表皮细胞培养基和基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法及应用与流程

本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种表皮细胞培养基和基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法及应用。

背景技术：

人类皮肤成纤维细胞和皮肤表皮细胞，是组成人类皮肤的两种重要细胞。皮肤成纤维细胞具有分泌胶原蛋白，弹性纤维等多种细胞外基质的功能，对维持皮肤弹性防止皮肤松弛和褶皱有着重要作用。皮肤表皮细胞具有分泌角蛋白的作用，是机体免受病原体感染的第一道防线。因此这两类细胞在医疗整形美容，皮肤损伤修复领域有着广泛的应用。除此之外，皮肤成纤维细胞和表皮细胞作为体外研究模型，在药物毒理实验，药物筛选和人工皮肤研制中发挥着重要的作用。

目前分离人类皮肤成纤维细胞和皮肤表皮细胞的方法，主要是组织块法和酶消化法。组织块法是将皮肤组织剪碎，并接种在培养皿中，待皮肤成纤维细胞或者表皮细胞迁出后，消化并纯化细胞，最终得到皮肤成纤维细胞或者皮肤表皮细胞。而酶消化法，是将皮肤组织用胰酶或者胶原酶消化为单个细胞，将细胞悬液接种于培养皿，由于皮肤成纤维细胞是细胞培养的优势细胞，培养物最终以成纤维细胞为主。因此，这两种传统的细胞分离方法一次只能从一个皮肤组织中分离的得到一类细胞，即一次从皮肤组织中分离出成纤维细胞或表皮细胞，无法同时制备这两类细胞，造成皮肤材料的浪费。

尤其在组织工程研究和应用中，种子细胞需要是来自同一个体，传统的方法需要手术取出两块皮肤组织或取出一块较大的皮肤组织，分别分离皮肤成纤维细胞和皮肤表皮细胞，一方面造成皮肤组织浪费，一方面需要增加了手术伤口的大小，使伤口愈合缓慢，有留下疤痕的风险。因此从同一块组织中制备成纤维细胞和皮肤表皮细胞的方法是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种表皮细胞培养基，该表皮细胞培养基培养得到的表皮细胞具有稳定的细胞形态和良好的细胞活性。

本发明的第二目的在于提供一种基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法，缓解了现有技术存在的缺少一种从同一块组织中制备成纤维细胞和皮肤表皮细胞的方法的问题。

本发明的第三目的在于提供上述表皮细胞培养基，或上述基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法在组织工程中的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种表皮细胞培养基，所述表皮细胞培养基包含基础培养基、bfgf和egf；

所述基础培养基包括血小板裂解液。

优选地，所述基础培养基包括高糖dmem/f12；

优选地，按照体积百分比计，所述基础培养基包括90％～95％的高糖dmem/f12和5％～10％的血小板裂解液；

更优选地，按照体积百分比计，所述基础培养基包括92.5％～95％的高糖dmem/f12和5％～7.5％的血小板裂解液；

进一步优选地，按照体积百分比计，所述基础培养基包括95％的高糖dmem/f12和5％的血小板裂解液；

优选地，所述表皮细胞培养基中bfgf的质量体积浓度为8～12ng/ml；优选为9～11ng/ml；更优选为10ng/ml；

优选地，所述表皮细胞培养基中egf的质量体积浓度为8～12ng/ml；优选为9～11ng/ml；更优选为10ng/ml。

优选地，按照体积百分比计，所述基础培养基的组分包括95％的高糖dmem/f12和5％的血小板裂解液；所述表皮细胞培养基中bfgf的质量体积浓度为10ng/ml；所述表皮细胞培养基中egf的质量体积浓度为10ng/ml。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法，包括：将组织在成纤维细胞培养基中培养至迁出的细胞中含有60％～80％成纤维细胞时收集成纤维细胞；然后将剩余组织在表皮细胞培养基中继续培养至表皮细胞迁出后收集表皮细胞；所述表皮细胞培养基包含上述表皮细胞培养基。

优选地，所述组织包括皮肤组织或皮肤组织衍生物。

优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基按照体积百分比计包含如下组分：血小板裂解液5％～10％和高糖dmem/f1290％～95％；

更优选地，所述成纤维细胞培养基按照体积百分比计包含如下组分：血小板裂解液5％～7.5％和高糖dmem/f1292.5％～95％；

进一步优选地，所述成纤维细胞培养基按照体积百分比计包含如下组分：血小板裂解液5％和高糖dmem/f1295％。

优选地，所述收集成纤维细胞包括弃去培养组织块的成纤维细胞培养基后使用dpbs清洗细胞，然后消化细胞，当成纤维细胞变圆并开始脱离培养面，同时组织周围表皮细胞无明显形态变化时终止消化，收集细胞悬液，离心重悬后继续培养。

优选地，所述收集表皮细胞包括弃去表皮细胞培养基后使用dpbs清洗细胞，然后消化细胞，收集细胞悬液，离心重悬后继续培养。

优选地，所述基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法包括如下步骤：

(a)将浸泡过抗生素的组织使用缓冲液清洗，将除去皮下组织和血管的剩余组织使用成纤维细胞培养基中浸润，然后剪碎至组织块，再将组织块接种于培养容器中培养；

(b)培养组织块18～22天，并且当从组织块中迁出的细胞中含有60％～80％成纤维细胞时，弃成纤维细胞培养基，dpbs清洗，0.05％胰酶消化至成纤维细胞边圆开始脱离培养面，同时组织块周围表皮细胞无明显形态变化时加入成纤维细胞培养基终止消化，拍打培养容器底面然后收集细胞悬液；再向培养容器中加入成纤维细胞培养基，拍打培养容器底面然后收集细胞悬液；将两次收集的细胞悬液混合后离心重悬，继续培养；

(c)向步骤(b)中分离成纤维细胞后剩余的组织块中加入所述表皮细胞培养基，继续培养；

(d)继续培养剩余的组织块至表皮细胞迁出，弃表皮细胞培养基，dpbs清洗后使用0.25％胰酶消化至表皮细胞边圆开始脱离培养面时加入表皮细胞培养基终止消化，收集细胞悬液，离心重悬后继续培养。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述表皮细胞培养基，或上述基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法在组织工程中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的表皮细胞培养基含有富含生物活性因子的血小板裂解液，能够促进表皮细胞的生长和增殖；该表皮细胞培养基中还含有促进和调控细胞生长的碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。使用该表皮细胞培养基培养表皮细胞，能够使表皮细胞稳定的生长，维持表皮细胞的形态特征和良好的细胞活性。

本发明还提供了基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法，该方法操作简单，制备得到的成纤维细胞和表皮细胞均具有良好的细胞形态和活性。组织接种培养后，一般是成纤维细胞先从组织中迁出，然后是表皮细胞，利用这两种细胞的生长特性的差异，分别消化成纤维细胞和表皮细胞用于传代，并添加不同的培养基，从而实现了直接从同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的技术效果，提高了组织的利用率，也为后续的细胞美容或者毒理实验，药物筛选等研究提供了充足的种子细胞。

本发明提供的表皮细胞培养基，或基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法在组织工程中的应用，可以应用于制备组织工程皮肤中的种子细胞，制备得到的种子细胞形态和活性均较佳，得到的种子成纤维细胞或表皮细胞可用于制备组织工程化表皮、组织工程化复合皮肤和组织工程化真皮等，也可以直接应用于制备用于移植的，含有成纤维细胞和/或表皮细胞的产品，以修复皮损和瘢痕，或作为填充物以改善皮肤皱纹或凹陷，提高皮肤的弹性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例6中皮肤组织块培养5天后的形态；

图2为本发明实施例6中皮肤组织块培养10天后的形态；

图3为本发明实施例6中皮肤组织块培养10天后迁出的细胞；

图4为本发明实施例6中从皮肤组织块中消化成纤维细胞过程中组织块周围上皮样细胞的形态；

图5为本发明实施例6分离成纤维细胞后剩余组织块在表皮细胞培养基培养5天后迁出的细胞的形态；

图6为本发明实施例6分离得到的成纤维细胞的形态；

图7为本发明实施例6分离得到的表皮细胞的形态；

图8为本发明实施例6分离得到的成纤维细胞的免疫荧光染色结果；

图9为本发明实施例6分离得到的表皮细胞的免疫荧光染色结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种表皮细胞培养基，该表皮细胞培养基包含基础培养基、bfgf和egf；其中基础培养基包括血小板裂解液。

本发明提供的表皮细胞培养基含有富含生物活性因子的血小板裂解液，能够促进表皮细胞的生长和增殖；该表皮细胞培养基中还含有促进和调控细胞生长的碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。使用该表皮细胞培养基培养表皮细胞，能够使表皮细胞稳定的生长，维持表皮细胞的形态特征和良好的细胞活性。

bfgf为碱性成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)，是一种促有丝分裂的阳离子多肽，是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子；bfgf在生物进化上具有很强的保守性，各种动物的bfgf都有很高的同源性，bfgf在体外对成纤维细胞、骨细胞血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞等具有很强的促进细胞分裂增殖活性的作用。在一些优选的实施方式中，表皮细胞培养基中bfgf的质量体积浓度为8～12ng/ml，例如可以为但不限于为8ng/ml、8.5ng/ml、9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml、11ng/ml、11.5ng/ml或12ng/ml，优选为10ng/ml，其中体积为表皮细胞培养基总体积。

egf为表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)，是一种单链低分子多肽，egf与细胞上的egf受体结合后可以促进细胞的dna合成和有丝分裂。egf尤其能够刺激表皮细胞进入细胞分裂周期，启动功能基因活化、表达、分泌生物活性蛋白等，对细胞的生长和调控发挥重要的作用。在一些优选的实施方式中，表皮细胞培养基中egf的质量体积浓度为8～12ng/ml，例如可以为但不限于为8ng/ml、8.5ng/ml、9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml、11ng/ml、11.5ng/ml或12ng/ml，优选为10ng/ml，其中体积为表皮细胞培养基总体积。

本发明所述的基础培养基，指的是能够为细胞的生长提供基本营养物质的培养基，所述基本营养物质包括但不限于糖类物质、氨基酸类、无机盐类、维生素类和抗生素类等，同时基础培养基还为细胞提供适宜的生长环境，包括但不限于合适的ph和渗透压等生长环境。所述基础培养基包括但不限于高糖dmem培养基、低糖dmem培养基、f12培养基、fm培养基和rpmi-1640培养基中的一种或者多种。

血小板裂解液(plateletlysate，pl)是将浓缩的血小板裂解后获得的液体成分，能够促进细胞的生长和增殖；pl去除了残余细胞结构，可降低免疫原性，同时包含了更多生物活性因子，例如胰岛素样生长因子-1(igf-1)、转化生长因子-β(tgf-β)、血小板源性生长因子(pdgf)和血管内皮生长因子(vegf)。

在一些可选的实施方式中，所述基础培养基包含高糖dmem/f12，dmem是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，分为高糖型和低糖型；f12培养基为ham'sf12nutrientmedium动物细胞培养基，成分复杂，含有多种微量元素。高糖dmem/f12是将高糖dmem培养基和f12培养基以1∶1结合，以利用f12含有的较丰富的营养成分和高糖dmem含有的较高浓度的营养成分。

在一些优选的实施方式中，具有如下配方的基础培养基培养上皮细胞的效果更佳，所述基础培养基包括90％～95％的高糖dmem/f12，例如可以为但不限于为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％或95％；基础培养基的组分还包括5％～10％的血小板裂解液，例如可以为但不限于为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。

在一些更优选的实施方式中，按照体积百分比计，所述基础培养基包括92.5％～95％的高糖dmem/f12和5％～7.5％的血小板裂解液；更优选地，按照体积百分比计，所述基础培养基包括95％的高糖dmem/f12和5％的血小板裂解液。

本发明提供的表皮细胞培养基，可以培养的表皮细胞的来源包括但不限于人或者其他哺乳类动物以及禽类，具体的例如可以为但不限于为人类、牛、羊、猪、猴、马、大鼠、小鼠、鸡或鸭等。当所述表皮细胞培养基用于培养来源于人的表皮细胞时，血小板裂解液优选使用人血小板裂解液hpl，以更适于人源细胞的生长。

在一个具体的实施方式中，提供了一种适用于人源的表皮细胞生长的表皮细胞培养基，配方如下：按照体积百分比计，所述基础培养基的组分包括95％的高糖dmem/f12和5％的血小板裂解液；所述表皮细胞培养基中bfgf的质量体积浓度为10ng/ml；所述表皮细胞培养基中egf的质量体积浓度为10ng/ml。

本发明还提供了基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法，该方法包括将组织在成纤维细胞培养基中培养至迁出的细胞中含有60％～80％成纤维细胞时收集成纤维细胞；将剩余组织在表皮细胞培养基中继续培养至表皮细胞迁出后收集表皮细胞；其中表皮细胞培养基为上述主要由基础培养基、bfgf和egf组成，并且含有血小板裂解液的表皮细胞培养基。

组织接种培养后，一般是成纤维细胞先从组织中迁出，然后是表皮细胞，利用这两种细胞的生长特性的差异，尤其是当从组织中迁出的细胞中含有60％～80％成纤维细胞时，收集成纤维细胞，再继续培养组织以获得表皮细胞时，效果更佳。通过分别消化成纤维细胞和表皮细胞用于传代，并添加不同的培养基，从而实现了直接从同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞，提高了组织的利用率，也为后续的细胞美容或者毒理实验，药物筛选等研究提供了充足的种子细胞。

可以理解的是上述表皮细胞培养基对可以培养的表皮细胞的物种的来源不做限制，例如可以来自于人类，也可以来自于动物，动物具体的例如可以为但不限于为牛、羊、猪、猴、马、大鼠、小鼠、鸡或鸭等。其中所述组织可以为皮肤组织和/或皮肤组织衍生物。皮肤组织衍生物是动物在长期的进化过程中由皮肤演化而来的各种构造及各种不同的腺体的总称，包括毛、磷、羽、蹄、角、爪、皮脂腺和汗腺等。

在一些优选的实施方式中，所述成纤维细胞培养基按照体积百分比计包含如下组分：血小板裂解液5％～10％和高糖dmem/f1290％～95％；其中血小板裂解液的体积百分比例如可以为但不限于为5％、6％、6.5％、7.5％、8％、9％或10％；高糖dmem/f12的体积百分比例如可以为但不限于为90％、91％、92％、92.5％、93.5％、94％或95％。

在一些优选的实施方式中，如下配比的成纤维细胞培养基培养成纤维细胞的效果更佳：按照体积百分比计包含如下组分：血小板裂解液5％～7.5％和高糖dmem/f1292.5％～95％；在一个具体的优选实施方式中，按照体积百分比计包含如下组分：血小板裂解液5％和高糖dmem/f1295％。

在一些优选的实施方式中，按照如下步骤实施基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法效果更佳，包括如下步骤：

(a)皮肤组织块培养：将健康皮肤组织在含有抗生素的缓冲液中浸泡，以去除组织中残留的微生物，优选使用160u/ml庆大霉素浸泡1min后用缓冲液清洗皮肤组织，缓冲液可选择生理盐水或pbs，并清洗皮肤组织至少三次；用已消毒的手术器械将上层的皮下组织和血管刮干净；然后将去掉了皮下组织和血管的皮肤组织在浸润于成纤维细胞培养基中1min，然后在60mm培养皿中用虹膜剪切碎，再使用眼科镊子将切碎的组织块分别独立的接种于100mm的培养皿中后置于二氧化碳培养箱培养，培养24h后补充皮肤成纤维细胞培养基10ml，再置于二氧化碳培养箱中继续培养。

(b)成纤维样细胞的分离传代：培养组织块18～22天，并且当从组织块中迁出的细胞中含有60～80％成纤维细胞时，弃成纤维细胞培养基，dpbs清洗两遍，d-pbs为杜氏磷酸缓冲液，0.05％胰酶消化至成纤维细胞边圆开始脱离培养面，同时组织周围表皮细胞无明显形态变化时加入成纤维细胞培养基终止消化，拍打培养容器底面然后收集细胞悬液；再向培养容器中加入成纤维细胞培养基，拍打培养容器底面然后收集细胞悬液；将两次收集的细胞悬液在15ml离心管中混合，300g×5min收集细胞，弃去上清液，然后加入预温的成纤维细胞培养基，重悬细胞并计数，按照1×10⁴/cm²的细胞密度接种细胞后，置于二氧化碳培养箱中继续培养。

(c)皮肤表皮细胞的培养：步骤(b)分离成纤维细胞后剩余的培养物，主要是皮肤表皮细胞，加入表皮细胞培养基，继续培养。

(d)皮肤表皮细胞的分离传代：继续培养剩余的组织块至表皮细胞迁出，优选培养剩余组织块4～6天后弃表皮细胞培养基，dpbs清洗后使用0.25％胰酶消化，至表皮细胞边圆开始脱离培养面时加入表皮细胞培养基终止消化，轻轻拍打培养瓶底面，收集细胞悬液。300g×5min收集细胞，重悬计数后以1×10⁴/cm²的细胞密度接种，置于二氧化碳培养箱中培养。

本发明还提供了上述表皮细胞培养基，或上述基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法在组织工程中的应用，可以应用于制备组织工程皮肤，也可以直接应用于制备用于移植的成纤维细胞或表皮细胞。

组织工程皮肤是指由细胞或细胞外基质或由两者共同结合组成的皮肤产品，是应用生命科学和工程学的原理与技术将种子细胞与适当的支架材料相结合构建出的用于修复、维护和改善损伤皮肤组织功能和形态的生物替代物。

本发明提供的表皮细胞培养基，可以用于分离和培养表皮细胞，以用于制备组织工程的种子细胞，表皮细胞可以制备组织工程化表皮，能促进成纤维细胞和表皮细胞增殖和迁移，应用于创面能减少瘢痕增生。

将本发明提供的基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法应用于组织工程皮肤可以减少用于制备种子细胞的组织的用量，提高了组织的利用率。该方法可以用于制备成纤维细胞种子细胞和表皮细胞种子细胞，表皮细胞如上所述可以作为组织工程化表皮的种子细胞；成纤维细胞是真皮基质中的主要细胞，添加成纤维细胞后有增加组织工程皮肤的强度和韧性、移植后创面收缩小、外观平整等优点。在组织工程皮肤中加入适量成纤维细胞，有加快移植物血管化、加强抗感染的作用，可以制备组织工程化复合皮肤和组织工程化真皮等。

本发明提供的表皮细胞培养基，或基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法也可以直接应用于制备用于移植的，含有成纤维细胞和/或表皮细胞的产品，以修复皮损和瘢痕，或作为填充物以改善皮肤皱纹或凹陷，提高皮肤的弹性。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实验试剂如下：

实施例1

本实施例提供了一种表皮细胞培养基，本实施例提供的表皮细胞培养基中的基础培养基由高糖dmem/f12和hpl组成，其中按照体积百分比计，基础培养基中高糖dmem/f12占95％，hpl占5％。将高糖dmem/f12和hpl按照配方量混合均匀后加入bfgf和egf，使表皮细胞培养基中的bfgf和egf的终浓度均为10ng/ml。

实施例2

本实施例提供了一种表皮细胞培养基，本实施例提供的表皮细胞培养基中的基础培养基由高糖dmem/f12和hpl组成，其中按照体积百分比计，基础培养基中高糖dmem/f12占90％，hpl占10％。将高糖dmem/f12和hpl按照配方量混合均匀后加入bfgf和egf，使表皮细胞培养基中的bfgf和egf的终浓度均为10ng/ml。

实施例3

本实施例提供了一种表皮细胞培养基，本实施例提供的表皮细胞培养基中的基础培养基由高糖dmem/f12和hpl组成，其中按照体积百分比计，基础培养基中高糖dmem/f12占80％，hpl占20％。将高糖dmem/f12和hpl按照配方量混合均匀后加入bfgf和egf，使表皮细胞培养基中的bfgf和egf的终浓度均为5ng/ml。

实施例4

本实施例提供了一种表皮细胞培养基，本实施例提供的表皮细胞培养基中的基础培养基由高糖dmem和hpl组成，其中按照体积百分比计，基础培养基中高糖dmem占90％，hpl占10％。将高糖dmem和hpl按照配方量混合均匀后加入bfgf和egf，使表皮细胞培养基中的bfgf和egf的终浓度均为10ng/ml。

实施例5

本实施例提供了一种成纤维细胞培养基，按照体积百分比计包含5％的hpl和95％的高糖dmem/f12。

实施例6

本实施例提供了一种基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法，包括如下步骤：

(a)皮肤组织块培养：将使用160u/ml庆大霉素浸泡过1min的健康皮肤组织用pbs或者生理盐水再清洗三次，用手术器械将上层的皮下组织和血管刮干净，手术器械经过消毒处理。将除去皮下组织和血管的剩余组织使用成纤维细胞培养基中浸润，成纤维细胞培养基使用实施例5提供的成纤维细胞培养基，浸润时间为1min。然后将皮肤组织在60mm培养皿中用虹膜剪切碎至组织块，再使用眼科镊子将切碎的组织块分别独立的接种于100mm的培养皿中后置于二氧化碳培养箱培养，培养24h后补充皮肤成纤维细胞培养基10ml，再置于二氧化碳培养箱中继续培养。

(b)成纤维样细胞的分离传代：组织块培养至20天后弃培养基，使用缓冲液清洗残余培养基，缓冲液使用dpbs，每次1min；然后消化细胞：加入2ml的0.05％胰酶消化液在培养箱中孵育，每隔2min镜下观察，当培养物外围的成纤维细胞变圆，同时变圆的成纤维细胞开始脱离培养面，而组织块周围的上皮样细胞的形态无明显变化时，使用5ml成纤维细胞培养基终止消化，轻拍培养瓶底面促进成纤维细胞脱落，然后收集细胞悬液。再使用5ml成纤维细胞培养基终止消化，轻拍培养瓶底面促进成纤维细胞脱落，然后收集细胞悬液。将两次收集的细胞悬液在15ml离心管中混合，300g×5min条件下离心收集细胞，弃去上清液。向离心管中加入预温的成纤维细胞培养基，重悬细胞并计数，以1×10⁴/cm²的细胞密度接种，置于二氧化碳培养箱中继续培养。

(c)皮肤表皮细胞的培养：上述分离成纤维细胞后剩余的培养物，主要是皮肤表皮细胞，此时向培养皿中加入10ml实施例1提供的表皮细胞培养基置于二氧化碳培养箱中培养。

(d)皮肤表皮细胞的分离传代：继续培养5天后，dpbs洗两遍，每次1min；加入0.25％胰酶消化液2ml，在培养箱中孵育。每隔2分钟镜下观察，当见到组织块周围的表皮细胞变圆并开始脱离培养面，加入10ml表皮细胞培养基终止消化，轻轻拍打培养瓶底面，将收集细胞悬液。细胞悬液在15ml离心管中混合，300g×5min条件下离心收集细胞，弃去上清液。向离心管中加入预温的成纤维细胞培养基，重悬细胞并计数，以1×10⁴/cm²的细胞密度接种，置于二氧化碳培养箱中继续培养。

该实施例的分离和制备结果如图1～图7所示：

皮肤组织块一般在培养后5天，可见有表皮细胞从组织块中迁出(如图1所示)，培养10天后可见有成纤维细胞从组织块中迁出(如图2所示)。

组织块培养后20天，成纤维细胞成为组织块中迁出的优势细胞(如图3所示)，在此时进行成纤维细胞消化传代，从图4可以看出皮肤组织块外围的成纤维细胞变圆并开始脱离培养面时，组织块周围的上皮样细胞的形态无明显变化，说明此时能有效的分离收集成纤维细胞，而不影响表皮细胞的生长。以1×10⁴/cm²的细胞密度接种成纤维细胞，置于二氧化碳培养箱中培养。培养2至3天后，皮肤成纤维细胞为长梭形，细胞核质比小(如图6所示)。

分离成纤维细胞后剩余的培养物，主要是皮肤表皮细胞，在表皮细胞培养基培养5天后，可见表皮细胞为典型上皮样细胞，主要分布于组织块周围，边界明显(如图5所示)。传代后的表皮细胞，呈上皮样，集落状生长，集落边界清楚，集落内细胞为多角形细胞(如图7所示)。

效果例1

成纤维样细胞免疫荧光染色：dpbs洗三次，每次3min。4％pfa固定，室温固定20min。dpbs洗三次，每次3min。0.1％triton-x100透膜，室温透膜10min。dpbs洗三次，每次3min。5％羊血清封闭，室温封闭30min。吸去封闭液，添加一抗(1∶100稀释，兔抗人vimentin抗体)工作液。4℃孵育过夜。dpbs洗三次，每次3min；添加二抗工作液(1∶100稀释，驴抗兔-igg-alexa488抗体)，室温避光孵育1hr。dpbs洗三次，每次3min。hoechst33342染核5min。dpbs洗三次，每次3min，荧光显微镜镜下观察并照相，分离的皮肤成纤维细胞在形态上为长梭形，呈典型的成纤维样细胞形态(如图6所示)，免疫荧光结果显示，皮肤成纤维细胞表达vimentin，分布于细胞质中(如图8所示)，说明其间质细胞起源。

效果例2

表皮细胞免疫荧光染色：dpbs洗三次，每次3min。4％pfa固定，室温固定20min。dpbs洗三次，每次3min。0.1％triton-x100透膜，室温透膜10min。dpbs洗三次，每次3min。5％羊血清封闭，室温封闭30min。吸去封闭液，添加一抗(1∶100稀释，兔抗人keratin抗体)工作液。4℃孵育过夜。dpbs洗三次，每次3min；添加二抗工作液(1∶100稀释，驴抗兔-igg-alexa488抗体)，室温避光孵育1hr。dpbs洗三次，每次3min。hoechst33342染核5min。dpbs洗三次，每次3min，荧光显微镜镜下观察并照相。分离的皮肤表皮维细胞在形态上为多角形，呈典型的上皮细胞形态(如图7所示)，免疫荧光结果显示，皮肤成纤维细胞表达keratin，分布于细胞质中(如图9所示)，说明其表皮细胞起源。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。