一种高效低成本制备间充质干细胞来源外泌体的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是一种高效低成本制备间充质干细胞来源外泌体的方法。
背景技术：
：间充质干细胞（mesenchymalstemcells,mscs）是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，具有来源丰富，可取自骨髓、脐带、脐血、脂肪等组织，免疫原性低等优点。基于mscs的细胞治疗已成功应用于心血管系统疾病，骨、软骨缺损，糖尿病等疾病的治疗。mscs通过旁分泌和自分泌释放多种细胞因子和生长因子，这些分泌的生物活性因子能够抑制纤维化和凋亡，增强血管生成，参与组织修复再生。外泌体是细胞分泌的，由脂质双分子层包裹的囊泡结构，广泛存在于多种体液中。由细胞释放的外泌体能够携带母细胞的蛋白质和核酸等生物活性分子，外泌体转运这些生物活性分子，通过膜融合等方式将这些分子传递给靶细胞；从而扮演着细胞间传递重要信号的信使和载体的角色，调节其他细胞的生物学功能。越来越多的研究证实，外泌体与疾病的发生、发展甚至疾病的诊断和治疗有着密切的关系。因此，如何高效低成本的大量制备外泌体是外泌体研究面临的首要问题。目前，传统的制备外泌体的方法主要包括超速离心法、试剂盒沉淀法、尺寸排阻色谱法、超滤法等。超速离心法作为目前公认的常用的制备方法，通过差速离心，能够分离得到大小相近、纯度相对较高的囊泡颗粒；但需要收集大量的细胞培养上清液，离心过程比较费时，产率相对较低，重复操作可能对囊泡造成伤害，另外由于仪器昂贵使得该方法不能普遍适用。其他制备方法也存在着回收效率低下，杂蛋白污染导致纯度低等问题。因此，针对目前外泌体制备方法存在的效率低、成本高等问题，开发新的外泌体制备方法势在必行。技术实现要素：针对上述情况，为解决现有外泌体制备方法之缺陷，本发明之目的就是提供一种新的外泌体制备方法，该方法效率高、成本低，能够解决现有技术低效率、高成本的问题。具体来说，本发明采用的技术方案如下：一种高效低成本的外泌体制备方法，包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞在培养基中培养3-4天，使其汇合度达到90%-95%，胰蛋白酶消化、收集细胞悬液，pbs清洗细胞，最后加入适量pbs溶液；将细胞悬液置于合适的离心管中，然后将离心管固定于冰水混合物中，使用超声破碎仪进行细胞超声破碎；将细胞破碎液于4℃条件下差速离心，最后使用滤器过滤上清液，得到工程化外泌体（engineeredexosomes，eexos）。进一步，收集细胞悬液后，4℃、1200r/min离心5min，弃去上清液；用pbs洗涤细胞2次，最后加入适量pbs溶液，调整细胞悬液的浓度为1×107/ml。进一步，根据细胞悬液体积选择相应的超声破碎仪变幅杆尺寸。进一步，根据超声破碎仪变幅杆尺寸，将细胞悬液置于合适的离心管中。进一步，将离心管固定于冰水混合物中，使离心管中细胞悬液的液面低于冰水混合物的液面。进一步，将超声破碎仪变幅杆置于细胞悬液液面下1-3cm，设置超声功率20-40%，超声时间1-3s，间隔时间1-3s，超声总时间1-5min。进一步，对细胞破碎液进行离心的具体步骤为：收集细胞破碎液，进行差速离心，分别去除未破碎细胞和细胞碎片；然后滤器过滤上清液，除去大粒径囊泡和细菌等。进一步在差速离心中，初始离心的离心转速为200-400g，所述离心时间为5-10min；二次离心的离心转速为16000-17000g，所述离心时间为15-30min。进一步，使用0.45um滤器过滤上清液，以除去大粒径囊泡和细菌等。本发明的有益效果是：本发明的制备方法操作简便、高效、低成本，是对外泌体制备方法上的创新。附图说明图1是本发明方法的原理图；图2至5是eexos的表征分析；图6至7是eexos提高人成纤维细胞的增殖活性的实验结果；图8至10是eexos能提高人成纤维细胞的迁移能力的实验结果；图11至12是小鼠体内创面愈合实验的结果；图13是h&e和masson染色的实验结果。具体实施方式以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。实施例1超声破碎条件优化将人脐带间充质干细胞稀释为1×106cell/ml用来优化超声破碎功率和超声总时间等条件。考虑到变幅杆所承受功率范围，我们将最大功率设定为40%。分别在20%、30%、40%功率条件下超声时间为1min后，通过离心、过滤等步骤，对获得产物进行了蛋白浓度、囊泡数量和囊泡粒径等分析，结果如表1所示。表1：不同超声功率条件下eexos的特征分析振幅蛋白浓度(μg/ml)eexos平均数量峰值浓度(nm)20%88.7±2.69.4×109±1.2×10813330%86.8±10.61.1×1010±4.7×10812840%91.9±5.41.6×1010±5.9×108106分析发现，不同功率条件下各组蛋白浓度差别不大，我们推测在40%功率条件下，细胞质蛋白和细胞膜蛋白未能有效包裹在eexos中。因此，我们选择20%功率进行进一步的超声时间（1min、3min、5min）的优化，结果如表2所示。表2：不同超声时间条件下eexos的特征分析时间蛋白浓度(μg/ml)eexos平均数量峰值浓度(nm)1min88.7±2.69.4×109±1.2×1081333min102.7±16.81.7×1010±4.1×1081245min226.6±26.93.3×1010±6.5×10894通过对eexos的蛋白浓度、数量和粒径的综合分析，我们确定了超声1min产生的eexos有最高的蛋白包装效率。因此，我们选定20%超声功率和超声1min条件进行后续的eexos制备。实施例2eexos制备及表征分析将1×107cell/ml脐带间充质干细胞转入4mlep管，然后置于冰水混合物中，实施超声破碎，超声条件：变幅杆型号φ3，超声探头置于液面下1cm，功率20%，超声2s，间隔2s，总时间1min。细胞破碎液于4℃、300g离心5min，去除未破碎细胞，收集上清。然后4℃、16500g离心20min，去除死细胞和细胞碎片，收集上清。最后使用0.45um滤器过滤上清液，以除去大粒径囊泡、残留细胞碎片和细菌等，获得工程化外泌体，记为eexos，于-80℃冰箱保存。在透射电子显微镜下观察eexos的形态，可以看到100nm左右、呈茶托样的圆形或椭圆形膜型囊泡，与自然分泌外泌体（exos）无明显区别，如图2所示。经过滤膜过滤后，如图3、4所示，exos和eexos的粒径在50-500nm之间。westernblot分析显示eexos能够表达外泌体表面标志物（cd9、cd63和cd81），如图5所示。实施例3eexos体外功能实验将exos、eexos共培养的和空白对照组的人皮肤成纤维细胞以2×103/孔接种于96孔板中，完全培养基培养；24h后弃去原有培养基，无血清培养基清洗。加入含2%fbs的dmem培养基，按0h、24h、48h时间点对相同视野细胞进行拍照记录，分析结果可见，exos和eexos都能显著提高人皮肤成纤维细胞的增殖活性，如图6、7所示。划痕实验细胞处理方式同增殖实验相同，将细胞以2×104/孔接种于24孔板，待完全汇合后，吸弃原培养液，pbs清洗，1000tips划线，pbs清洗干净，加入含2%fbs的dmem培养基，显微镜拍照，记录初始宽度。48h后，对照组的划痕宽度为27.1±10.6%，而exos组和eexos组的划痕宽度分别为5.3±3.1%和2.7±1.3%；同时，transwell迁移实验在培养48h后，对照组、exos组和eexos组迁移细胞数目分别为75.7±3.1、109±7.3和128.3±10.1，exos组和eexos组迁移细胞数目分别增加了大约1.4倍和1.7倍，如图8、9、10所示。分析以上结果可以发现exos和eexos都能够促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移。实施例4eexos小鼠体内功能实验在小鼠全厚皮肤切除模型上进行了exos和eexos对创伤愈合作用的实验。在术后第14天，exos组和eexos组的创面愈合效率明显高于对照组，说明exos和eexos都具有促进创面愈合的功能，如图11、12所示。相对于未处理的对照组创面，h&e染色和masson染色显示exos和eexos处理后的创面具有较厚的新生表皮层和真皮层且在创面处有大量的成纤维细胞，如图13所示。以上实施例结果说明：超声破碎人脐带间充质干细胞可以高效、低成本获得工程化外泌体eexos。获得的eexos能够显著促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，体内实验同样证实了eexos能够促进小鼠的创面愈合过程。统计学分析统计数据以平均值±标准差的形式给出，两组比较采用t-test，0.01<p<0.05记为*，p<0.01记为**。上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属
技术领域：
普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。当前第1页12