【技术领域】
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种细胞松弛素类化合物的制备方法和应用。
背景技术：
细胞松弛素，又称为植物抗毒素，是氨基酸/聚酮的杂合体，是一类结构独特新颖，且具有非常好的抗菌、抑制hiv、病毒、抗肿瘤、植物毒性等活性天然活性化合物。细胞松弛素类化合物可以从真菌的代谢产物中分离获得，但是由于含量较低，得率较少，影响了该类化合物的开发应用。细胞松弛素c和d属于细胞松弛素类化合物，目前尚无获得该化合物的适宜的工业生产方法。真菌gdgj-368为炭角属xylariasp.真菌，从槐属植物广豆根(sophoratonkinensis)的叶中分离得到。通过真菌发酵，从gdgj-368真菌的代谢产物中获得大量细胞松弛素c和d，对于细胞松弛素类化合物的开发利用，具有积极意义。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种细胞松弛素类化合物的制备方法和应用，首次从通过工业生产的方法获得细胞松弛素c和d，对于细胞松弛素类化合物的开发利用，具有积极意义。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种细胞松弛素类化合物的制备方法，所述细胞松弛素类化合物为细胞松弛素c和细胞松弛素d，是通过广豆根内生真菌炭角菌gdgj-368发酵得到，所述炭角菌gdgj-368保藏在位于武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccm2019951，保藏日期为2019年11月19日。细胞松弛素c和细胞松弛素d和的结构式分别为下式1和下式2：
本发明中，优选地，所述细胞松弛素类化合物是通过将炭角菌gdgj-368接种在大米培养基中发酵，将发酵液通过硅胶柱层析分离得到的。
本发明中，优选地，细胞松弛素类化合物的制备方法具体包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，将所述炭角菌gdgj-368接种到pda平板培养基，培养后得到种子培养基；
(2)将步骤(1)得到的种子培养基切割后接种至灭菌后的大米培养基中发酵，发酵培养得发酵物，而后将发酵物用有机溶剂浸泡提取，减压浓缩之后得到粗浸膏；
(3)步骤(2)得到的粗浸膏经过硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，所述石油醚-乙酸乙酯梯度范围为：10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、0:10；合并7:3和5:5梯度洗脱得到的馏分，浓缩后经反相c18柱层析、sephadexlh-20凝胶柱层析，再进行重结晶，即得到细胞松弛素c和细胞松弛素d。
以上步骤中，优选地，所述pda平板培养基主要由以下原料制成：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15～20g/l；培养条件为28℃恒温培养4-6天。
优选地，步骤(2)中所述的发酵条件为，在每个大米培养基中接种一块蚕豆大小的菌体，室温条件下静置培养25-50天；所述大米培养基中所含的组分包括：大米50-90g，蒸馏水120-150ml。
优选地，步骤(2)中所述的发酵物为固体，所述有机溶剂为乙酸乙酯，提取次数为1-5次，将每次的提取液合并后减压浓缩得到粗浸膏。
优选地，所述步骤(3)中，具体步骤还包括，合并7:3和5:5梯度洗脱得到的馏分，浓缩至干得固体b；将固体b拌样过硅胶柱，使用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂以体积比为9:1、7:3、5:5、3:7、0:10梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比7:3洗脱的部分，浓缩后，得到固体c；收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:5洗脱的部分，浓缩后，得到固体d；
固体c使用反相c18柱纯化，用体积比7:3的甲醇-水洗脱并收集洗脱物，使用甲醇重结晶得到细胞松弛素c。
固体d使用反相c18柱纯化，用体积比7:3的甲醇-水洗脱并收集洗脱物，浓缩后通过凝胶色谱柱sephadexlh-20纯化，洗脱剂为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇溶液，得到细胞松弛素d。
实验证明，本发明制备所得细胞松弛素c和细胞松弛素d对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乙型溶血性链球菌和巨大芽孢杆菌具有中等的抗菌活性，可以应用于制备抗菌药物。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明首次利用槐属植物内生真菌炭角菌gdgj-368(xylariasp.)菌株发酵生产得到细胞松弛素c和d，为细胞松弛素c和d的制备增添了一种新的制备方法，对于细胞松弛素类化合物的开发利用，具有积极意义。
2、在本发明所述的发酵条件下得到的发酵物中的细胞松弛素c的含量大于8％，细胞松弛素d的含量大于1％，细胞松弛素单体纯度可达98％以上。本发明所述的制备方法简便、制备得到的细胞松弛素c和d含量高，适合于工业化大生产。
3、本发明制备所得的细胞松弛素c和d对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乙型溶血性链球菌和巨大芽孢杆菌具有抗菌活性，可以应用于制备抗菌药物。
【具体实施方式】
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所述“广豆根内生真菌炭角菌gdgj-368(xylariasp.)”是发明人采集自广西百色靖西市广豆根植物的叶部，分离纯化后，经形态学及分子生物学鉴定该菌株为炭角菌属；该菌种已保藏在位于中国武汉的武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccm2019951，保藏日期为2019年11月19日。
实施例1
(1)种子培养基的配制：炭角菌gdgj-368菌种以pdb-甘油培养基，-80℃保存。取炭角菌gdgj-368(xylariasp.)菌种接种到pda平板培养基上，在28℃培养箱中培养4天，得到种子培养基；pda平板培养基主要由以下组成制成：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15g/l。
(2)发酵培养：将步骤(1)得到的种子培养基用接种环切割成蚕豆大小的菌体，接种至灭菌后的大米培养基中发酵，所述大米培养基中所含的组分包括：大米50g，蒸馏水120ml，采用容量为1000ml的锥形瓶，在每个大米培养基中接种一块蚕豆大小的菌体，室温条件下静置培养25天，发酵培养得固体状的发酵物，而后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取1次，将每次的提取液合并后减压浓缩得到粗浸膏；
(3)分离纯化：将步骤(2)得到的粗浸膏经过硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，所述石油醚-乙酸乙酯梯度范围为：10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、0:10；合并7:3和5:5梯度洗脱得到的馏分，浓缩至干得固体b；
将固体b拌样过硅胶柱，使用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂以体积比为9:1、7:3、5:5、3:7、0:10梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比7:3洗脱的部分，浓缩后，得到固体c；收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:5洗脱的部分，浓缩后，得到固体d；
固体c使用反相c18柱纯化，用体积比7:3的甲醇-水洗脱并收集洗脱物，使用甲醇重结晶得到细胞松弛素c。
固体d使用反相c18柱纯化，用体积比7:3的甲醇-水洗脱并收集洗脱物，浓缩后通过凝胶色谱柱sephadexlh-20纯化，洗脱剂为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇溶液，得到细胞松弛素d。
实施例2
(1)种子培养基的配制：炭角菌gdgj-368菌种以pdb-甘油培养基，-80℃保存。取炭角菌gdgj-368(xylariasp.)菌种接种到pda平板培养基上，在28℃培养箱中培养4-6天，得到种子培养基；pda平板培养基主要由以下组成制成：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉20g/l。
(2)发酵培养：将步骤(1)得到的种子培养基用接种环切割成蚕豆大小的菌体，接种至灭菌后的大米培养基中发酵，所述大米培养基中所含的组分包括：大米90g，蒸馏水150ml，采用容量为1000ml的锥形瓶，在每个大米培养基中接种一块蚕豆大小的菌体，室温条件下静置培养50天，发酵培养得固体状的发酵物，而后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取5次，将每次的提取液合并后减压浓缩得到粗浸膏；
(3)分离纯化：将步骤(2)得到的粗浸膏经过硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，所述石油醚-乙酸乙酯梯度范围为：10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、0:10；合并7:3和5:5梯度洗脱得到的馏分，浓缩至干得固体b；
将固体b拌样过硅胶柱，使用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂以体积比为9:1、7:3、5:5、3:7、0:10梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比7:3洗脱的部分，浓缩后，得到固体c；收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:5洗脱的部分，浓缩后，得到固体d；
固体c使用反相c18柱纯化，用体积比7:3的甲醇-水洗脱并收集洗脱物，使用甲醇重结晶得到细胞松弛素c；
固体d使用反相c18柱纯化，用体积比7:3的甲醇-水洗脱并收集洗脱物，浓缩后通过凝胶色谱柱sephadexlh-20纯化，洗脱剂为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇溶液，得到细胞松弛素d。
实施例1和2中所用的培养基原料份量和提取次数稍有不同，最终均能得到细胞松弛素c和细胞松弛素d这两种化合物，只是在得率方法有些许差异，将实施例1和2所得的化合物进行质谱分析，相关的光谱数据信息和结构式如下：
细胞松弛素c：1hnmr(400mhz,dmso-d6)：8.13(s,1h,2-nh)，7.32(t,j＝7.3hz,2h,h-3'/5')，7.24(t,j＝7.3hz,1h,h-4')，7.19(d,j＝7.0hz,2h,h-2'/6')，5.81(dd,j＝15.8hz,2.1hz,1h,h-19)，5.68(m,1h,h-21)，5.57(dd,j＝15.6hz,10.1hz,1h,h-13)，5.16(dd,j＝15.8hz,2.3hz,1h,h-20)，5.07(ddd,j＝5.1hz,10.7hz,15.6hz,1h,h-14)，4.96,(s,1h,18-oh)，4.22(d,j＝7.1hz,1h,h-7)，3.55(t,j＝7.8hz,1h,h-3)，3.17(m,1h,h-4)，2.94(dd,j＝13.0hz,4.8hz,1h,h-15)，2.75(m,2h,h-10)，2.29(s,3h,h-25)，2.27(m,1h,h-16)，2.20(m,1h,h-8)，1.91(dd,j＝12.7hz,4.8hz,1h,h-15)，1.50(s,3h,h-11)，1.39(s,3h,h-12)，1.05(d,j＝6.8hz,3h,h-22)，0.92(s,3h,h-23)。13c-nmr(100mhz，dmso-d6):174.0(c-1)，59.7(c-3)，49.0(c-4)，125.4(c-5)，131.5(c-6)，67.9(c-7)，48.4(c-8)，52.5(c-9)，41.4(c-10)，14.3(c-11)，16.5(c-12)，131.1(c-13)，133.2(c-14)，38.0(c-15)，43.6(c-16)，209.8(c-17)，77.6(c-18)，131.8(c-19)，126.6(c-20)，74.9(c-21)，19.3(c-22)，24.6(c-23)，170.3(c-24)，20.6(c-25)，137.7(c-1')，128.5(c-2'/6')，129.3(c-3'/5')，127.6(c-4')。根据上述数据，可以确定其为细胞松弛素c，结构式如下：
细胞松弛素d：1h-nmr(400mhz,dmso-d6)：8.04(s,1h,2-nh)，7.30(t,j＝7.3hz,2h,h-3'/5')，7.22(t,j＝7.3hz,1h,h-4')，7.15(d,j＝7.0hz,2h,h-2'/6')，5.87(dd,j＝15.9hz,2.3hz,1h,h-20)，5.42(dd,j＝15.5hz,9.7hz,1h,h-14)，5.27(t,j＝2.3hz,1h,h-21)，5.13(m,1h,h-19)，5.07(m,1h,h-13)，5.02(s,1h,h-12)，4.92(s,1h,18-oh)，4.80(s,1h,h-12)，4.53(d,j＝6.0hz,1h,7-oh)，3.57(dd,j＝10.2hz,6.0hz,1h,h-7)，3.10(m,1h,h-3)，2.81(m,1h,h-10)，2.75(m,1h,h-10)，2.69(t,j＝9.9hz,1h,h-4)，2.56(m,1h,h-16)，2.48(m,1h,h-8)，2.28(s,3h,21-ococh3)，2.19(m,1h,h-15)，1.99(m,1h,h-5)，1.91(dd,j＝12.7,4.7hz,1h,h-15)，1.38(s,3h,h-23)，1.05(d,j＝6.8hz,3h,h-22)，0.39(d,j＝6.7hz,3h,h-11)。13c-nmr(100mhz，dmso-d6)：173.6(c-1)，52.5(c-3)，46.1(c-4)，47.5(c-5)，150.7(c-6)，70.2(c-7)，31.6(c-8)，53.1(c-9)，41.5(c-10)，12.8(c-11)，111.5(c-12)，131.6(c-13)，130.8(c-14)，37.9(c-15)，43.7(c-16)，210.0(c-17)，77.5(c-18)，127.0(c-19)，132.2(c-20)，76.4(c-21)，19.3(c-22)，24.6(c-23)，170.0(21-ococh3)，20.5(21-ococh3)，137.1(c-1')，129.6(c-2'/6')，128.3(c-3'/5')，126.5(c-4')。根据上述数据，可以确定其为细胞松弛素d，结构式如下：
实施例3.抑菌效果试验
1、菌悬液的制备
在无菌操作台中，挑取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乙型溶血性链球菌和巨大芽孢杆菌这4种标准菌株少许，接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，放置于37℃恒温水浴摇床中震荡培养18h。取18h培养的各菌株培养物，用牛肉膏蛋白胨培养基稀释1000倍得菌悬液用于实验。
2、供试液的制备
将本发明所得细胞松弛素c和细胞松弛素d经冷冻干燥，各提取物分别用二甲亚砜溶解，制备成1mg·ml-1的初始浓度，在超净工作台中用0.22μm(尼龙66)的微孔滤膜过滤备用。
3、二倍稀释法
对于每个受试样品分别取灭菌试管8支，第1管加入受试药液0.1ml，第2-8管中分别加入0.1ml培养基液，取供试液0.1ml加入第2管中，混匀后取0.1ml加入第3管中，依次稀释至第7管，第7管吸出0.1ml弃去，第8管不加药液作为对照。每管加入菌悬液0.9ml，使得1-8管的液体总量均为1ml，受试药液浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56μg·ml-1。将试管放入恒温培养箱37℃培养24h后，取出试管观察细菌生长情况。如药液管混浊，表示细菌生长，供试药液无抑菌作用；如药液管清亮则表示细菌生长受抑制，其能抑制细菌生长的最大稀释度的药液，即为该样品的最小抑菌浓度(mic)。
4、抑菌结果
细胞松弛素c和细胞松弛素d对4种常见细菌的抑菌活性测试结果见下表1。
表1细胞松弛素c和d对4种细菌的抑菌效果
从上表可以看出，细胞松弛素c和细胞松弛素d对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乙型溶血性链球菌和巨大芽孢杆菌具有较好的抑制效果，可在医药领域开发作为抗菌药物。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。