～50℃、ph值6.5～9.5、底物rg3浓度为1％～5％w/v、葡萄糖苷酶用量为rg3重量0.01～0.06倍等技术特征，更有利于terrabacterginsenosidimutans葡萄糖苷酶及其突变体酶活对底物rg3的催化活性，提高其将rg3转化成rh2的转化率，可达95.89％以上，降低了副产物的产生，提高所得rh2的纯度，更有利于酶法生产人参皂苷rh2的工业化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1葡萄糖苷酶及其突变体
将来源于terrabacterginsenosidimutans的β-葡萄糖苷酶rh2-015(基因序列如seqidno:1所示，编码的蛋白序列如seqidno:2所示)的氨基酸序列经以下至少一种突变获得葡萄糖苷酶突变体：
将第71和72位的谷氨酸e、缬氨酸v分别突变为苏氨酸t、谷氨酸e(简称e71t+v72e)；
或/和将第92位的谷氨酰胺q突变为组氨酸h(简称q92h)；
或/和将第109和114位的丝氨酸s、脯氨酸p分别突变为丙氨酸a、甘氨酸g(简称s109a+p114g)；
或/和将第135位的脯氨酸p突变为丙氨酸a(简称p135a)；
或/和将第168位的苯丙氨酸f突变为酪氨酸y(简称f168y)；
或/和将第240位的谷氨酰胺q突变为谷氨酸e(简称q240e)；
或/和将第344位的赖氨酸k突变为精氨酸r(简称k344r)；
或/和将第412和416位的谷氨酸e、天冬氨酸d分别突变为天冬氨酸d、谷氨酸e(简称e412d+d416e)；
或/和将第469位的酪氨酸y突变为苯丙氨酸f(简称y469f)。
实施例2葡萄糖苷酶突变体的制备
通过反向pcr技术对rh2-015进行定点突变，制备单双突变体库。
将来源于terrabacterginsenosidimutans的β-葡萄糖苷酶基因rh2-015(基因序列如seqidno:1所示，编码的蛋白序列如seqidno:2所示)分别利用引物a(seqidno:3)和引物b(seqidno:4)通过pcr扩增技术获得pcr产物后经过酶切处理，同时插入到表达载体pet22b(+)的ndei和ecori位点，得到重组质粒pet22b-rh2-015。
按照实施例1所述的突变位置，在突变位置设计反向引物(突变引物序列如表2所示)，利用上下游突变引物扩增目的片段，并在引物上引入相应突变，以重组质粒pet22b-rh2-015作为模板进行反向pcr，pcr产物经dpni酶消化模板处理后(一般使用的质粒dna是从大肠杆菌宿主中抽提出来的，由于内源性的dam甲基化酶，该序列的腺嘌呤已被甲基化，因此可以被dpnⅰ切断。而用pcr等合成的dna由于未被甲基化，因此不能被切断，消除假阳性)转化到大肠杆菌rosetta(de3)，经过amp的筛选后挑取菌落送测序。测定正确后，获得突变成功的重组菌，对突变成功的重组菌进行诱导表达，即可获得葡萄糖苷酶突变体。
上述反向pcr的体系为：
pcr反应程序为：
98℃、2min；98℃、10s，55-65℃、30s，30个循环；72℃、7min；72℃、10min。
表2突变位点的突变引物
实施例3葡萄糖苷酶突变体酶活力的检测
(1)野生型β-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的诱导表达及其酶液的制备
将来源于terrabacterginsenosidimutans的β-葡萄糖苷酶基因rh2-015(基因序列如seqidno:1所示，编码的蛋白序列如seqidno:2所示)分别利用引物a(seqidno:3)和引物b(seqidno:4)通过pcr扩增技术获得pcr产物后经过酶切处理，同时插入到表达载体pet22b(+)的ndei和ecori位点，得到表达重组质粒pet22b-rh2-015。经测序验证后，将重组质粒转入大肠杆菌rosetta(de3)。获得的重组大肠杆菌接种在小体积的lb培养基(含有100μg/ml的amp)，30～37℃过夜培养后，以1～5％的接种量转接到1l体积的lb培养基中(含有100μg/ml的amp)，在30～37℃继续培养od600达到0.6～1.0加入终浓度为0.1mm～1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，在20～37℃诱导表达10～20h后离心收集菌体。发酵菌体悬浮于4倍体积的50～100mm的磷酸缓冲液(ph7.4)并超声波破胞20min，离心取上清得到rh2-015的酶液。
(2)野生型β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法
β-葡萄糖苷酶rh2-015酶液反应以pnp-glc为底物，在一个3ml的反应体系中加入1ml的150mmpnp-glc，100μl的稀释酶液，在ph7.0和37℃反应一定时间，0.5m碳酸钠5min终止反应。产物p-硝基酚在405nm处测定吸光值增加。1单位酶活定义为：每分钟产生1μmp-硝基酚为1u。
(3)β-葡萄糖苷酶突变体酶活力测定方法
β-葡萄糖苷酶突变体酶活力测定方法同野生型β-葡萄糖苷酶，将实施例2中突变成功的重组菌进行诱导表达，诱导表达方法同上述(1)，并利用与上述(2)相同的方法进行酶活力测定，将野生型和突变体的酶活力及其稳定性(保存80％以上的酶活力)进行比较。
比较结果如表3所示，从中可以看出，本发明突变后的葡萄糖苷酶活性大大提高，同时温度稳定范围和ph稳定范围不受影响，甚至稳定范围更广。
表3野生型和突变体β-葡萄糖苷酶的酶活力及稳定性
实施例4葡萄糖苷酶突变体和野生型催化人参皂苷rg3合成人参皂苷rh2
方法：不同反应器中分别加入经诱导表达的野生型、本发明不同突变型的β-葡萄糖苷酶的酶液，各组分别缓慢加入等量的经助溶剂甲醇溶解的4g人参皂苷rg3(边加入边搅拌)和纯水，使各组反应体系中rg3的终浓度4％w/v，葡萄糖苷酶的终浓度为0.04％w/v。反应在温度40℃、300rpm和ph8的条件下进行反应。反应过程中每隔一定时间取反应液用流动相稀释50～100倍，微孔过滤后进样进行液相分析，检测反应情况。液相检测使用kinetex2.6μmc18100a为分析柱，乙腈和水为流动性，柱温为室温，检测波长为203nm，流速为1.0ml/min。反应10小时后，检测rh2的产量。野生型和本发明突变型β-葡萄糖苷酶的反应条件完全相同。
结果：检测结果如表4所示，葡萄糖苷酶及其突变体酶活对底物rg3转化生成rh2的转化率达95.89％以上，其中q240e生成rh2转化率达99.68％。
表4野生型和突变体β-葡萄糖苷酶生成rh2的效果
实施例5葡萄糖苷酶突变体催化人参皂苷rg3合成人参皂苷rh2
方法：向反应釜中加入16ml0.1m磷酸盐缓冲液(ph7.5)同时搅拌，之后加入葡萄糖苷酶突变体(q240e)0.04g，搅拌，另外，称量4g底物rg3投入烧杯中，加入20mldmso，400rpm磁力搅拌。待底物溶解后，缓慢加入反应釜中(边加入边搅拌)，加纯水至100ml，使反应中的底物与酶充分混合，50℃水浴，氢氧化钠调节ph值为7-8。反应6小时后，检测rh2的产量。
结果：实验结果显示，反应6小时后经纯化，得rh2产量3.16g，可见突变型葡萄糖苷酶对底物的转化率为99.68％。
实施例6葡萄糖苷酶突变体催化人参皂苷rg3合成人参皂苷rh2
方法：在反应器中加入突变型β-葡萄糖苷酶(p135a)和0.1m磷酸盐缓冲液(ph7.5)，再缓慢加入经助溶剂甲醇溶解的人参皂苷rg3(边加入边搅拌)，使rg3的终浓度4％w/v，葡萄糖苷酶的浓度为0.12％w/v。反应在温度25℃、400rpm和ph9.5的条件下进行反应。反应12小时后，检测rh2的产量，突变型葡萄糖苷酶对底物的转化率为99.05％。
实施例7葡萄糖苷酶突变体催化人参皂苷rg3合成人参皂苷rh2
方法：在反应器中加入突变型β-葡萄糖苷酶(e412d+d416e)和0.12m磷酸盐缓冲液(ph7.8)，再缓慢加入经助溶剂乙醇溶解的人参皂苷rg3(边加入边搅拌)，使rg3的终浓度1％w/v，葡萄糖苷酶的浓度为0.06％w/v。反应在温度50℃、200rpm和ph6.5的条件下进行反应。反应4小时后，检测rh2的产量，突变型葡萄糖苷酶对底物的转化率为99.37％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>邦泰生物工程（深圳）有限公司
江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司
<120>一种葡萄糖苷酶突变体及其应用
<160>22
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1944
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<213>人参地杆菌变种(terrabacterginsenosidimutans)
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