一种降解氨氮的生香库德里阿兹威毕赤酵母菌与应用的制作方法

本发明属于工业微生物
技术领域：
，涉及一种降解氨氮的生香库德里阿兹威毕赤酵母菌与应用。
背景技术：
：氨氮废水中的氮元素以铵离子(nh4+)和游离氨(nh3)的形式存在于水中，无论是生活污水和垃圾渗滤液,还是钢铁、炼油、石油化工、玻璃制造、化肥、鞣革、饲料生产等工业生产都会产生大量的氨氮废水，其来源十分广泛，废水中氨氮的高耗氧量会导致水体富营养化，形成“水华”和“赤潮”破坏水体环境,对水生生物产生毒害作用，人类误食被污染的水产品会危及生命安全。近年来,氨氮排放导致的水体污染问题已引起国内外的广泛关注。随着水资源危机的加剧以及人们对氨氮废水更深入的认识,寻找经济高效的处理技术对氨氮废水进行综合治理成为亟待解决的问题。生物法作为污水处理工艺，因其具有占地面积少、处理能力强、受环境影响因素小等特点，生物法主要包括厌氧生物处理技术、好氧生物处理技术、自然生物处理技术。与其他处理方法相比，微生物降解有机物具有无可比拟优势。经物化处理开环断链后生成的小分子有机物，适合生物去除，能减少处理能耗，降低运行费用。生物法已经成为近年来用于处理畜禽养殖废水的主要技术。生香酵母又称为产酯酵母，是指产酯能力强的酵母菌总称,泛指一类在生长代谢过程中可生成以酯类为代表的多种香味成分或其前体物质的酵母菌，主要产乙酸乙酯,多属于产膜酵母,包括假丝酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、球拟酵母等。生香酵母是一类能代谢合成酯类物质为主，同时还能促进醇、醛、酚等挥发性风味物质产生的酵母菌(参考文献：彭东。高盐稀态酱醪中耐盐生香酵母的筛选及生香特性研究)。近年来因其产香的特殊生理学性质而被广泛应用于食品发酵相关的各个领域中，包括烟草香料、酱醋酿造、传统面食、果酒酱发酵、白酒酿造等风味导向型的产业，起到丰富香气，改善感官品质的作用，具备提升酒体感官品质的潜力。目前还没有报道过降解氨氮的生香库德里阿兹威毕赤酵母菌株。技术实现要素：有鉴于此，本发明目的是提供降解氨氮的菌株，不仅可以在食品发酵增加风味营养物质，也可以提高含氨氮废水生物法去除的效率，满足生物法降解氨氮的大规模工业化应用。一种降解氨氮的生香库德里阿兹威毕赤酵母菌，其分类命名为库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)hj2，于2020年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.19897。进一步的，所述菌株生长温度范围为15-48℃，生长ph范围为2.0-9.0，生长培养基氯化钠重量含量为0-9％。进一步的，所述菌株生长最适温度为37℃，生长最适ph为3.0～8.0。进一步的，所述菌种的发酵时间12-168小时。本发明提供的菌种可同化的碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、d-果糖、d-甘露醇、d-半乳糖、l-阿拉伯糖、d-山梨醇、木糖、甘油、可溶性淀粉，不可同化乳糖。本发明提供的菌种能够耐受重金属cr、cu、mn、co、ni、zn，分别对0-24ppm、0-640ppm、0-5494ppm、0-118ppm、0-295ppm、0-654ppm浓度的重金属环境具有极强耐受性。本发明提供的菌种12-168小时发酵葡萄糖所得的香味代谢产物种类数量为40-62％，香味物质含量为32.46-90.22％。所述香味代谢产物种类包括酯类、醛类、酮类、呋喃类、酸类、醇类，香气成分包括乙酸异戊酯、4-甲基苯甲醛、苯乙醇、异戊醛、乙酸苯乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、辛酸、(e)-3-癸烯酸、2,6-双(叔丁基)苯酚、1,2-苯二甲酸双(2-甲基丙基)酯、法尼醇、香豆素、吲哚、左旋，β-二氢-β-紫罗兰酮、亚麻酸、蛇麻烯、橙花叔醇、α-石竹烯。本发明第二个目的是利用筛选到的菌株作为发酵菌种用于食品发酵产香增加风味物质方面的应用。本发明的另一个目的是利用筛选到的菌株作为发酵菌种用于降解水体中氨氮的应用。所述水体初始氨氮浓度为50-600mg/l，水体经过菌种发酵24小时，氨氮降解效率为47.78％-88％。本发明的有益效果：本发明所提供的库德里阿兹威毕赤酵母菌株稳定，生长速度较快，安全，培养条件简单。本发明所提供的库德里阿兹威毕赤酵母菌株已完成全基因组，为研究库德里阿兹威毕赤酵母来源的降解氨氮原理奠定基础。本发明提供的库德里阿兹威毕赤酵母菌株长时间发酵产香，为产香酵母的工业应用奠定基础。本发明所提供的库德里阿兹威毕赤酵母是首次报道的处理含氨氮废水的库德里阿兹威毕赤酵母菌株。本发明所提供的库德里阿兹威毕赤酵母可利用氨氮为唯一氮源，处理含氨氮废水。本发明所提供的库德里阿兹威毕赤酵母可利用有机质，耐盐，耐重金属，并能够适应广泛的ph范围，扩大了处理含氨氮废水的环境条件。利用本发明菌种处理含氨氮废水，生产工艺环保，操作简单，无二次污染，很适合工业大规模生产。附图说明图1为库德里阿兹威毕赤酵母hj2在ypd琼脂培养基上的菌落形态图；图2为库德里阿兹威毕赤酵母hj2在光学显微镜下的细胞形态图；图3为库德里阿兹威毕赤酵母hj2在电子显微镜下的细胞形态图；图4为库德里阿兹威毕赤酵母hj2降解氨氮平板图；图5为库德里阿兹威毕赤酵母hj2生理生化特征图，其中图5-a为不同盐度条件下菌株生长效果图，图5-b为不同ph条件下菌株生长效果图，图5-c为不同培养温度下，菌株生长效果图，图5-d为不同重金属浓度条件下菌株生长效果图；图6为库德里阿兹威毕赤酵母hj2菌株的挥发性香味代谢物种类分析图；图7为库德里阿兹威毕赤酵母hj2菌株的全基因组图谱。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中，下述实施例中采用的培养基：ypd培养基：1％yeastextract(酵母膏)，2％peptone(蛋白胨)，2％dextrose(glucose)(葡萄糖)。固体ypd培养基加入琼脂1.5-2％。115℃灭菌15分钟。无碳培养基：(nh4)2so40.1％，k2hpo40.7％，kh2po40.3％，柠檬酸三钠0.05％，mgso4·7h2o0.01％。盐度培养基：ypd培养基中，加入氯化钠，分别配置成氯化钠浓度为0-9％的盐度培养基。碳源同化培养基：无碳培养基中加入唯一碳源至终浓度为2％。碳源分别为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、d-果糖、d-甘露醇、d-半乳糖、l-阿拉伯糖、d-山梨醇、木糖、甘油、可溶性淀粉、乳糖，115℃灭菌15分钟。重金属离子耐受培养基：ypd液体培养基中，分别加入重金属离子溶液至浓度分别为0、0.1、0.5、1、3、5、10、25、50和100mmol/l，调节ph为3.5。氨氮降解平板：葡萄糖0.5％，(nh4)2so40.025％，nacl0.1％，k2hpo4·2h2o0.05％，mgso4·7h2o0.025％，琼脂2％。产香发酵培养基：碳源(葡萄糖)2％，nacl0.05％，(nh4)2so40.2％，k2hpo40.05％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.02％，115℃灭菌15分钟。实施例1库德里阿兹威毕赤酵母hj2分离和鉴定(1)从广西省北海市红树林土壤沉积物中进行采样，将样品用无菌水溶解后，37℃摇床震荡培养24小时，用无菌蒸馏水梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分别取10-2～10-5的稀释菌液100μl分别涂布到ypd固体培养基中，于37℃培养2～3天，挑取乳白色，微凸，湿润，边缘不规整，圆形或椭圆形，表面粗糙的单菌落进行平板划线2～3次得到单菌落。(2)活化库德里阿兹威毕赤酵母hj2把从-80℃取出的菌株接种划线于ypd固体培养基中，置于37℃恒温培养48小时；(3)库德里阿兹威毕赤酵母hj2进行全基因组测序。将库德里阿兹威毕赤酵母hj2送南宁普斐生物科技股份有限公司进行全基因组测序。全基因组测序reads总数为343,523条；碱基总数1,109,084,396条；模糊碱基的比例为0.001％，总碱基的gc百分含量为39.0％；三代测序结果其测序的序列长度大，没有不确定碱基。基因组序列拼接后序列的总长度10,911,289bp,gc百分含量为38.16％；ncrna的预测共有trna和rrna两大类；cazy分析糖苷水解酶类的基因有36条，糖基转移酶类的基因有47条，碳水化合物酯酶类的基因有6条，辅助活性酶类基因有7条，不含多糖裂解酶类基因。如表1-2所示。表1全基因组测序结果分析projectdetailprojectdetailscaffoldtotal(mb)10.91trnas206contigtotal(mb)10.91rrnas20scaffolds19repeatssize(bp)65contigs19genome％gc69.2％scaffoldn50(mb)1.36totalgenes5087contig50(kb)1364表2cazy分析结果统计(4)库德里阿兹威毕赤酵母hj2分子生物学鉴定用分离纯化得到的hj2菌株的dna为目的片段，采用真菌通用引物去扩增26srdna基因，引物如下：nl1：5’-gcatatcaatagcggaggaaaag-3’nl4：5’-ggtccgtgtttcaagacgg-3’扩增26srrna，将其送至上海生工进行测序，测序得到的序列去除两端引物，得到601bp的序列，在nbci上对该组序列进行blast对比，筛选同源性较高的序列，结果表明它与库德里阿兹威毕赤酵母菌(pichiakudriavzevi)26srdna序列同源性较高(99％以上)。(5)库德里阿兹威毕赤酵母hj2形态特征观察库德里阿兹威毕赤酵母hj2于ypd固体培养基中，37℃恒温培养48小时，观察其乳白色，微凸，湿润，边缘不规整，圆形或椭圆形，表面粗糙，生长速度较快，如图1所示。挑取单菌落于载玻片上，滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，先低倍镜观察，后使用100倍镜观察其菌体特征，该菌体细胞呈卵圆，一端出芽生殖。如图2所示，电子显微镜下观察该菌体的形态，如图3所示。(6)库德里阿兹威毕赤酵母hj2生理生化特征鉴定1)制备种子液：挑取活化的单菌落于ypd液体培养基中，37℃、200转/分钟培养12小时。2)不同盐度条件培养：以盐度培养基质量体积百分比的2％为接种量，37℃，200转/分钟培养24小时，可在0-9％条件下生长，如图5(a)所示。3)不同ph条件培养：以hcl溶液和naoh溶液为缓冲液，分别调节液体ypd培养基ph至1.5、3.0、7.0、9.0，以ypd液体培养基质量体积百分比的2％为接种量，37℃，200转/分钟培养24小时，ph生长范围ph2.0-9.0，如图5(b)所示。4)不同温度条件培养：以ypd液体培养基质量体积百分比的2％为接种量，分别于15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、45℃、48℃、50℃、55℃，200转/分钟培养24小时，最适生长温度30-37℃，如图5(c)所示。5)碳源同化实验：以碳源同化培养基质量体积百分比的2％为接种量，37℃，200转/分钟培养12小时，结果如下表3：表3碳源同化情况碳源结果碳源结果碳源结果葡萄糖+d-甘露醇+木糖+蔗糖+d-半乳糖+乳糖-麦芽糖+l-阿拉伯糖+可溶性淀粉+d-果糖+d-山梨醇+甘油++表示可同化碳源，–表示不可同化碳源。6)重金属离子耐受培养：以重金属离子耐受培养基质量体积百分比的2％为接种量，37℃，200转/分钟培养24小时，可在ph3.5重金属(cr、cu、mn、co、ni、zn)环境下生长，分别对24ppm、640ppm、5494ppm、118ppm、295ppm、654ppm浓度的重金属环境具有极强耐受性，如表4、图5(d)所示。表4hj2重金属耐受情况与污水综合排放标准种类gb25467-2012污水综合排放标准hj2生长的离子浓度cr0.1ppm24ppmcu2ppm640ppmmn5ppm5494ppmco-118ppmni1ppm295ppmzn5ppm654ppm7)降解氨氮鉴定：活化的库德里阿兹威毕赤酵母hj2单菌落接种在氨氮降解平板中；在37℃恒温培养24小时。观察到有菌落长出，即库德里阿兹威毕赤酵母hj2可以降解氨氮，如图4所示。结合以上分子生物学、菌株形态以及其生理生化特性，菌株鉴定为pichiakudriavzevi菌属的一个菌株，即库德里阿兹威毕赤酵母菌(pichiakudriavzevi)hj2，2020年06月01日将其保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.19897。实施例2顶空气相色谱法检测挥发性香味物质(1)发酵风味确定以ypd培养基、葡萄糖培养基(产香发酵培养基)，取体积百分比的2％为接种量，37℃，200转/分钟，培养12小时、1天、3天、5天、7天，嗅闻液体发酵液的风味，液体发酵液具有甜香、果酸等特殊香味。(2)特殊香味代谢产物检测用ypd培养基、葡萄糖培养基分别对库德里阿兹威毕赤酵母菌hj2发酵12小时、1天、3天、5天、7天的样品进行处理，采用顶空气相色谱仪进行分析。gc条件：db－5ms型弹性石英毛细色谱柱sh-rxi-5silms色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)进行分离；程序升温条件为起始温度40℃，以3℃/分钟升温至120℃，保持2分钟；以10℃/分钟升温至250℃，保持3分钟；以15℃/分钟升温至300℃；保持2分钟。载气为高纯氦气(1.0ml/分钟)，不分流进样。ms条件：质谱采用电子轰击电离源；电子能量70ev；离子源温度230℃；扫描范围35～350m/z。检测到发酵葡萄糖培养基12小时、1天、3天、5天、7天所得的特殊香味代谢产物种类数量分别为55.32％、62.00％、40.86％、50.71％、46.15％，特殊香味代谢产物含量分别为32.46％、60.35％、68.27％、62.07％、90.22％。所述香味代谢产物种类为酯类、醛类、酮类、呋喃类、酸类、醇类，主要的香气成分为乙酸异戊酯、4-甲基苯甲醛、苯乙醇、异戊醛、乙酸苯乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、辛酸、(e)-3-癸烯酸、2,6-双(叔丁基)苯酚、1,2-苯二甲酸双(2-甲基丙基)酯、法尼醇、香豆素、吲哚、左旋，β-二氢-β-紫罗兰酮、亚麻酸、蛇麻烯、橙花叔醇、α-石竹烯等。如表5、表6、图6所示。表5特殊香味物质分析培养时间特殊香味物质种类特殊香味物质含量12小时55.32％32.46％1天62.00％60.35％3天40.86％68.27％5天50.71％62.07％7天46.15％90.22％表6发酵ypd培养基主要特殊香气成分实施例5水杨酸比色法测定氨氮降解效率(1)氨氮培养基配制培养基：葡萄糖20g,硫酸铵0.25g,氯化钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水和硫酸镁0.25g，微量元素溶液1ml，蒸馏水1l。取100ml配制溶液分装于250ml锥形瓶中，115℃灭菌15分钟，未接种的氨氮培养基中氨氮含量为50mg/l。微量元素溶液：edta10.0g，硫酸锌1.2g，氯化钙1.5g，四水合氯化锰1.0g，硫酸亚铁2.0g,钼酸胺1.0g，五水和硫酸铜1.0g，氯化钴1.0g，蒸馏水1lph7.2-7.4。此培养基初始氨氮浓度为50mg/l,按比例调整硫酸铵含量，使培养基初始氨氮浓度依次为50mg/l、150mg/l、300mg/l、400mg/l、600mg/l。(2)加入2％种子液(对数期)37℃200转/分钟摇床培养24小时。取24小时的发酵液，12000转/分钟离心10分钟，测定上清液中氨氮含量，并计算氨氮降解效率。(3)供试的库德里阿兹威氏酵母菌对它进行发酵并测定对氨氮的同化率。测定结果表明，由表7所示，库德里阿兹威氏酵母菌hj2对于氨氮的同化效率24小时内，可以达到47.78％-88％。表7氨氮同化率测定结果(4)数据库对比将hj2全基因组序列在有关氮循环的数据库(ncycdb)里面进行比较。谷氨酸脱氢酶(gdh)被比对到2条基因，占所有被比对到氮循环基因的3.90％；谷氨酸合成酶(gs)被比对到9条基因，占所有被比对到氮循环基因的17.65％；谷氨酰胺合成酶(glna)被比对到8条基因，占所有被比对到氮循环基因的15.70％。hj2对氨的同化作用主要是依靠谷氨酸脱氢酶(gdh)和谷氨酰胺合成酶(gs)的联合作用，谷氨酸脱氢酶是通过nad或nadp辅助因子，催化谷氨酸氧化脱氨基转变成α-同戊二酸，此过程产物为氨(参考文献：何玉英。氨氮胁迫下中国明对虾(fenneropenaeuschinensis)谷氨酸脱氢酶基因的表达分析)。谷氨酰胺合成酶通过将微生物内过多的氨和谷氨酸转换成谷氨酰胺,来降低体内氨氮的浓度(参考文献：陈劲松。斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响)。由此可以进一步确证hj2具备良好的降解氨氮的功能。结论：由实施例看出本发明菌种可以将之运用于高浓度氨氮水体处理等，有效治理污水，不产生后续污染，速度快，环保可持续，具有显著经济效益。序列表<110>广西大学<120>一种降解氨氮的生香库德里阿兹威毕赤酵母菌与应用<130>gzhx<141>2020-09-07<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>601<212>dna<213>库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)<400>1tatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcg60gcaagagctcagatttgaaatcgtgctttgcggcacgagttgtagattgcaggttggagt120ctgtgtggaaggcggtgtccaagtcccttggaacagggcgcccaggagggtgagagcccc180gtgggatgccggcggaagcagtgaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcag240ctccaagcgggtggtaaattccatctaaggctaaatactggcgagagaccgatagcgaac300aagtactgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaat360tgttgaaagggaagggtattgcgcccgacatggggattgcgcaccgctgcctctcgtggg420cggcgctctgggctttccctgggccagcatcggttcttgctgcaggagaaggggttctgg480aacgtggctcttcggagtgttatagccagggccagatgctgcgtgcggggaccgaggact540gcggccgtgtaggtcacggatgctggcagaacggcgcaacaccgcccgtcttgaaccacg600g601<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcatatcaatagcggaggaaaag23<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggtccgtgtttcaagacgg19当前第1页12